Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Роль нормальной микрофлоры кишечника в поддержании здоровья у детей 8
1.2.Микроэкология кишечника у детей с заболеваниями органов дыхания 12
1.3. Роль klebsiella spp. и staphylococcus spp. в инфекционной патологии 17
1.4. Рациональные подходы к проблеме коррекции микробиоценоза кишечника у детей 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 35
Глава 3. Особенности микрофлоры толстого кишечника у детей при бронхолегочной патологии 47
3.1. Оценка кишечного микробиоценоза у детей, находившихся на стационарном лечении в рдкб 47
3.2. Микробиоценоз кишечника у детей раннего возраста с острыми заболеваниями органов дыхания 56
Глава 4. Биологические свойства клинических штаммов klebsiella pneumoniae и staphylococcus aureus, выделенных в виде монокультур и ассоциаций, из кишечника у детей с заболеваниями органов дыхания 66
4.1 Биохимическая характеристика клинических штаммов бактерий родов klebsiella и staphylococcus 66
4.2. Адгезивная активность штаммов k.pneumoniae и s.aureus 71
4.3. Персистентные свойства у штаммов k.pneumoniae и s.aureus 78
4.4. ДНК-азная активность штаммов k.pneumoniae и s.aureus 90
4.5. Гемолитическая активность штаммов k.pneumoniae и s.aureus 91
4.6. Лекарственная устойчивость штаммов k.pneumoniae и s.aureus 97
4.7. Изучение токсигенности штаммов k.pneumoniae и s.aureus методом «отек лап» 103
4.8. Обоснование лечебно-реабилитационных мероприятий для коррекции показателей неспецифической резистентности 106
Заключение 111
Выводы 125
Практические рекомендации 126
Список литературы 127
Приложения 146
- Роль нормальной микрофлоры кишечника в поддержании здоровья у детей
- Рациональные подходы к проблеме коррекции микробиоценоза кишечника у детей
- Оценка кишечного микробиоценоза у детей, находившихся на стационарном лечении в рдкб
- Биохимическая характеристика клинических штаммов бактерий родов klebsiella и staphylococcus
Введение к работе
Актуальность проблемы. Неуклонный рост числа заболеваний, связанных с нарушением биологического равновесия между макроорганизмом и разнообразными популяциями микробной флоры его отдельных органов и систем, сложившегося в процессе эволюции, привлекает внимание врачей различных специальностей: педиатров, гастроэнтерологов, неонатологов, инфекционистов и др. Наиболее уязвимы в этом отношении дети, состояние здоровья которых вызывает тревогу во всех регионах Российской Федерации [6, 29, 49]. В структуре детской патологии лидируют болезни органов дыхания, проблема успешного лечения которых остается нерешенной до настоящего времени [71, 101]. Интенсивная медикаментозная терапия, в частности применение антибиотиков при бронхолегочных заболеваниях у детей, часто приводит к количественным и качественным изменениям микробиоценоза кишечника, способствующим отягощению течения основного заболевания [56, 102, 103].
Дисбактериоз кишечника у детей раннего возраста характеризуется выраженными нарушениями нормальной микрофлоры толстой кишки и часто протекает в ассоциированных вариантах [59]. Возбудители этих инфекций, как правило, принадлежат к группе условно-патогенных бактерий, среди которых в последнее годы доминируют Staphylococcus spp. и представители семейства Enterobacteriaceae, в частности Klebsiella spp.. Им же принадлежит значительная роль в развитии дисбактериоза кишечника, поскольку достаточно часто колонизация слизистых оболочек различных биотопов организма ребенка стафилококками и клебсиеллами является стадией предшествующей локальной или системной инфекции [19, 90].
Сведений о клинической картине кишечных инфекций, вызванных клебсиеллами и о свойствах штаммов, выделенных в монокультуре, или в
ассоциации с условно-патогенными бактериями, в т.ч. стафилококками, весьма немногочисленны [51]. Одновременное развитие нескольких возбудителей приводит не только к суммированию болезнетворных возможностей, но и вызывает взаимное усиление вирулентности ассоциантов. Наряду с этим в популяциях взаимодействующих микроорганизмов увеличивается число особей, устойчивых к антибиотикам [8].
