Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Условно-патогенные микроорганизмы и их патогенный потенциал 15
1.2. Условно-патогенные энтеробактерии в инфекционной патологии человека, в т.ч. в этиологической структуре острых кишечных инфекций 29
1.3. Условно-патогенные энтеробактерии в микробных сообществах водных экосистем и их биологические свойства 38
1.4. Молекулярно-генетическая характеристика условно патогенных энтеробактерии 44
1.5. Антибиотикоустойчивость как одно из важнейших свойств условно-патогенных микроорганизмов 53
1.6. Адаптационный потенциал условно-патогенных энтеробактерии 60
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования (эпидемиологические, микробиологические, молекулярно-генетические, статистические) 66
ГЛАВА 3. Эпидемиологический анализ заболеваемости острыми кишечными инфекциями, в.т.ч. вызванными условно-патогенными энтеробактериями, в Иркутской области и г. Иркутске. Спектр микроорганизмов, выделяемых при ОКИ. 80
ГЛАВА 4. Условно-патогенные энтеробактерии в микробных сообществах водных экосистем Восточной Сибири, доминирующие популяции, значимость в оценке трансформации микробных сообществ 100
ГЛАВА 5. Биологическая активность условно-патогенных энтеробактерии 119
5.1. Фенотипические проявления условно-патогенных представителей семейста Enterobacteriaceae, выделенных из фекалий больных острыми кишечными инфекциями 119
5.2. Биологическая активность УПЭ водных экосистем 128
ГЛАВА 6. Антибиотикорезистентность условно-патогенных микроорганизмов 140
6.1. Антибиотикорезистентность условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из фекалий больных ОКИ 141
6.2. Антибиотикорезистентность водных изолятов условно- патогенных энтеробактерий 149
ГЛАВА 7. Результаты выявления у условно-патогенных энтеробактерий генетических маркеров «островов» патогенности 184
ГЛАВА 8. Клинико - эпидемиологические аспекты острых кишечных инфекций, сопровождающихся выделением условно-патогенных энтеробактерий 199
ГЛАВА 9. Адаптационный потенциал условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных и из водных объектов (вариабельность ферментативной активности, способность к формированию биопленок). 210
ГЛАВА 10. Обсуждение результатов исследований 228
Выводы 263
Практические рекомендации 265
Список использованной литературы 267
- Условно-патогенные энтеробактерии в инфекционной патологии человека, в т.ч. в этиологической структуре острых кишечных инфекций
- Антибиотикоустойчивость как одно из важнейших свойств условно-патогенных микроорганизмов
- Фенотипические проявления условно-патогенных представителей семейста Enterobacteriaceae, выделенных из фекалий больных острыми кишечными инфекциями
- Антибиотикорезистентность условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из фекалий больных ОКИ
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время во всех странах мира наблюдается активизация условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) (Бондаренко В.М., 2011). Бактерии данной группы характеризуются выраженной неоднородностью, являясь, с одной стороны, представителями транзиторной нормальной микрофлоры человек, а с другой,- возбудителями инфекционных заболеваний (Марри П.Р. с соавт., 2006; Егорова, 2007; Бондаренко В.М., 2011). В связи с этим, проблеме инфекций, обусловленных УПМ, особенно представителями семейства Enterobacteriaceae, уделяется пристальное внимание (Ахтариева А.А., 2010). К числу наиболее распространенных инфекционных заболеваний относятся острые кишечные инфекции (ОКИ), занимающие одно из ведущих мест в инфекционной патологии детского возраста (Воротынцева Н.В. соавт., 2001; Жеребцова Н.Ю. с соавт., 2007; Денисюк Н.Б., 2011; Хворостухина А.И., 2011; Калуцкий П.В., 2011). Доля ОКИ, вызванных условно-патогенными энтеробактериями (УПЭ), в общей структуре ОКИ установленной этиологии, по данным разных авторов, варьирует от 12,8-21,2% до 34,1% (Зуева Л.П., 2005; Жеребцова Н.Ю., 2006).
Как отмечают А.Р. Мавзютов с соавт. (2001), С.В.Егорова (2008), В.М. Бондаренко (2011), для оценки этиологической значимости УПЭ при инфекционных процессах необходимо заключение об их патогенном потенциале, который недостаточно учитывается при верификации острых кишечных инфекций. Кроме того, масштабы изменения патогенности условно-патогенных энтеробактерий, являющиеся одной из причин увеличения их медицинской значимости, свидетельствуют о целесообразности изучения этого явления у данной группы бактерий, как на фенотипическом, так и на молекулярно-генетическом уровне (Мавзютов А.Р. с соавт., 2002; Фиалкина С.В., 2004; Жеребцова Н.Ю., 2006; Вершинин А.Е., 2008; Бондаренко В.М., 2011; Burgos Y. et al., 2010). В то же время, патогенность и региональные особенности возбудителей острых кишечных инфекций, обусловленных УПЭ, до сих пор изучены недостаточно.
