Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Ризосферные бактерии и биологический контроль 8
1.2. Морфологические, физиологические и биохимические свойства бактерий рода Pseudomonas 10
1.3. Экология бактерий рода Pseudomonas 12
1.4. Влияние Pseudomons fluorescens на рост и развитие растений 13
1.5. Генетическое маркирование бактерий 22
ГЛАВА 2. Материалбі и методы
2.1. Штаммы бактерий и фитопатогенных грибов 27
2.2. Микробиологические исследования
2.2.1. Генетическое маркирование 27
2.2.2. Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств P. fluorescens 28
2.2.3. Оценка антагонистической активности P. fluorescens в отношении фитопатогенных грибов in vitro 33
2.2.4. Определение колонизирующей способности псевдомонад in vitro 34
2.2.5. Микроскопическое исследование корней растений огурца 35
2.3. Определение всхожести семян и формирование проростков in vitro 35
2.4. Вегетационные опыты 36
2.5. Статистическая обработка результатов исследований 37
Собственные исследования
Глава 3. Основные биологические свойства p. fluorescens ті и его gus- маркированных производных
3.1. Маркирование природного ризосферного штамма P. fluorescens 2137 геном глюкуронидазы 38
3.2. Морфологические, культуралъные и биохимические свойства штамма 2137 P. fluorescens и его маркированных призводных 3 8
3.3. Антифунгальная активность P. fluorescens 2137 и его ^«-маркированных призводных in vitro 44
ГЛАВА 4. Влияние p. fluorescens 2137 и его gusa- маркированных производных на рост и развитие растений
4.1. Влияние P. fluorescens на энергию прорастания, всхожесть семян и биометрические показатели проростков огурца in vitro 47
4.2. Колонизирующая способность псевдомонад in vitro 52
4.3. Влияние P. fluorescens 2137 и его gusA -маркированных производных на
развитие растений огурца 58
4.4. Биоконтрольные свойства псевдомонад 61
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 63
Выводы 73
Литература 74
- Ризосферные бактерии и биологический контроль
- Влияние Pseudomons fluorescens на рост и развитие растений
- Маркирование природного ризосферного штамма P. fluorescens 2137 геном глюкуронидазы
- Влияние P. fluorescens на энергию прорастания, всхожесть семян и биометрические показатели проростков огурца in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Совокупность корневой системы растений с почвой представляет собой сложную экологическую нишу - ризосферу, заселенную различными микроорганизмами (бактериями, грибами, водорослями и др.). Постоянным компонентом ризосферных сообществ являются бактерии рода Pseudomonas, которые активно используют корневые экзометаболиты в качестве источников питания (Возняковская Ю.М., 1969; Смирнов В.В., Киприанова Е.А., 1990; Whipps J., 2001). Псевдомонады, в свою очередь, могут стимулировать рост и развитие растений за счет продукции регуляторов роста, биологически активных веществ, улучшения минерального питания и подавления фитопатогенов (Воронин A.M., 1998; Garcia L et.al.,2003; Ryu С. et.al., 2005).
Некоторые природные штаммы Pseudomonas, обладающие высокой антифунгальной активностью in vitro, используют в биотехнологии при разработке препаратов биологического контроля (Ермолова Н.И. и др., 1992; Сидоренко О.Д., 2001; Gamalero Е. et al., 2003). Способность псевдомонад ограничивать распространение и снижать численность популяций фитопатогенных грибов в ризосфере сельскохозяйственных растений зависит, в первую очередь, от успешной колонизации бактериями корневой системы (Lugtenberg В. et al, 2001).
Комплексное изучение колонизирующей активности и
ростостимулирующих свойств бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов на всех этапах развития растения стало возможным лишь недавно. Этому способствовала разработка метода ^'^-маркирования, позволяющего осуществлять слежение за микробными популяциями в естественной среде обитания (Шапошников А., 2003; Chebotar К. et al., 2001; Wilson К., 1995). Однако встраивание в геном бактерий гена /?-глюкуронидазы (gusA), опосредованное транспозоном, может вызвать различные мутации (Wilson К., 1995). Поэтому, представляется необходимым изучение биологических свойств ^/^-маркированных штаммов в связи с оценкой возможности их
5 использования для характеристики взаимодействия псевдомонад с растениями.