Подтверждением этиологической значимости условно-патогенных микроорганизмов, в частности культур выделенных в микробных ассоциациях, является изучение их патогенного потенциала и биологических свойств. К ведущим факторам патогенности, особенно на начальном этапе развития инфекционного процесса, относят синтез гемолизинов различных типов, адгезивную, антикомплементарную (АКА), антиинтерфероновую (АИА), антилизоцимную (АЛА), ДНК-азную, энтеротоксигенную активности [11, 19].
Исследования, направленные на изучение биологических свойств микробных ассоциаций позволят в каждом конкретном случае провести целенаправленную профилактику и лечение инфекционных процессов, в частности вызванных ассоциациями и монокультурами бактерий родов Klebsiella и Staphylococcus.
Исходя из вышеизложенного, оценка этиологической роли клинических штаммов Klebsiella pneumoniae и Staphylococcus aureus, выделенных в виде ассоциаций и монокультур, в возникновении дисбиотических состояний кишечника детей, страдающих бронхолегочными заболеваниями, требует всестороннего исследования их биологических свойств.
Цель работы. Изучение некоторых биологических свойств клинических штаммов K.pneumoniae и S.aureus, выделенных в виде монокультур и ассоциаций, при дисбактериозе кишечника у детей с бронхолегочной патологией.
Задачи исследования:
Изучить качественный и количественный состав микрофлоры кишечника у детей, находившихся на стационарном лечении в пульмонологическом отделении Республиканской детской клинической больницы Республики Башкортостан.
Выявить роль K.pneumoniae и S.aureus в структуре дисбактериозов кишечника у детей раннего возраста с бронхолегочной патологией.
Выяснить частоту проявления адгезивной, гемолитической (а-, тиолзависимой, энтеро-) антилизоцимной, антикомплементарной, антиинтерфероновой, ДНК-азной, ЛТ-энтеротоксигенной активностей у фекальных штаммов K.pneumoniae и S.aureus, выделенных в виде монокультур и ассоциаций.
Изучить спектр лекарственной устойчивости клинических штаммов K.pneumoniae и S.aureus, выделенных в виде монокультур и ассоциаций.
Обосновать возможность применения комплексного препарата „Линекс"
и функционального питания „Буза" в коррекции нарушений микроэкологии кишечника у детей с заболеваниями органов дыхания.
Научная новизна. Дан анализ состояния микрофлоры кишечника у детей раннего возраста с патологией органов дыхания. Впервые проведено сравнительное изучение факторов патогенности (адгезивной, гемолитической (а-, энтеро-, тиолзависимой), антилизоцимной, антикомплементарной, антиинтерфероновой, ДНК-азной, ЛТ-энтеротоксигенной активностей), чувствительности к антибиотикам у штаммов K.pneumoniae и S.aureus, выделенных в виде монокультур и ассоциаций из кишечника детей, больных пневмонией и бронхитом.
Выявлены различия в выраженности факторов патогенности и антибиотикорезистентности K.pneumoniae и S.aureus в зависимости от степени дисбиотических нарушений кишечника у детей с бронхолегочной патологией.
Запатентован штамм Enterobacter gergoviae ГНИИСК №259, обладающий комплексом факторов патогенности (патент №2161197, 2000г), который был выделен в ассоциации с K.pneumoniae и S.aureus из кишечника детей с бронхолегочными заболеваниями.
Практическая значимость. Показана необходимость лабораторных исследований фекалий на дисбактериоз у детей раннего возраста с патологией органов дыхания для выявления ранних нарушений микробиоценоза кишечника при применении медикаментозной терапии, особенно антибактериальной.
Представлена информация об этиологической роли факторов патогенности (адгезивная, гемолитическая (а-, энтеро-, тиолзависимая), антилизоцимная, антикомплементарная и антиинтерфероновая, ДНК-азная, ЛТ-энтеротоксигенная активности) фекальных штаммов K.pneumoniae и S.aureus, как критериев развития дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника у детей.
Основные положения, выносимые на защиту:
Качественный и количественный состав микрофлоры кишечника у детей с бронхолегочными заболеваниями.
Высокая частота выделения ассоциаций штаммов К.pneumoniae и S.aureus из кишечника детей с бронхолегочной патологией.
У фекальных штаммов K.pneumoniae и S.aureus, выделенных в ассоциации, чаще проявляется высокая степень адгезивной, гемолитической (а-, тиолзависимой, энтеро-)» антилизоцимной, антикомплементарной, антиинтерфероновой, ДНК-азной, ЛТ-энтеротоксигенной активности, чем у монокультур.