Одним из важнейших аспектов фенотипической характеристики условно-патогенных энтеробактерий является их резистентность к антимикробным препаратам (АМП) (Страчунский Л.С., 2002; Cкала Л.З. с соавт., 2004; Tenover F.C., 2005). При этом, как отмечает А.Е. Билев (2011), массовое распространение антибиотикорезистентных штаммов в популяциях условно-патогенных микроорганизмов стало важной проблемой клинической медицины, в связи с их более высокими адаптационными возможностями по сравнению с возбудителями классических инфекций.
На фоне информации о роли условно-патогенных микроорганизмов в инфекционной патологии человека недостаточно изученной остается проблема их циркуляции в природных, в частности, водных экосистемах. Между тем, адаптивные возможности бактерий данной группы и, соответственно, их потенциальные местообитания, экологические ниши, механизмы и формы существования в природе необычайно широки и многообразны (Бухарин О.В., 1997). Особое значение имеет изучение циркуляции бактерий данной группы в водных объектах, оказывающих существенное влияние на жизнедеятельность человеческой популяции (Мамонтова с соавт., 2000). Условно-патогенные микроорганизмы способны не только длительно обитать в субстратах внешней среды, в частности, в воде, но и накапливаться в ней. Выживанию и накоплению микроорганизмов в объектах внешней среды, в т.ч. в воде, способствуют факторы персистенции (Макаров В.Ю., 2007). Также у водных штаммов УПЭ выявлены адгезивная и гемолитическая активность, описаны ферменты ДНКаза, гиалуронидаза, некоторые протеиназы (Кравченко О.С., 2009; Езепчук Ю.В., 1997; Kielleberg S.,1985), резистентность к антимикробным препаратам (Загайнова А.В., 2010). Усиливающееся антропогенное воздействие на водные экосистемы определяет необходимость изучения биологических свойств УПЭ с позиций оценки их потенциальной эпидемической опасности и влияния на состояние микробиоценозов природных водоемов. В рамках изучения биологической активности УПЭ важное значение имеет выявление их адаптационных возможностей, способствующих выживанию в различных условиях среды обитания.
Исходя из вышеизложенного целью работы является: выявить доминирующие популяции, фенотипические и генотипические характеристики, адаптационный потенциал условно-патогенных энтеробактерий на моделях острых кишечных инфекций и водных экосистем для оценки их медико-экологической значимости.
Для выполнения указанной цели поставлены следующие задачи:
1. Изучить спектр условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при острых кишечных инфекциях установленной этиологии, у детей Иркутской области.
2. Изучить циркуляцию бактерий данной группы в микробных сообществах водных экосистем на модели крупнейших водоемов Восточной Сибири, их таксономическую характеристику, выявить доминирующие и субдоминирующие популяции, видовое разнообразие.
3. Определить фенотипические характеристики условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ, а также из водных объектов.
4. Выявить и оценить частоту встречаемости у микроорганизмов генетических детерминант патогенности.
5. Оценить резистентность к антимикробным препаратам условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ и из водных объектов.
6. Провести анализ клинических аспектов острых кишечных инфекций, обусловленных бактериями семейства Enterobacteriaceae, их сопряженность с наличием генетических детерминант патогенности микроорганизмов.
7. Изучить адаптационный потенциал клинических и водных штаммов энтеробактерий в различных условиях существования (количественная оценка ферментативной активности, способность к образованию биопленок).
Научная новизна и теоретическая значимость работы
Определен таксономический спектр условно-патогенных энтеробактерий, выделяемых при ОКИ, у детей Иркутской области, его смена в многолетнем аспекте, выявлены субдоминирующие популяции, изучены патогенные свойства, дана оценка влияния факторов патогенности на клинико-эпидемиологические особенности острых кишечных инфекций.
Полученные данные о фенотипических маркерах условно-патогенных энтеробактерий вносят вклад в изучение патогенности бактерий данной группы, их участия на различных этапах инфекционного процесса.
Определены генетические маркеры УПЭ, информативные при оценке их этиологической значимости при ОКИ (hlyA, hlyB, sfaA, sfaG, fimA, irp-2). Показаны различия в частоте встречаемости генов патогенности у различных видов представителей семейства Enterobacteriаceae.
Показана значимость условно-патогенных энтеробактерий, их биологической активности, персистентного потенциала, распространенности генетических маркеров патогенности среди водных изолятов для оценки потенциальной опасности водной среды.
Получены данные об адаптационных возможностях УПЭ (вариабельность ферментативного аппарата УПЭ, способность к формированию биопленочных сообществ), что позволяет внести вклад в решение проблемы по изучению их адаптации к различным условиям обитания.
Практическая значимость
Определены основные виды условно-патогенных представителей семейства Enterobacteriаceae в структуре ОКИ и маркеры их патогенности, существенно важные с клинической точки зрения.
Данные, полученные при определении фенотипических и генотипических факторов патогенности бактерий указанной группы, вносят вклад в оценку их этиологической и эпидемиологической значимости.