Цель исследования. Оценить влияние бактерий Pseudomonas. fluorescens 2137 на рост и развитие высших растений с помощью ^.^-маркирования.
Задачи работы:
1. Получить производные штамма P. fluorescens 2137, маркированные геном
/?-глюкуронидазы (gusA).
2. Изучить основные морфологические, культуральные и биохимические
свойства штамма P. fluorescens 2137 и его gw^-маркированных производных.
3. Оценить антагонистическую активность бактерий P. fluorescens в
отношении фитопатогенных грибов in vitro и в ризосфере растений.
Определить колонизирующую способность бактерий P. fluorescens.
Изучить влияние бактерий P. fluorescens на рост и развитие растений in vitro и в условиях вегетационного опыта.
Научная новизна полученных результатов. Впервые установлено, что введение гена gusA в бактериальную клетку приводит к изменению ряда культуральных и биохимических свойств, а также антагонистической активности P. fluorescens в отношении фитопатогенных грибов. С помощью ^/^-маркированных производных штамма P. fluorescens 2137 изучена выживаемость и установлена локализация бактерий на корнях растений; доказана колонизация псевдомонадами не только поверхностных, но и внутренних тканей корня.
Показано, что инокуляция бактериями P. fluorescens может оказывать на прорастание семян как ингибирующий, так и стимулирующий эффект в зависимости от продолжительности экспозиции и концентрации бактериальной суспензии. Выявлены условия, при которых обработка семян суспензией ризосферного штамма P. fluorescens 2137 стимулировала прорастание семян, формирование проростков и развитие растений в условиях вегетационного опыта.
Практическое значение полученных результатов. Маркирование геном /?-глюкуронидазы позволяет определить присутствие бактерий P. fluorescens не только на селективной среде in vitro, но и в естественной среде обитания -в ризосфере и ризоплане растений. Показана эффективность gusA-маркирования при оценке биоконтрольных и ростостимулирующих свойств изучаемых штаммов P. fluorescens в отношении высших растений. Определены оптимальные условия предпосевной обработки семян бактериями P. fluorescens 2137, способствующие повышению энергии прорастания и всхожести семян, формированию устойчивости к фитопатогенам и увеличению биометрических показателей растений. Результаты исследования используются в лекционном курсе «Почвенная микробиология» на факультете почвоведения и агроэкологии ФГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный аграрный университет Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.
Основные положении диссертации, выносимые на защиту:
Интродукция гена /?-глюкуронидазы приводит к изменению ряда культуральных и биохимических свойств gMS/4-штаммов, полученных на основе P. fluorescens 2137.
^/.^-производные штамма P. fluorescens 2137 различаются по антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов Fusarium и Verticilium in vitro.
g«5/4-маркирование позволяет изучить колонизирующую способность и определить локализацию P. fluorescens на корнях растений.
Бактерии штамма P. fluorescens 2137 и его производные 5gusA, ISgusA и 4\gusA способны стимулировать рост и развитие растений, а также обеспечить защиту от фитопатогенов.
Личный вклад соискателя. Микробиологические, молекулярно-генетические и вегетационные исследования, выполнены лично автором в лаборатории молекулярной микробиологии в ФГУН Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора и на
7 кафедре физиологии и биохимии растений ФГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный аграрный университет Министерства сельского хозяйства Российской Федерации. Маркирование геном gusA, микроскопические исследования проведены совместно с Е.В. Лимещенко (ФГУН Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора) и А.В.Ходоренко (ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии).
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Всерос. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы развития АПК», Саратов, 2006; науч.-практ. конф. проф.-препод. состава, науч. сотр. и аспирантов СПбГАУ (2001-2005 гг.); Межд. науч.-практ. конф., посвящ. 75-летию РАСХН, Краснодар, 2004; Межд. науч.-практ. конф. «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 2004; Межвуз. конф. молодых ученых «Герценовские чтения», СПб, 2003. Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный аграрный университет Министерства сельского хозяйства Российской Федерации 16.12.2004.
Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 5 печатные работы, в том числе одна журнальная статья.
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждения результатов и выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 103 страницах, иллюстрирована 18 рисунками, включает 11 таблиц. Список литературы состоит из 280 источников, в том числе - 212 на иностранных языках.
Ризосферные бактерии и биологический контроль
Интенсивное применение в сельском хозяйстве химических средств защиты растений привело к загрязнению окружающей среды, нарушению экологического равновесия в природе и появлению резистентных к химическим препаратам форм патогенов (Захаренко В.А., 2001; Сухорученко Г.И., 2001; Тютерев С.Л., 2001; Wang S. et al., 2002а, 2002b, 2002с, 2002d; Rangarajan S. et al., 2003; Lee J. et al., 2003). В этой связи, возникает вопрос о необходимости экологизации земледелия, которая тесно связана с развитием биологических методов защиты растений, основанных на использовании естественных агентов биологической регуляции (Захаренко В.А., 2004; Johnsson L. et al., 1998; Pal К. et al., 2001). Концепция биозащиты базируется на общебиологическом принципе - «использование живого против живого» (Соколов М.С., Терехов В.И., 1995).
Микроорганизмы, которые используют для защиты растений от фитопатогенов, называют биоконтролирующими агентами (Лещинская И.Б., 2000; Гришечкина Л.Д., 2004; Pal К. et al., 2001; Nagarajkumar М. et al., 2004; Dey R. et al., 2004). Биоконтроль подразумевает не полное уничтожение нежелательного микроорганизма, а ограничение его размножения (Когут М.М. и др., 1986; Никонов П.В., Твердюков А.П., 1992; Воронин Г.Н., 1994; Лисина Т.О. и др., 2001). Преимущество бактерий-антагонистов патогенов растений перед пестицидами и химическими удобрениями в их комплексном позитивном действии и высокой эффективности при использовании минимальных доз микробных препаратов (Еремеенко А.П., 1994; Новиков И.И., Литвиненко А.И., Калько Г.В., 1995; Yamaguchi I., 1996; Dobbelaere S. et al., 2003). У фитопатогенов гораздо труднее развивается устойчивость к биоконтролирующему агенту или не развивается вовсе. Резистентность растений к возбудителям болезней, вызываемых почвенными фитопатогенами, во многом определяется результатами взаимодействия между корневой системой растений и разнообразными микроорганизмами (Whipps J., 2001). Совокупность корневой системы с почвой представляет собой сложную экологическую нишу - ризосферу, заселенную полезными, вредными и нейтральными для растений микроорганизмами (Воронин A.M., 1998). Так, в ризосфере и ризоплане растений присутствуют бактерии, актиномицеты, грибы, водоросли в количествах, существенно превышающих численность этих же организмов в почве, свободной от корней. Активная секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, образующие с ним прочные ассоциации как в ризосфере, так и на корневой поверхности (ризоплан) и внутри корневых тканей (ризодерма). В свою очередь, ризосферные бактерии обеспечивают регуляцию роста и развития, а также защиту растений от вредителей за счет обогащения почвы азотом и фосфором, продукции фитогормонов, витаминов, антибиотиков, сидерофоров и других веществ (Ермолова Н.И., 1992; Воронин A.M., 1998; Krasilnikov N., 1958; Palleroni N., 1981; Dijkstra A. et al., 1987; Neilsen T. et al., 2000; Benizri E. et al., 2001; Geoffrey W. et al., 2001; Nelson L., 2004; Сидоренко О.Д., 2001; Meena B. et al., 2002).
Ризосферные бактерии, способные колонизировать корни, подавлять фитопатогены и стимулировать рост растений, в зарубежной литературе обозначают термином Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) -«ризобактерии, способствующие росту растений», Mycorrhization Helper Bacteria (MHB) - «бактерии помощники микоризы», Plant Associated Bacteria (PAB) - «бактерии ассоциированные с растением», Yield increasing bacteria (Y1B) - «бактерии, повышающие урожайность» и др. (Kloepper J., Schroth М., 1978; Schippers В. et al., 1987; (TSullivan D., O Gara F., 1992; Glick B. et al., 1999; Martinotti M, 2000; Duponnois R., Garbaye J., 1991; Garbaye J., Duponnois R., 1992; Garbaye J., 1994; Chen Y. et al., 1996). Наиболее перспективными агентами биологического контроля считают PGPR рода Pseudomonas (Ермолова Н.И. и др., 1992; Fitter A., Garbaye J., 1994; Expert J., Digat В., 1995; Neilsen M. et al., 1998; Meena B. et al., 2002).