Прием бактерийного препарата «Линекс», функционального напитка «Буза» способствует восстановлению видового состава микробиоценоза кишечника.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции „Актуальные проблемы материнства в медицине труда" (Уфа,2001), межрегиональной научно-практической конференции „Мать и дитя у народов Башкортостана" (2001), на конференции бактериологов г.Уфы (2002г), на совместном заседании кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии, инфекционных болезней Башкирского государственного медицинского университета и ведущих научных сотрудников ГУП „Иммунопрепарат" и Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (ЭМП) (протокол №1 от 18,03.2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 2 методические рекомендации, один патент на изобретение № 2161197, 2000г.
Роль нормальной микрофлоры кишечника в поддержании здоровья у детей
С первых минут после рождения стерильный гастроинтестинальный тракт ребенка колонизируют бактерии, поступающие из внешней среды, и с этого первого контакта организма бактериальной флорой начинается формирование кишечной микрофлоры человека [41, 136], что обеспечивает предупреждение развития дисбактериозов у новорожденного [15, 39, 103,140]. Ряд авторов [39, 75, 137] утверждает, что после рождения происходит колонизация кишечника не только микробами матери, а также микрофлорой персонала и окружающей среды, представленной в основном аэробами и факультативными анаэробами. В результате этого формируется целостная единая экологическая система - организм человека плюс, населяющие его микроорганизмы. В разных участках человеческого тела (кожа, слизистые оболочки) в соответствии с условиями обитания формируются специфические ассоциации (биотопы) микроорганизмов, состоящие из разнообразных видовых сочетаний [84, 129, 135, 138]. При этом в любом микробиоценозе всегда имеются постоянно обитающие виды бактерий (аутохтонная, индигенная микрофлора), а также транзиторные виды (добавочные, случайные виды, аллохтонная микрофлора) [51, 103, 150,164, 173, 190].
Наиболее сложным биотопом является кишечная кооперация, которая представлена популяциями более 500 различных видов микроорганизмов, где соотношение анаэробов и аэробов составляет в норме 10:1, Качественный и количественный состав микрофлоры кишечника находится под потоянным контролем разнообразных механизмов, причем состав микрофлоры кишечника косвенно отражает состояние как защитных, так и других систем организма хозяина в различные периоды его жизни [6, 31, 52, 119, 124, 166]. Так ведущая роль в поддержании симбионтных отношений между макроорганизмом и его микробиотой, а так же в регуляции межмикробных взаимоотношений принадлежит представителям индигенных бактерий желудочно-кишечного тракта - кишечной палочке, энтерококкам, бактероидам, бифидобактериям и лактобациллам, которые выполняют ряд важных функций: 1. Обеспечение колонизационной резистентности по отношению к патогенной и другой, несвойственной данному отделу кишечника микрофлоре [52, 103, 174, 176]. 2. Детоксикационная функция - участие индигенной микрофлоры в процессе гидролиза продуктов метаболизма белков, липидов, углеводов, деконъюгация желчных и гидроксилирование жирных кислот, инактивация гистамина, ксенобиотиков и др. [68, 120]. 3. Синтетическая функция - образование аминокислот, летучих жирных кислот, витаминов, гормонов, биоактивных аминов и других биологически активных веществ [29, 31, 132, 157]. 4. Пищеварительная функция - усиление активности ферментов, пищеварительной и моторной функции желудочно-кишечного тракта [52,103,114,160,172,178]. Таким образом, микробиоценоз кишечника очень важная система организма, выполняющая и регулирующая многочисленные его функции по поддержанию гомеостаза [146, 154, 175], осуществляющая антианемическое, антирахитическое, антиаллергическое, антихолестеринемическое действие [120, 143, 180, 187, 192]. Естественно, что перечисленные выше функции будут стабильными, если поддерживается качественное и количественное постоянство нормофлоры в биотопах. Все положительные функции нормофлоры имеют место или в одинаковой степени проявляются во всех биотопах и определяются его анатомофизиологическими и биохимическими особенностями (биотопы желудочно-кишечного, урогенитального трактов, кожи, дыхательных путей и т.