Мониторинг антибиотикоустойчивости УПЭ позволяет создать паспорт резистентности возбудителей ОКИ и бактерий, выделенных из водных экосистем.
Разработанный способ определения гетерогенности микробных популяций по показателю антибиотикорезистентности УПЭ позволяет проводить оценку их потенциальной опасности и расширить возможности биотестирования водных экосистем.
Данные по изучению микробиоценозов крупнейших водоемов Восточной Сибири могут быть использованы в качестве базовой информации для мониторирования водных экосистем.
Внедрения. Материалы исследований используются в практике работы ТУ Федеральной службы в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Республике Саха (Якутия) для целей микробиологического мониторинга поверхностных водоемов; в практике работы Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Иркутской области для целей эпидемиологического надзора за острыми кишечными инфекциями; внедрены в учебный процесс на кафедре эпидемиологии и микробиологии ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» (акт внедрения №16 от 22.10.2011). Результаты исследований использованы при издании учебных пособий для врачей: «Микробиологический мониторинг водных экосистем» (2008); «Техногенное загрязнение окружающей среды и инфекционная патология (клинико-эпидемиологические обобщения)» (2008); «Проявление инфекционной патологии в условиях техногенного загрязнения окружающей среды» (учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей, утввержденный УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России (УМО -17-28/78 от 26.02.2010), методических рекомендаций для врачей «Выявление факторов риска в эпидемиологическом анализе» (2011).
По результатам исследований получены Свидетельства Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам (РОСПАТЕНТ) о гос. регистр. БД № 2010620379 от 14.07.2010г. «Биопрофиль условно-патогенных энтеробактерий - возбудителей острых кишечных инфекций у детей»; № 2010620552 от 24.09.2010г. «Таксономическая характеристика и биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов водных экосистем»; № 2011620192 от 11.03.2011г. «Клинико-эпидемиологические особенности острых кишечных инфекций, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами»; № 2011620513 от 13.07.2011г. «Антибиотикоустойчивость аутохтонных и аллохтонных представителей микробного сообщества водных экосистем».
Положения, выносимые на защиту:
-
Основными представителями условно-патогенных энтеробактерий в структуре бактериальных ОКИ установленной этиологии являются бактерии родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella и Citrobacter (класс субдоминант). Данные виды энтеробактерий (а также E.coli) преобладают (с изменением степени доминирования) и в таксономическом спектре грамотрицательной составляющей микробиоценозов водных экосистем.
2. Условно-патогенные бактерии семейства Enterobacteriaceae характеризуются выраженной фенотипической и генотипической гетерогенностью, что необходимо учитывать при оценке их этиологической и эпидемиологической значимости.
3. Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные от больных ОКИ, несут генетические маркеры патогенности, детерминирующие важные этапы взаимодействия возбудителя с клетками организма хозяина: адгезию, продукцию гемолизинов, размножение в тканях (hlyА, hlyВ, sfaA, sfaG, fimA, irp-2). Наличие у клинических штаммов энтеробактерий генетических детерминант патогенности сопряжено с утяжелением клинической картины заболевания.
4. Распространенность условно-патогенных энтеробактерий, их таксономическая характеристика, степень доминирования, биологическая активность, персистентный потенциал, наличие генетических маркеров патогенности, антибиотикоустойчивость являются индикаторами степени потенциальной опасности водных микробиоценозов.
5. Условно-патогенные бактерии семейства Enterobacteriaceae (клинические и водные изоляты) характеризуются адаптационным потенциалом, отражающимся качественными и количественными проявлениями ферментативной активности, а также способностью к формированию биопленочных сообществ.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были представлены на: Российской научно-практ. конференции, посвящ. 100-летию профессора Е.В. Талалаева «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» (Иркутск, 2002); Межрегиональной научно-практ. конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); научно-практической конференции «Здоровье населения Иркутской области: проблемы и пути решения» (Иркутск, 2003); I межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями» (Иркутск, 2006); научно-практ. конференции «Оценка эколого-экономической ситуации загрязнения водных экосистем в бассейне оз. Байкал и управление экологическим риском» (Иркутск, 2006); научно-практ. конференции «Среда обитания человека и санитарно-эпидемиологическое благополучие населения» (Улан-Удэ, 2006, Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по республике Бурятия); III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); Всероссийской научно-практ. конференции «Здоровая семья- здоровый ребенок», посв. 20-летию образования Института педиатрии и репродукции человека СО РАМН (Иркутск, 2009); Всероссийском пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ (Москва, 2009, ГУ НИИ ЭЧ И ГОС им. А.Н.Сысина РАМН); научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (к 90-летию кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Иркутского государственного медицинского университета) (Иркутск, 2010); региональной научно-практ. конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Иркутск, 2010); III межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями» (Иркутск, 2010); международной конференции «Проблемы экологии». Чтения памяти профессора М.М. Кожова (Иркутск, 2010); II Международной научно-практ. конференции «Экология, здоровье, спорт» (Чита, 2010); международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ, 2011); всероссийской научно-практ. конференции с междунар. участием «Окружающая среда и здоровье населения» (г. Иркутск, 2011); всероссийской научно-практ. конференции с междунар. участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (Москва, 2011); Пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды «Актуализированные проблемы здоровья человека и среды его обитания и пути их решения» (Москва, 2011).