Влияние Pseudomons fluorescens на рост и развитие растений
Бактерии рода Pseudomonas - постоянные обитатели почв, морских и пресных вод, илов, сточных вод; их можно обнаружить на пищевых продуктах, на любом растительном материале, в кишечнике человека и животных. Так, в морских водах были найдены P. desmolitica, P. geniculata, P. ambiqua (Новожилова М.И. и др., 1978; Трунова О.Н., 1977). В пресных водоемах .также обнаружены многие представители Pseudomonas: Р. fluorescens, P. aeruginosa, P. chitinovora, P. denitrifacans, P. brenneri и др. (Кузнецов СИ, 1970; Павлова О.Н. и др., 2003; Baidaa N. et al, 2001). Почвы различных типов и различных географических зон, в том числе и почвы Антарктиды, содержат псевдомонады (Meyer J.-M. et al, 1998). Даже почвы, загрязненные нефтью, и рудные месторождения также пригодны для размножения бактерий рода Pseudomonas (Розанова Е.П., Кузнецов СИ., 1979; Riviere J., Gatellier С, 1976; Каравайко Г.И. и др., 1978).
Псевдомонады представлены в большом количестве в зоне корневой системы почти всех высших растений, в частности, сельскохозяйственных (овса, ячменя, пшеницы, риса, кукурузы, гречихи, подсолнечника, боба, сои, редиса, картофеля, сахарной свеклы, вишни, яблони, груши, сливы, крыжовника, цитрусовых и т.д.) (Anderson A., Guerra D., 1985; Burr Т. et al., 1978; Caesar A., Burr Т., 1987; Gardner J. et al., 1984; Geels F., Schippers B, 1983; Leeman M. et al., 1995; Dandurand L. et al., 1997; Dashti N. et al., 1997; Nielsen M., Sorensen J., 1999; Ramesh Kumar N. et al., 2002). Эти бактерии населяют надземные и подземные части растений: листья, цветки и корни, т.е. являются как филлосферными, так и ризосфериыми микроорганизмами (Возіїяковская Ю.М., 1969; Johnson К., Stockwell V., 1998; Lindow S., Suslow Т., 2003; Wilson M., Lindow S., 1993; Hornschuh M., 2002; Scherm H. et al., 2004). Псевдомонады - не только эпифитные микроорганизмы, обитающие на поверхности различных органов растений, но и - эндофитные, колонизирующие внутренние ткани корня и стебля (Jacobs М. et al., 1985; Hoflich G., Wiehe W., 1995; Mpiga P. et al., 1997; Hallmann J. et al., 1997; Shishido M. et al., 1999; Marek-Kozaczuk M. et al.,2000; Chanway C.P. et al., 2000; Lodewyckx C. et al., 2002; Germaine K. et al., 2004).
Стимулирующее влияние псевдомонад на рост и развитие растений и их биоконтрольные свойства обусловлены несколькими механизмами (Glick В., 1995; Weller D. et al.,2002; Ryu С. et.al.,2005).
Флюоресцирующие псевдомонады стимулируют рост и развитие растений, в первую очередь, за счет способности к быстрой и агрессивной колонизации корневой системы (Suslov Т., 1982; Seong К., 1991; Marschner Р. et al, 1997; Bonaterra A. et al., 2003; Okubara P. et al., 2004; Wang С et al., 2004). В 1904 г. Hiltner L. впервые обратил внимание на то, что микрофлора почвы, где произрастают растения, распределена неравномерно, и численность микроорганизмов в слое почвы, непосредственно прилегающем к корням, значительно выше, чем в почве, свободной от корней. Было установлено, что, так называемый, «ризосферный эффект» (Rhizosphere effect) выражается не только в значительном увеличении количества микроорганизмов в прикорневой почве, но и в изменении их качественного состава: вблизи корней и на их поверхности концентрируются неспоровые бактерии (Возняковская Ю.М., 1969). В настоящее время под ризосферой понимают пространство вокруг корня (2 - 8 мм в диаметре), в котором происходит обильное развитие микроорганизмов из-за стимуляции их роста корневыми экссудатами. Пространство ризосферы, включающее и ткани самого корня, иногда называют еще эндоризосферой.