д.) [109]. Многие авторы отмечают и отрицательную деятельность нормофлоры: при превышении некоторой порговой величины отрицательно воздействующих на организм токсических факторов микробиоценозы выходят из состояния равновесия, что вызывает микроэкологические и иммунные нарушения [29, 125]. Это приводит к доминированию условнопатогенных микробов, усилению генетического обмена и возможному формированию клонов, несущих гены лекарственной устойчивости и генетические детерминанты «островов» патогенности, ассоциированные с адгезивными, цитотоксическими и энтеротоксическими свойствами бактерий [9, 31, 116, 168], которые потенциально могут иметь неблагоприятные последствия для организма. Значительная роль в этом принадлежит условно-патогенной микрофлоре, представителям родов Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Serratia (ceM.Enterobacteriaceae), а также Staphylococcus, Streptococcus и др. Каждая из положительных или отрицательных функций нормофлоры имеет сложный механизм и еще недостаточно изучен [29,124, 133, 152]. Ряд исследователей [41, 52] выделили три фазы становления биоценоза у новорожденных, находящихся на грудном вскармливании: 1 фаза - асептическая; 2 фаза - заселение кишечного тракта кокками и другими микробами (первые 2-4 дня жизни); 3 фаза - стабилизации. Бифидобактерии становятся основой микробного пейзажа (5-10 дней жизни). Эта фаза отодвигается во времени у детей, находящихся на смешанном и искусственном вскармливании. Формирование оптимального уровня колонизационной резистентности кишечной микрофлоры новорожденного во многом зависит от характера его питания [15, 39, 117]. Исследования показали, что в грудном молоке содержится ряд факторов, способствующих формированию нормальной микрофлоры кишечника [40, 67]. По данным многих авторов, у детей находящихся на искусственном или смешанном вскармливании, бифидофлора существенно угнетена - в этом их кардинальное отличие от детей, находящихся на естественном вскармливании. [7,67]. Искусственное вскармливание может являться одной из причин изменений микроэкологии ребенка с последующим участием эндогенной флоры в формировании инфекционных, аллергических, иммунопатологических процессов [9, 68, 168]. В опытах in vitro [127] продемонстрировано, что супернатанты бифидобактерий и лактобацилл обладают энзиматической активностью и оказывают ингибирующее действие на Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella tiphimurium, Shigella flexneri, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus при отсутствии антагонизма по отношению к другим представителям рода Lactobacillus и Bifidobacterium. Как показано в исследованиях многих авторов [31, 68, 103, 124], цитробактер, энтеробактер, протеи, клебсиеллы и другие условно-патогенные микроорганизмы, при снижении иммунологической резистентности организма, также могут приводить к изменению функции кишечника, формированию воспалительных процессов в различных органах в результате воздействия пептидных токсинов микробов.
Рациональные подходы к проблеме коррекции микробиоценоза кишечника у детей
В настоящее время, как уже отмечалось выше, накопилось много данных, свидетельствующих о роли микрофлоры кишечника не только в процессах пищеварения, но и в жизнидеятельности всего организма [6]. В то же время известно, что нарушения микрофлоры, т.е. дисбактериоз кишечника всегда является вторичным состоянием, лечение в первую очередь должно быть направлено на коррекцию основной патологии и устранение причин, вызвавших развитие дисбактериоза. Также целью лечения служит восстановление микроэкологии кишечника [29, 30, 51, 128].
Наиболее важным мероприятием в данном контексте является борьба за сохранение естественного вскармливания детей грудного возраста. Идеальной пищей для новорожденного ребенка и детей первых месяцев жизни является молоко матери, которое больше всего подходит ее ребенку, т.к. имеет родственную связь с его тканями [67].
Лечение должно быть комплексным, с использованием, как медикаментозной терапии, так и диетических методов коррекции, что будет сопровождаться улучшением микрофлоры кишечника и многих процессов в организме.