Публикации
Основные положения диссертационной работы нашли отражение в 58 научных публикациях, в т. ч. в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций - 21, монографиях - 2, пособиях для врачей - 3, из них утвержденных УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России - 1, методических рекомендациях для врачей-1, базах данных, получивших Свидетельства РОСПАТЕНТа – 4.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, отраженных в 7 главах, главы обсуждения полученных материалов, выводов, списка использованных источников литературы. Работа изложена на 302 страницах, иллюстрирована 112 рисунками и 25 таблицами. Список литературы содержит 398 работ, из них 295 отечественных и 103 зарубежных авторов.
Условно-патогенные энтеробактерии в инфекционной патологии человека, в т.ч. в этиологической структуре острых кишечных инфекций
Как отмечает В.П. Сергиев с соавт. (2006), в начале XXI века инфекционные болезни продолжают наносить значительный ущерб человечеству. Инфекционные болезни не только не собираются уступать свои позиции, а наоборот, перешли в наступление. Биологическая гроза, связанная с инфекционными болезнями и их возбудителями, нависла над всей планетой (Сергиев В.П. с соавт., 2006). И в XXI веке инфекционная патология остается наиболее частой причиной смерти. Так, среди 51 млн. человек, умирающих в мире в течение одного года, 17,3 млн. умирают от болезней, вызванных живыми возбудителями (Life..., 1998). Суммарный ущерб здоровью, причиняемый инфекциями, значительно больше такового от неинфекционной патологии и травм (Инвестиции в здравоохранении..., 1993).
Рассматривая проблему инфекционной заболеваемости на современном этапе, следует отметить, что в настоящее время в инфекционной патологии наблюдается рост инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, что, по мнению О.В. Бухарина с соавт. (1997), находит объяснение с различных позиций - микробиологической, иммунологической, эпидемиологической, экологической. В.М. Бондаренко (2000; 2011), S.R. Weyant et al (1999) также указывают, что в последние годы наблюдается изменение этиологической структуры инфекционной заболеваемости в сторону расширения спектра острых и хронических заболеваний, вызванных условно-патогенными бактериями. В настоящее время проблеме инфекционных заболеваний, вызванных УПМ, уделяется пристальное внимание (Ахтариева А.А., 2010). Фиалкина СВ. (2004) отмечает, что значительное изменение структуры инфекционной заболеваемости, наблюдаемое в настоящее время, связано с активизацией условно-патогенных бактерий. При этом, как отмечает А.И. Речкин с соавт. (2007), инфекции вызываемые представителями семейства Enterohacteriaceae, занимают в группе условно-патогенных микроорганизмов одно из главенствующих мест, а А.И. Бочков (2002) подчеркивает, что условно-патогенные микроорганизмы могут вызывать патологические процессы различной локализации, в том числе, острые кишечные инфекции (Фиалкина СВ., 2004)..
Острые кишечные инфекции и до настоящего времени не теряют своей актуальности в связи с частотой распространения, тяжестью течения и огромным экономическим ущербом (Итоги и перспективы..., 2009) и относятся к числу наиболее распространенных инфекционных заболеваний, уступая в этом лишь острым респираторным заболеваниям (Диагностика..., 2003; Воробьев А.А. с соавт., 2000; Калмыкова А.И., 2001), а в инфекционной патологии детского возраста острые кишечные инфекции занимают ведущее место (Воротынцева Н.В. соавт., 2001; Жеребцова Н.Ю. с соавт., 2007; Ныркова О.И., 2009; Денисюк Н.Б., 2011; Хворостухина А.И., 2011; Байковская Ю.В. с соавт., 2011). Л.Д. Мартыненко (1996), П.В. Калуцкий с соавт. (2011) подчеркивают, что острые кишечные инфекции у детей были и остаются одной из актуальных проблем педиатрии.
По данным экспертов ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется более 1 млрд. случаев диарей (60—70% составляют дети в возрасте до 5 лет); умирает около 3 млн детей дошкольного возраста. Кроме того, данная группа заболеваний наносит большой экономический ущерб (Эпидемиологические особенности..., 2002). Как указывает Б.Я. Васильев с соавт. (2000), экономические затраты от ОКИ только в США составляют 1,5 млрд. в год. В России в 2006г. общее число случаев ОКИ (шигеллезов и ОКИ, вызванных установленными и неустановленными возбудителями) составило 621417 (Сергевнин В.И., 2008), в 2009г.- 695171 случаев. При этом на долю детского населения приходилось более 60% эпизодов инфекционной диареи. В.П.Сергиев (2006) отмечает, что более 80% ущерба от диарей приходится на детей в возрасте до 5 лет. В России в последние годы по заболеваемости на 100 тыс. населения ОКИ у детей занимают 4-е место в общей структуре инфекционных болезней. По данным U.D. Parashar et al. (2006), показатель детской смертности по причине диареи, несмотря на снижение, остается высоким - 2,1 млн. случаев в год за счет стран с низким уровнем дохода.