Высокая скорость роста псевдомонад позволяет им сохранять численное преимущество над многими конкурентами (Rincon A. et al., 2005). Максимального уровня ризосферная популяция микробов достигает обычно к середине и концу вегетации растений. Заселение корней ризобактериями осуществляется с помощью активного и пассивного перемещения. Так, пассивное распространение бактерий P. fluoresceins идет по мере роста корней и связано с передвижением водных потоков (фильтрацией) и адсорбцией. При этом отсутствие подвижности (у мутантов, лишенных жгутиков) не влияет на выживаемость бактерий и на их способность распространяться на поверхности корней растений и в почве (Bowers J., Parke J., 1993). В то же время, при неравномерном распределении в почве питательных веществ преимущество в колонизации корней имеют активно подвижные псевдомонады (Boelens J., Vande М, 1993).
Маркирование природного ризосферного штамма P. fluorescens 2137 геном глюкуронидазы
Маркирование штамма P. fluorescens 2137 геном gusA20 осуществляли путем конъюгации, используя штамм Escherichia coli SI7-1 A.-pir в качестве донора пдазмиды pmTn5SSgra/i20, несущей ген устойчивости к спектииомицину и ген gusA20, кодирующий фермент /2-глюкуронидазу, в составе транспозона Тп5.
Скрещивание бактерий проводили путем совместного культивирования бактериальных суспензий Е. coli и P. fluorescens 2137 на агаризованной среде LB в чашках Петри с последующей селекцией трансконъюгантов на среде LO со спектиномицином (Рисунок З.1.). Эффективность переноса плазмиды составила 2,0x10" . На среде с X-glc трансконьюганты P.fluorescens, несущие ген gusA, образовывали колонии синего цвета.
У штамма P. fluorescens 2137 и его 38 gusA- производных изучены основные биологические свойства, описанные в "Определителе бактерий Берджи" (1997). Все маркированные штаммы не отличались от дикого штамма 2137 - типичного представителя P. fluorescens биовара II - по морфологическим, тинкториальным и некоторым культуральным и биохимическим свойствам (рост на средах без источника азота; гидролиз крахмала и мочевины; использование в качестве источника углерода D ксилозы, р-аланина, L- аргинина, цитрата натрия, сахарозы и мезо-инозитола; аргинина, цитрата источника азота) (Таблица 3.1).
Так, штамм P. fluorescens 2137 и его -маркированные производные росли на средах без азота (Эшби, LO и NFB). Оксидазная, уреазная и амилолитическая активность, денитрификация и способность использовать в качестве источника углерода некоторые углеводы (D-ксилозу, сахарозу, мезо-инозитол), аминокислоты (DL-a-аланин и L-аргинин) и цитрат натрия проявлялись одинаково как у природного штамма P. fluorescens 2137, так и у всех gusA- штаммов.
Вместе с тем, gM -штаммы не были однородны по ряду признаков, приведенных в таблице 3.1. У маркированных штаммов интенсивность цвета колоний на питательной среде с X-glc и интенсивность флюоресценции была неодинаковой. Штаммы gusA различались по способности роста при критической температуре (37С) на картофельном агаре. Так, у половины из них, как и у штамма 2137, видимый рост отмечен на первые сутки; у 16 (42%) -на вторые сутки; один штамм вырос лишь через четверо суток; два штамма -(2\gusA и AlgusA) не выросли вовсе (Таблица 3.1). Более половины из 38 gusA-маркированных штаммов в качестве источника углерода использовали L-рамнозу, аминокислоты L-серин и L-валин (Таблица 3.1). Слабый рост с подщелачиванием был отмечен на средах с L-рамнозой, L-серином и L-валином у семи (18%), шести (16% ) и 17 (45%) шЛ-маркированных штаммов, соответственно. При этом три штамма на среде с L-рамнозой не росли. В качестве источника углерода a-кетоглутаровую кислоту были способны использовать 16 (42%) gusA -маркированных штаммов. Штамм P. fluorescens 2137 и большинство gusA-штшмов росли на среде с тартратом аммония (Таблица 3.1).