Важнейшим методом терапии дисбактериоза кишечника является применение лекарственных средств биологического происхождения, способных регулировать равновесие микрофлоры кишечника. Регуляция биологическими препаратами проводится по нескольким направлениям. Первое направление -селективная деконтаминация, которая наилучшим образом осуществляется путем применения специфических бактериофагов [49, 57, 85]. Бактериофаги действуют узконаправленно на соответствувющие микроорганизмы и не воздействуют на бактерии, относящиеся к облигатной микрофлоре кишечника. В настоящее время применяются следующие виды бактериофагов: стафилококковый, клебсиеллезный, синегнойный, коли-протейный бактериофаги, пиобактериофаг, интестибактериофаг [6, 68, 73, 88, 108]. В некоторых случаях, при низкой чувствительности к фагам могут использоваться антибактериальные препараты. Фаготерапия, как и антибиотикотерапия, должна проводиться целенаправленно, после предварительного определения чувствительности к ним микроорганизмов в каждом конкретном случае [73, 85]. Комплексная терапия может включать иммуномодулирующие средства, в том числе витамины, стабилизаторы клеточных мембран, микроэлементы [68, 108].
С целью ликвидации дефицита индигенной флоры используют пробиотики — препараты живых микроорганизмов (представителей индигенной микрофлоры кишечника), оказывающие при естественном способе введения позитивные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина через оптимизацию и стабилизацию его микробиоты. Это живые микроорганизмы - молочнокислые бактерии, бифидобактерии, лактобактерйи, молочнокислые стрептококки, которые относятся к обитателям кишечника здорового человека [6, 68, 96, 129, 148, 185]. Пробиотики не считаются лекарственными препаратами, а рассматриваются как средства, полезно влияющие на состояние здоровья людей.
Широкое распространение в педиатрической практике получил препарат-пробиотик «Линекс», который обладает способностью подавлять развитие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Линекс применяется при острых кишечных инфекциях вирусной и бактериальной природы, хронических заболеваниях других органов, протекающих с явлениями дисбактериоза кишечника [28, 43].
Селекивная стимуляция направлена на активизацию процессов роста и развития индигенной флоры за счет усиления метаболизма микробных клеток. К препаратам этого направления, т.е. пребиотикам относятся хилак-форте, дюфалак, пантотенат кальция, лизоцим. Это неперевариваемые ингредиенты пищи, которые способствуют улучшению здоровья за счет избирательной стимуляции роста и метаболической активности одной или нескольких бактерий групп, относящихся к индигенной флоре (лактобактерйи, бифидобактерии) в толстой кишке. Чтобы компонент пищи был классифицирован как пребиотик, он не должен подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами человека, не должен адсорбироваться в верхних отделах пищеварительного тракта, однако должен являться селективным субстратом для бифидобактерии и лактобактерйи, заселяющих толстый кишечник. В связи с этим для получения более стойкого клинико-бактериологического эффекта их целесообразно назначать лишь в комбинации со средствами заместительной терапии (пробиотиками) [103, 131]. Пребиотики не являются лекарственными препаратами.
Существует также группа препаратов получивших название синбиотики. Они представляют собой смесь пробиотиков и пребиотиков, которые оказывают комплексный полезный эффект на здоровье организма хозяина, улучшая выживаемость и приживляемость в кишечнике живых представителей резидентной микрофлоры, при этом избирательно стимулируя рост и активацию метаболизма индигенных лактобактерий и бифидобактерий [6, 103].
Однако весьма различны причины развития дисбактериозов, их характер и степень выраженности, клинические проявления, иммунный статус макроорганизма, условия для развития эндо- и экзоинфекций. Установлено, что входящие в бакпрепараты микроорганизмы, как правило, в организме человека и животных стойко не приживаются. Одной из причин неудач при бактериотерапии может быть биологическая несовместимость бактерий эубиотика с резидентной микрофлорой пациента, что приводит к быстрой элиминации эубиотиков из организма [68, 88].
Как показали исследования [55, 142], у детей раннего возраста с инфекционно-воспалительными заболеваниями, в том числе и с острой пневмонией, после проведенного лечения (антибиотики с учетом чувствительности к применяемым препаратам в сочетании с биопрепаратами) наступало клиническое улучшение, но ни у одного ребенка при контрольном лабораторном обследовании не отмечалось формирование нормальной микроэкологии кишечника. В катамнезе у таких детей выявлялись рецидивирующие заболевания органов дыхания и патологические изменения гастроинтестинального тракта [40, 53, 57, 104].
По данным специалистов, при неэффективности бактерийных препаратов, в силу слабой их приживляемости в кишечнике больного, возможно использование аутоштаммов бифидо- и лактобактерий [68, 103], Они могут длительно сохранять свою активность в лиофилизированном состоянии или в холодильнике при температуре -20 С.