Н.Н. Филатов с соавт. (2007) указывает, что острые кишечные инфекции входят в перечень наиболее эпидемиологически значимых для здравоохранения Москвы нозологических форм инфекционных болезней, занимая второе место в структуре заболеваемости (без учета гриппа и ОРЗ). В структуре ОКИ у детей Нижнего Поволжья в 2003-2004гг. вирусные диареи составляли 35%, бактериальные, в.т. вызванные УПМ, - 23,8% (Клинико-эпидемиологические аспекты..., 2007).
Как указывает В.И. Сергевнин (2008), высокому уровню заболеваемости ОКИ в современных условиях способствуют такие социальные факторы, как интенсивная межгосударственная миграция населения, обмен продуктами питания и сырьем животного происхождения, интенсификация животноводства и птицеводства на промышленной основе, урбанизация, активизация рекреационных процессов, а также ухудшение экологической обстановки и происходящие вследствие этого негативные изменения в иммунном статусе человека.
В системе эпидемиологического надзора за острыми кишечными инфекциями важное значение принадлежит расшифровке их этиологической структуры, т.к., по мнению Е.П. Бернасовской (1984), только знание этиологического фактора может обеспечить целенаправленное проведение лечебных и профилактических мероприятий. Именно вид возбудителя определяет особенности клиники, характер и силу корреляционных связей между отдельными иммунологическими показателями (Фомин В.В. с соавт., 1989). Еще в сороковых годах XX вв. ученые отмечали, что до тех пор, пока причины болезни неизвестны, лечение эмпирично, а предупреждение научно не обосновано. Тем не менее, и в настоящее время доля ОКИ неустановленной этиологии в структуре острых кишечных инфекций продолжает оставаться значительной (О.А. Груздева с соавт., 2011). По данным O.K. Александровой с соавт. (2011), на долю ОКИ неустановленной этиологии приходится около 60%-70% (Проблемы острых кишечных инфекций..., 2011).
Известно, что развитие ОКИ обусловлено большой группой инфекционных агентов. Как отмечает В.И. Сергевнин (2008), возбудители ОКИ (бактерии, вирусы, простейшие) относятся, по крайней мере, к 17 семействам и 33 родам. Следует отметить, что в последние годы отмечается снижение заболеваемости дизентерией, брюшным тифом. Заболеваемость сальмонеллезом продолжает оставаться на достаточно высоком уровне (Рожнова С.Ш. с соавт., 2011), а в ряде регионов, отмечается рост заболеваемости сальмонеллезом, в т.ч. среди детей до 14 лет, (Эпидемиологические тенденции..., 2011; Особенности острых кишечных инфекций..., 2011). Кроме того, в настоящее время имеет место рост заболеваний, вызываемых вирусами. В.В. Краснов (2011) отмечает, что в детском возрасте большая часть случаев ОКИ вызывается различными вирусами, а роль бактериальных инфекционных агентов за последние годы заметно снизилась. Однако бактериальная этиология продолжает сохранять определенное значение в формировании клиники ОКИ. Продолжают регистрироваться десятки случаев шигеллезов, сальмонеллезов, реже эшерихиозов. Имеют место острые заболевания желудочно-кишечного тракта, обусловленные стафилококками, клебсиеллами, протеем, кампилобактериями, иерсиниями, синегнойной палочкой и др. (Краснов В.В., 2011).
Антибиотикоустойчивость как одно из важнейших свойств условно-патогенных микроорганизмов
В современных условиях проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов приобрела глобальный характер (Эпидемиологический мониторинг..., 2004). Известно, что антимикробные препараты представляют собой самую многочисленную группу лекарственных средств. По разным показаниям антибиотики получают от 25 до 35% всех госпитализированных пациентов (Строганов В.П., 1998). В России используется около 30 различных групп антибиотиков, а общее число антимикробных препаратов приближается к 200. Множественную устойчивость (резистентность) микроорганизмов к лекарственным препаратам относят к дополнительным факторам их патогенности (Крылов В.Н., 2003). Антибиотикорезистентность бактерий заставляет тратить огромные деньги на преодоление этого феномена, искать новые антибиотики, решать сложнейшие эпидемиологические задачи (Страчунский Л.С. с соавт., 2002; Поляк М.С, 2003г.).