Все gws -маркированные штаммы обладали менее выраженной протеолитйческой активностью, чем P. fluorescens 2137: ризосферный штамм разжижал желатин на 11-е, три gw -штамма - на 18-е, 35 (92%) - лишь на 25-е сутки роста (Таблица 3.1). Штаммы, маркированные геном /?-глюкуронидазы, сохраняли способность с различной скоростью расщеплять казеин при росте на лакмусовом молоке. Так, у природного штамма P. fluorescens 2137 и трех (8%) штаммов (3gusA, ASgusA, A9gusA) отделение сыворотки наблюдали на 12-е сутки; у большинства штаммов (79%) - на 15-е - 19-е и у пяти штаммов (13%) -лишь на 43-и сутки. Полную пептонизацию в случае штамма P.fluorescem 2137 и большей части (74%) gusA- штаммов отмечали на 12-е сутки (Таблица 3.1).
Результаты исследования биологических свойств -маркированных штаммов представлены в виде дендрограммы (Рисунок 3.2). Из рисунка видно, что все gusA- штаммы отличались от штамма P. fluorescens 2137 и различались между собой. Штаммы со сходными культурально-биохимическими свойствами входили в состав субкластеров 1,2,3 и 4 (коэффициенты сходства более 80%о) и вместе со штаммом ISgusA образовали крупный кластер Л, который включал 33 из 38 (87% ) gusA -маркированных штаммов и дикий штамм 2137. При этом штаммы 4&gusA и 3gusA, а также другие штаммы субкластера 3, оказались наиболее близкими к дикому штамму, в отличие от штаммов других субкластеров. Кластер В представлен пятью gus А-штаммшн, которые существенно отличались (коэффициент сходства 20% ) от штаммов кластера А (Рисунок 3.2), в частности, по протеолитической активности при росте на лакмусовом молоке (Таблица 3.1). Более того, штаммы AgusA и 1 \gusA кластера В утратили жизнеспособность через год. Маркированные штаммы кластера А сохраняли жизнеспособность при хранении на среде со спектиномицином и культивировании в лабораторных условиях в течение двух лет (срок наблюдения).
Влияние P. fluorescens на энергию прорастания, всхожесть семян и биометрические показатели проростков огурца in vitro
Так, интенсивность цвета колоний gusA-штшмов на питательной среде с X-glc была неодинаковой. Это свидетельствует о гетерогенности популяций маркированных штаммов по признаку экспрессии гена Д-глюкуронидазы, определяемой стабильностью маркера gusA и его местоположением на хромосоме бактерий (Wilson К., 1995).
Высокая интенсивность флюоресценции бактерий, зависящая от количества продуцируемого P. fluorescens желто-зеленого пигмента -псевдобактина (пиовердина), отличала 13 (34%) из 38 маркированных штаммов от дикого штамма 2137 (Таблица 3.1). Это представляется важным, поскольку пигмент, будучи сидерофором, обеспечивает фунгистатическое действие Р. fluorescens за счет создания дефицита железа для фитопатогенных грибов (Смирнов В.В., Киприанова Е.А., 1990).
Штаммы gusA различались по способности роста при критической температуре (37С) на картофельном агаре, способности использовать в качестве источника углерода L-рамнозу, аминокислоты L-серин и L-валии. Интересно, что более 40% gw -маркированных штаммов, в отличие от родительского штамма, были способны использовать в качестве источника углерода а-кетоглутаровую кислоту. Кроме того, все -маркированные штаммы обладали менее выраженной протеолитической активностью, чем Р. fluorescens 2137 (Таблица 3.1). Штаммы, маркированные геном /3-глюкуронидазы, расщепляли казеин, но с различной скоростью (Таблица 3.1).