Оценка кишечного микробиоценоза у детей, находившихся на стационарном лечении в рдкб
Нормальная симбиотическая микрофлора кишечника играет существенную роль в обеспечении защитных и физиологических функций организма. Изменение качественного и количественного состава нормофлоры способствует нарушению иммунобиологической реактивности организма, развитию многих патологических процессов, особенно в детском возрасте. Исследование кишечного микробиоценоза позволяет судить о состоянии организма в целом и о развитии острых и хронических воспалительных заболеваний в разных органах. В связи с этим нами проведен ретроспективный анализ результатов микробиологического исследования фекалий 2565 детей, в возрасте от нескольких дней до 14 лет, находившихся на поликлиническом обследовании (51,4%) и стационарном лечении (48,6%) в различных отделениях Республиканской детской клинической больницы в период 2000 - 2001 гг.
Среди всех обследованных детей (51,0% - мальчиков, 49,0% - девочки), наибольший процент, составили пациенты с функциональными расстройствами желудочно-кишечного тракта - 46,1%, с заболеваниями органов дыхания -23,5%, иммуно-аллергологическими нарушениями - 16,5%, прочими отклонениями - 13,9%. (рис 3.1)
Среди стационарных больных большую часть обследованных на дисбактериоз кишечника составили дети из пульмонологического отделения -49,4%, гастроэнтерологического - 17,5%, хирургического - 11,2%, аллергологического - 8,5%, из других отделений - 13,4% (рис.3.2 А.) При лабораторных исследованиях фекалий амбулаторных больных большая часть анализов приходилась на гастроэнтерологический кабинет
Выявили также различия в структуре заболеваний детей, у которых проводили исследования микроэкологии кишечника, в зависимости от возраста и пола. Все дети были разделены на 3 возрастные группы: до 1 года, 1 -3 года, старше 3 лет. Установили, что на больных детей из пульмонологического отделения в возрасте до 1 года приходилось 74,2% исследований, 1-3 года -25,0%, а в возрасте старше 3-х лет - 9,0%. В то же время при других заболеваниях исследования на дисбиоз кишечника у детей составили соответственно 25,8%, 75,0% и 91,0%. Материал для бактериологического анализа поступал из пульмонологического отделения в 1,7 раза чаще от мальчиков, чем от девочек (46,8% - мальчиков, 27,1% - девочек), а из других отделений в 1,4 раза чаще от девочек (53,2% - мальчиков, 72,9% - девочек). Из данных лабораторных исследований следует, что в возрасте до 1 года наибольший процент анализов на дисбактериоз кишечника приходился на больных детей из пульмонологического отделения - 74,2% (61,2% - мальчиков и 38,8% девочек) (рис. 3.3) (рис. 3.4).
Во второй возрастной группе на детей из пульмонологического отделения приходился 25,0% (68,7%) - мальчиков и 31,3% - девочек), а из других отделений - 75,0% (48,0% - мальчиков и 52,0% девочек). В возрасте старше 3-х лет доля обследованных детей при бронхолегочной патологии - 9,0% (76,9% мальчиков и 23,1% девочек) и при других нарушениях 91,0% (39,4% мальчиков и 60,6% девочек).
Анализ результатов бактериологических исследований фекалий детей с патологией органов дыхания и другими нарушениями за 3 года того же периода позволил дать сравнительную оценку состояния микроэкологии кишечника (табл. 3.1). Для оценки результатов исследований фекальной микрофлоры использовали ряд отдельных критериев: спектр выделенных микроорганизмов, процент их встречаемости и количественные показатели. В соответствии с методическими рекомендациями в наших исследованиях были выявлены представители 16 родов и 33 видов аэробных, факультативно-анаэробных и анаэробных микроорганизмов, относящихся к облигатной и факультативной микрофлоре.