В настоящее время резистентные и множественно резистентные формы встречаются практически у всех клинически значимых микробов (Страчунский Л.С, 2000; Яковлев В.П. с соавт., 2002: Богданов М.Б. с соавт., 2004). По мнению СВ. Сидоренко (1999), широкое распространение в некоторых регионах ванкомицинорезистентных энтерококков, снижение чувствительности метициллинорезистентных стафилококков к ванкомицину, появление грамотрицательных микроорганизмов, устойчивых практически ко всем доступным антибиотикам, может возвратить клинициста в доантибиотическую эру. Как указывает И.А. Бочков с соавт. (2009), формирование устойчивости к антимикробным препаратам наблюдается как у патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов. При этом массовое распространение лекарственной устойчивости в популяциях условно-патогенных бактерий стало важной проблемой клинической медицины, в связи с их более высокими адаптационными возможностями по сравнению с возбудителями классических инфекций (Билев А.Е. с соавт., 2011).
Начало изучению множества вариантов проявления резистентности к антимикробным препаратам положили сообщения E.Abraham et al. (1940) и W.Kirby (1944). В 70-х годах XX в. появились публикации о мультирезистентных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмах (O Brien T.F., 1986; Tenover F., 1991). В последние же годы отмечена группа микроорганизмов, резистентных ко всем известным антимикробным препаратам (Murray В., 1991; Neu Н., 1992). Особую тревогу вызывает способность грамотрицательных микроорганизмов продуцировать хромосомные В-лактамазы класса С и плазмидные В-лактамазы расширенного спектра А (Сидоренко СВ. соавт., 1998; Livermore D.M., 1995). По данным М.Н. Зубкова (2003), Н.Wisplinghoff et al. (2006), полирезистеные A.baumannii представляют новую угрозу, т.к. образно могут быть охарактеризованы как «грамотрицательные MRS А». Ко всем известным на сегодняшний день антибактериальным препаратам способны формировать устойчивость полирезистентные Pseudomonas aeruginosa (PDRPA) (Bergogne-Berezin E. et al., 1993; Инф. письмо МАКМАХ, 1997; Wang C.Y. et al., 2006), Как отмечает H.M Mattoes (2004), в связи с нарастающей резистентностью микроорганизмов к большинству классов антибиотиков все более актуально использование карбапенемов. Кроме того, в последние десятилетия резистентность продолжает распространяться не только среди внутрибольничных патогенов, но и среди микроорганизмов, заражение которыми происходит при обычных социальных контактах (Строганов В.П., 1998), а также в результате использования антимикробных препаратов в рыбном и сельском хозяйстве (Падейская Е.Н., 2005; Tenover F., 2005). Известно, что существуют различные механизмы развития приобретенной резистентности микроорганизмов к антимикробным препаратам, в частности, изменение проницаемости клеточной стенки бактерий для препаратов (Страчунский Л.С, 2002), эффлюкс (efflux pumps) -активное выведение антибиотика из микробной клетки [Сазыкин Ю. О. с соавт., 1991; Сазыкин Ю. О., 1998), присутствие у грамотрицательных кишечных бактерий Тп-связанного генного элемента. F.Tenover (2005) отмечает, что в развитии и распространении резистентности к антимикробным препаратам участвуют несколько факторов: а) Обмен генетического материала между микроорганизмами, в результате которого обычные гены перемещаются из своего источника в новые клетки (Collatz Е. et al., 1983; Myrray В.Е. et al., 1986; Noble W.C. et. al., 1992). По мнению M.F. DeFlaun et al. (1991), масштабы способности микроорганизмов обмениваться ДНК посредством трансформации, трансдукции и коньюгации, начинают осознаваться только сейчас. Исследованиями P. Trieu-Cuot et al. (1985), М. Arthur et al. (1987) и др. установлено, что обмен происходит даже между микроорганизмами различных таксономических групп. б) Мутации резистентных генов-предшественников внутри вида, что приводит к расширению спектра активности кодируемых ими белков (Roy С. отмечают, что к изменению спектра резистентности приводят едва уловимые изменения в последовательности аминокислот, в результате чего штаммы, например, К.рпеитопіае, несущие БЛРС (В-лактамазы расширенного спектра), вызывают как эндемические, так и эпидемические заболевания. в) Селективное давление в лечебно-профилактических учреждениях и за их пределами, усиление которого активизирует образование новых резистентных микроорганизмов. Развитие лекарственной устойчивости является в значительной степени результатом направленной селекции микроорганизмов лекарственными препаратами (Сергиев В.П. с соавт., 2000; Влияние Протокола..., 2005; Ediin B.R.et al., 1992).
Самым драматичным механизмом устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам, по мнению М.С. Поляк (2003), является их инактивация. Как указывает СВ. Сидоренко С.В (2002),. Яковлев (2005), данный механизм резистентности является самым частым для В-лактамных препаратов. Продукция - В лактамаз - ведущий механизм устойчивости у представителей семейства Enterobacterieceae.
Фенотипические проявления условно-патогенных представителей семейста Enterobacteriaceae, выделенных из фекалий больных острыми кишечными инфекциями
Рабочий раствор для приготовления агарозного геля и проведения электрофореза (1х ТВЕ буфер) готовили следующим образом: : 200 мл 5х ТВЕ буфера и 800 мл дистиллированной воды. Раствор использовали многократно. Амплифицированный фрагмент идентифицировали по размеру, используя для сравнения маркер молекулярного веса ДНК Gene Ruler 100 bp DNA Ladder Plus (50 мкг). ДНК просматривали на трансиллюминаторе. Результаты документировали с использованием видеосистемы гель-документирования и программы «Gel Imager». Для выделения ДНК и проведения ПЦР использовали следующее г Уу т і н чь- ВЧ центрифуга «Minispin», смеситель типа «Vortex» MSC-3000, водяная баня, камера электрофоретическая «SE-2» (ООО «Биоклон»), универсальный источник питания (модель Эльф-4, ДНК-Технология»), трансиллюминатор UVT-1, амплификатор «Mastercycler GeneAmp 9700» (фирмы «Eppendorf»), видеосистема гель-документирования, микропипетки («Термо Электрон» г. С-Петербург). 2. Статистические методы Статистическая обработка эпидемиологических данных и результатов микробиологических исследований проводили с применением общепринятых параметрических и непараметрических критериев статистики (Амшарин Н.П. с соавт., 1962; Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С, 1999; Применение статистических методов..., 2004). Определение многолетней тенденции заболеваемости проводили с использованием уравнения прямой линии; корреляционный анализ - с определением коэффициента множественной линейной корреляции. При определении динамики изменения частоты встречаемости отдельных видов бактерий в структуре микроорганизмов, выделенных при острых кишечных инфекциях, использовали полиномиальную (наряду с прямой) линию тренда. Достоверность различий в уровнях заболеваемости определяли по критерию Стьюдента. Для оценки достоверности различий сравниваемых показателей в процентах использовали критерий Боярского. Учитывали число наблюдений, разность между показателями в %, а также меньший из показателей в %. Определяли разность между величинами, достижение которой означало, что превышение одного показателя над другим неслучайно. При разном числе наблюдений в сопоставимых группах использовали формулу расчета усредненного числа наблюдений: Показатель «Л», характеризующий состояние системы «лизоцим-антилизоцим», определяли как соотношение числа лизоцимактивных и антилизоцимактивных микроорганизмов. Интерпретировали результаты следующим образом: если «Л» больше или равен 2, прогнозируется благополучное экологическое состояние биоценоза, если менее 2-неблагополучное (Видовое разнообрзие..., 2000). Для количественной оценки степени доминирования микроорганизмов, принадлежащих к различным таксономическим группам, использовали шкалу Е.Л. Любарского учитывающую пять классов доминирования по 5-балльной системе (Баканов А.И., 1987). Для анализа эпидемиологической обстановки по острым кишечным инфекциям использован интегральный статистический критерий -суммарный индекс эпидемиологической ситуации (ИЭС) (Методический подход..., 2011). На первом этапе рассчитывали индивидуальный индекс (ИИ) : УМ=а,/М, где а, -значение отдельного /- го годового (месячного или другого) показателя. В данной работе для расчета ИИ использовали показатели заболеваемости ОКИ на 100 тыс. населения Иркутской области, в.т.ч. детей до 14 лет; М-среднее значение совокупности показателей в целом за период наблюдения ИЭС рассчитывали как среднюю величину из всех взятых в разработку индивидуальных индексов: Полученные индексы ранжировали, полученный ряд распределяли на группы, для каждой из которых рассчитывали диапазон значений в пределах доверительного интервала, а также выше или ниже его границ. Оценку экологического состояния водных экосистем по антибиотикорезистентности микробных популяций, представленных аллохтонными грамотрицательными бактериями, проводили с использованием индекса антибиотикорезистентности (ИАР), в основе которого лежит индекс множественной антибиотикорезистентности (Зайцева Е.А., 2010; Krumperman Р.Н., 1983). В предложенном нами способе, помимо микроорганизмов, обладающих множественной антибиотикорезистентностью, учитывали чувствительные штаммы, выделили в отдельную группу монорезистентные штаммы. Кроме подсчета индексов, были также определены критерии, по которым данный микроорганизм следует считать множественно резистентным. Кроме того, предложено группировать индексы (по их величине или диапазону величин) для проведения кластерного анализа полученных данных, что позволяет оценить антибиотикоустойчивость микробной популяции и на основании этих данных дать оценку экологического состояния водной экосистемы.