Из облигатных микроорганизмов анаэробы: бифидо бактерии, бактероиды, лактобациллы составляют 90-95% содержимого кишечной микрофлоры. Содержание Bifidobacterium spp. в норме должно составлять 8-10 IgKOE/r, нормальная концентрация Lactobacillus spp. в фекалиях детей должна быть не ниже 6-7 IgKOE/r. Численность факультативно-анаэробных E.coli обычно определялся в пределах 7-8 IgKOE/r. Определение количественного содержания облигатных представителей кишечной микрофлоры у обследованных групп детей и сопоставление полученных результатов с условно принятой нормой показало, что для детей из пульмонологического отделения характерно снижение бифидобактерий в среднем на 2 порядка: 5,9±0,7 IgKOE/r, а у большинства (81,0%) детей из других отделений содержание бифидобактерий составило- 8,1±0,4 IgKOE/r т.е. в нижних пределах условной нормы. Отметили достоверные различия в содержании бифидобактерий у детей из пульмонологического и других отделений (р 0,01).
Содержание лактобацилл в фекалиях детей пульмонологического отделения было незначительно (р 0,05) ниже условной нормы и составляло 5,7±0,6 IgKOE/r. У детей из других отделений уровень лактобацилл составлял 6,0±0,6 IgKOE/r, т.е. в пределах показателей нормы (р 0,05).
Количество E.coli с типичными свойствами в обеих группах детей определялся практически на одном уровне - 7,5 - 7,81gKOE/r и находился в пределах нормальных значений этого показателя.
В отношении кишечных палочек с измененными ферментативными свойствами (лактозанегативные, гемолизирующие) мы отметили, что у детей пульмонологического отделения E.coli неферментирующие лактозу выделялись в количестве 5,6±0,3 lgKOE/r, что было в 1,8 раз выше нормы и достоверно (р 0,05) отличалось от их содержания в фекалиях детей из других отделений 3,1±0,3 lgKOE/r. В содержимом кишечника так же были обнаружены E.coli, обладающие гемолитической активностью. В фекалиях здоровых детей, т.е. в норме они практически не должны присутствовать, тем не менее гемолитические E.coli были характерны для всех лабораторно обследованных детей в достаточно большом количестве: из пульмонологического отделения 5,3±0,4 lgKOE/r (р 0,05), других отделений 2,2±0Д lgKOE/r (р 0,01).
Наряду с облигатными микроорганизмами в кишечнике детей в значительных количествах присутствовали и условно - патогенные, способные вызывать заболевания в случае снижения резистентности организма. Спектр определяемых представителей факультативной микрофлоры толстой кишки и их содержание в 1г фекалий позволяет оценить состояние микроэкологии кишечника при бронхолегочной патологии у детей.
Принято считать, что при нормально сложившемся микробиоценозе кишечника концентрация условно- патогенных энтеробактерий Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Kluyvera spp. и других в сумме может достигать 3-41g КОЕ/г у детей в возрасте до 1 г и не более 41g КОЕ/г в возрасте более Ігода. Содержание в фекалиях клебсиелл и протея учитывается отдельно и в норме также не должно превышать 41g КОЕ/г [52].
Биохимическая характеристика клинических штаммов бактерий родов klebsiella и staphylococcus
Клебсиеллы объединены в род Klebsiella, относящийся к семейству Enterobacteriaceae по всем существующим классификациям энтеробактерий. В "Определителе бактерий Берги" [74] представлено 4 вида: K.pneumoniae, K.oxytoca, K.planticola, K.terrigena.
Клебсиеллы - это неподвижные, не образующие спор грамотрицательные палочки с закругленными концами. Имеют капсулу. Факультативные анаэробы. Оптимальная температура роста 35-37 С. Типовой вид: К.pneumoniae.
Стафилококки относятся к роду Staphylococcus сем. Місгососсасеае. Стафилококки - это грамположительные, неподвижные, неспорообразующие сферические клетки. Факультативные анаэробы. Типовой вид: Staphylococcus aureus [74]. Проведена идентификация 165 штаммов Klebsiella и 293 штаммов Staphylococcus.