Антибиотикорезистентность условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из фекалий больных ОКИ
Проведенные исследования показали, что у микроорганизмов, выделенных в районе г. Якутска, по сравнению со штаммами контрольного участка значимо чаще отмечалась продукция ДНК-азы: 25,0±2,9% и 3,7±1,4% соответственно (р 0,01), щелочной фосфатазы: 41,7±3,3% и 29,5±3,5% соответственно (р 0,05) и адгезивная активность: 22,2±2,8% и 11,1±2,4% соответственно (р 0,01). Также следует отметить, что практически все штаммы, обладающие гемолитической активностью, были выявлены на «опытном» участке (р 0,05). Для микробного сообщества данного участка был характерен и более высокий уровень распространенности персистентных свойств энтеробактерий (52,8±3,1% и 18,5±3,0% соответственно) (р 0,01). Исключение составило наличие среди микроорганизмов протеолитическои активности. По критерию Вилкоксона направленность изменений фенотипических признаков бактерий на «опытном» и контрольном участках носила статистически значимый характер (р 0,05).
Водные объекты характеризуются наличием особой функциональной системы «лизоцим-антилизоцим» всех компонентов биоценоза, в т.ч. бактериального (Плотников А.О. с соавт., 2000), отражающей как санитарное, так и экологическое состояние водоема. Для оценки функционального состояния микробиоценоза реки Лены проведено изучение распространенности антилизоцимной (АЛА) и лизоцимной (ЛА) активности среди микроорганизмов аллохтонного (условно-патогенные энтеробактерии) и аутохтонного происхождения. Для этой цели наличие АЛА и ЛА былоопределено у 502 аутохтонных представителей и 378 штаммов энтеробактерии.
Результаты показали, что продукция лизоцима была выявлена у 79,3±1,8% представителей аутохтонной микрофлоры, антилизоцимная активность - у 38,1±2,4% энтеробактерии. Соотношение штаммов, продуцирующих лизоцим и обладающих антилизоцимной активностью, составило 2,79. Указанный показатель, согласно данным литературы (Плотников А.О. с соавт., 2000), свидетельствует о нормальном экологическом состоянии биоценоза. Однако в районе г. Якутска данное соотношение (ЛА:АЛА) составило 1,73. На этом участке реки продукция лизоцима была выявлена у 73,5±2,6% представителей аутохтонной микрофлоры, антилизоцимная активность - у 52,8±3,3% энтеробактерии. (табл.5.2.1).
Оценка функционального состояния микробиоценоза реки Лены (без учета участка в районе г. Якутска) в рамках системы «лизоцим-антилизоцим» показал, что соотношение ЛА:АЛА составило 6,87. При этом количество лизоцимактивных представителей аутохтонной микрофлоры составило 85,9±2,2%; а антилизоцимактивных условно-патогенных микроорганизмов-18,5±3,1%.
Как видно из данных таблицы, антилизоцимная активность присуща в основном аллохтонной микрофлоре, в связи с чем при антропогенном загрязнении доля антилизоцимактивных штаммов возрастает. Таким образом, изучение параметров системы «лизоцим-антилизоцим» (содержание лизоцимактивных и антилизоцимактивных штаммов) бактериального сообщества микробиоценоза р. Лены выявило характерные различия данных показателей на разных участках реки, что свидетельствует о целесообразности их использования при оценке экологического состояния микробиоценозов водных экосистем. Проведенные исследования показали, что в районах антропогенного воздействия на водные объекты происходят существенные качественные изменения микробиоценозов водных экосистем: наблюдается их перестройка, повышается доля биологически активных штаммов, что определяет целесообразность использования дополнительных методов, позволяющих оценить не только санитарное, но также и экологическое состояние водных экосистем. В связи с этим, при биотестировании водных объектов возрастает значение изучения биопрофилей условно-патогенных представителей водных биоценозов, в т.ч. их персистентного потенциала. Кроме выявления биологических свойств водных изолятов УПЭ на уровне фенотипа, проведено изучение (методом ПЦР) наличия и распространенности среди них генетических детерминант патогенности, свидетельствующих как об определенном потенциале патогенности водных изолятов УПЭ, так и об их эпидемиологической значимости. Проведенные исследования показали, что водные изоляты условно-патогенных микроорганизмов несут нуклеотидные последовательности генов «островов» патогенности. Так, были обнаружены генетические детерминанты, ассоциированные с продукцией гемолизинов и адгезивной активностью. Частота их выявления составила 7,8%. При этом отмечена встречаемость только двух генов: ЫуА (3,4%) и sfaG (4,5%). Также следует отметить, что набор генетических детерминант у одного штамма водного изолята, в отличие от клинических штаммов УПЭ, не превышал одного маркера. Оценка вирулентности водных штаммов энтеробактерий in vivo показала, что при тестировании четырех культур, характеризующихся наличием генетических детерминант патогенности, на 12 лабораторных животных, гибель мышей наступала через 24 часа (75,0%) и через 48 часов (25,0%). Штаммы энтеробактерий (количество культур - 5, количество биопроб - 15), характеризующиеся отсутствием генетических маркеров патогенности, не вызывали гибели лабораторных животных. В данной главе представлены результаты изучения антибиотикорезистентности условно-патогенных энтеробактерий, выделенных из копрофильтратов детей, больных острыми кишечными инфекциями установленной этиологии, а также водных изолятов энтеробактерий.