При определении родовой и видовой принадлежности представителей семейства Enterobacteriaceae, выделенных из фекалий детей, учитывали характер роста и образование газа и кислоты в среде Олькеницкого, изучали биохимическую активность культур по способности утилизировать цитрат натрия, малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой, глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу, инозит, сорбит, арабинозу, мальтозу, фементировать лизин, аргинин, р-галактозидазу и т.д.. Все изученные штаммы бактерий рода Klebsiella не обладали фенилаланиндезаминазой, не образовали сероводород. Некоторые штаммы (8,9%) образовали индол, почти все штаммы (94,3%) давали положительную реакцию Фогеса-Проскауэра. На основании определения биохимических свойств из 165 клинических штаммов Klebsiella 133 (80,6%) были отнесены к K.pneumoniae, 32 (19,4%) -K.oxytoca (табл.4.1). Следует отметить, что у детей с заболеваниями органов дыхания K.pneumoniae были изолированы из содержимого толстого кишечника как в виде монокультур - 47 (35,3%) штаммов, так и ассоциаций с другими условно-патогенными микроорганизмами - 86 (64,7%) штамма, в том числе со стафилококками - 42 штамма (31,6%). Запатентован штамм Enterobacter gergoviae ГНИИСК №259, обладающий комплексом факторов патогенносте (патент №2161197, 2000г), который был выделен в ассоциации с K.pneumoniae и S.aureus из кишечника больных детей с бронхолегочными заболеваниями. Видовую принадлежность клинических штаммов Staphylococcus spp. определяли по 20 признакам: образованию лецитиназы на среде Чистовича, реакции плазмокоагуляции, утилизации глюкозы, фруктозы, маннозы, мальтозы, лактозы, трегалозы, маннита, ксилозы, сахарозы, арабинозы, галактозы, салицина. Выявляли наличие фосфатазы, нитратредуктазы, уреазы, образование ацетилметилкарбинола, образование пигмента и гемолизина. По биохимическим свойствам из 293 клинических штаммов Staphylococcus spp. 234 (79,8%) были отнесены к S.aureus, 31 (10,6%)-S.epidermidis, 16 (5,5%) - S.saprophytics, 5 (1,7%) - S.xylosus, 7 (2,4%) -S.intermedius (табл.4.2). По характеру выделения 42 (17,9%) штамма S.aureus были обнаружены в фекалиях у больных пневмонией и бронхитом детей в виде ассоциаций с К .pneumoniae, 130 (55,5%) штаммов в ассоциации с другими условно-патогенными микроорганизмами, 62 (26,6%) штамма в виде монокультур. Для выделения стафилококков с комплексом персистентных характеристик (АЛА, АИА, АКА) была применена новая питательная среда с фузидином [18]. На этой среде дали рост 108 штаммов стафилококков. Для дальнейших исследований все штаммы K.pneumoniae были разделены по группам: 1 группа - штаммы K.pneumoniae, выделенные у детей с заболеваниями органов дыхания в виде монокультур; 2 группа - штаммы K.pneumoniae выделенные у детей с заболеваниями органов дыхания в виде ассоциаций со S.aureus; Штаммы S.aureus были распределены аналогично. Из каждой группы для изучения факторов патоген ности были оставлены по 40 штаммов S.aureus и K.pneumoniae, выделенных в виде монокультур (1 группа), по 40 штаммов S.aureus и K.pneumoniae в ассоциации друг с другом (2 группа). Начальным и необходимым этапом развития инфекционного процесса является адгезия микроорганизмов - способность прикрепляться к слизистой эпителия с помощью специальных адгезии ов, входящих в состав фимбрий или структур клеточной стенки бактерий. Для клебсиелл в основном характерны фимбрий двух типов: фимбрий 1 типа агглютинируют свежие эритроциты тест-объектов, если в реакционной смеси нет Д-маннозы, называются маннозочувствительными (MSHA). Для фимбрий типа 3, которые впервые были обнаружены у клебсиелл, характерна агглютинация танизированными эритроцитами в присутствии Д-маннозы. Они называются маннозорезисгентными клебсиеллоподобными гемагглютининами (MR/KHA). Некоторые штаммы клебсиелл содержат оба типа адгезинов. При этом исследователи полагают, что рецепторы эпителиальных клеток аналогичны структурам, которые определяют группы крови, поэтому метод гемагглютинации с эритроцитами различных видов животных, человека и птиц широко используется для выделения адгезинов бактериальных клеток [76].
Исходя из этого в первой серии исследований по выявлению характера клеточных структур, обеспечивающих адгезивную активность штаммов клебсиелл, была изучена их гемагглютинирующая способность. Постановку реакции гемагглютинации (РГА) проводили на предметном стекле по методике Габидуллина З.Г. (Автор. Свидетельство №1312098 от 22.01.87) с использованием 3% суспензии эритроцитов цыпленка, содержащей 0,6% концентрацию Д-маннозы и без нее, что позволило выявить MS и MR структуры бактериальной клетки.