Таким образом, интродукция гена gusA, опосредованная трапспозоном, привела к изменению некоторых культуральных и биохимических свойств gM -маркированных штаммов - производных P. fluorescens 2137. По И из 34 изученных признаков шт4-маркированные штаммы, в той или иной мере, отличались от ризосферного штамма P. fluorescens 2137 и различались между собой. Число таких признаков составляло, в среднем, шесть у 21% штаммов и варьировало от трех у штаммов 3gusA, и lAgusA до девяти у штамма 43gusA (Таблица 3.1).
Компьютерная обработка полученных данных с использованием пакета программ Taxotron выявила высокую степень родства по культурально-биохимическим свойствам 87% изученных -маркированных штаммов и штамма 2137 (Рисунок 3.2).
Поскольку антагонизм микроорганизмов в отношении фитопатогенной микрофлоры является основой биологического метода защиты растений (Lugtenberg В. et al, 2001; Gamalero Е. et al., 2003), у штамма P.fluorescens 2137 и его и -маркированных производных была изучена антагонистическая активность в отношении фитопатогенных грибов F. culmorum, F. oxysporum, F. gramineamm и V. nigrescens (Таблица 3.2). Известно, что выраженная фунгицидность бактерий P. fluorescens связана с продукцией сидерофоров (флюоресцирующих пигментов типа пиовердина), участвующих в транспорте железа, антибиотиков и хитинолитических ферментов (Boruah К, Kumar В., 2002; Siddiqui I., Shaukat S., 2003; Jousset A. et al., 2006).
Антифунгальная активность gw -штаммов P. fluorescens в отношении всех изученных видов фитопатогенных грибов различалась. При этом у половины шт1-маркированных штаммов она была менее выражена, чем у штамма 2137; пять штаммов (3gusA, lAgusA и 49gusA) вообще не подавляли рост F. culmorum. Напротив, антифунгальная активность штаммов IgusA, A\gusA и 46gusA превосходила таковую штамма 2137. Интересно, что среди перечисленных оказались штаммы, наиболее близкие по культурально-биохимическим свойствам к ризосферному штамму P. fluorescens 2137, который проявлял высокую антагонистическую активность (Рисунок 3.2).
По сравнению с F. culmorum F. oxysporum и F. graminearum оказались более устойчивыми к воздействию gw -штаммов псевдомонад. При этом половина штаммов, маркированных геном /?-глюкуронидазы, полностью утратила ингибирующую активность в отношении фитопатогена V. nigrescens.
В целом, наиболее активно подавляли рост фитопатогенных грибов gusA-маркированные штаммы P. fluorescens 25gusA, 4\gusA и 5gusA. Это послужило основанием для дальнейшего исследования их биоконтрольных и ростостимулирующих свойств.
Прежде всего, следовало изучить характер влияния псевдомонад на рост и развитие растений, начиная с самого раннего этапа - прорастания семян. Этот процесс подразумевает выход семян из состояния анабиоза и переход зародыша к дальнейшему развитию (Васько В.Т., Загробский А.И., 2002). Прорастание начинается с поглощения семенем воды и заканчивается образованием у проростка ассимиляционной поверхности, обеспечивающей его самостоятельное существование. Во время прорастания в семенах происходит ряд физиологических процессов: поглощение воды, активация и синтез ферментов, изменение интенсивности дыхания, распад запасных веществ, перемещение питательных веществ к точке роста, начало деления и дифференциации клеток, приводящие к формированию тканей и органов растения. Согласно И.Г. Строна (1966), процесс развития проростка включает пять фаз: водопоглощение, набухание семян, рост первичных корешков, развитие ростка и становление проростка. Другие авторы выделяют три этапа прорастания семян: активация метаболизма (этап физического набухания); подготовка к началу роста растяжением (наклевывание семян за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша); собственно рост органов проростка (Обручева Н.В., Антипова О.В., 1994). Данный этап развития растений характеризуют всхожесть - количество семян, нормально проросших за определенный срок при оптимальных условиях проращивания, выраженное в процентах, и энергия прорастания - дружность и быстрота появления нормальных проростков за более короткий срок, чем всхожесть (Строна И.Г., 1966). Всхожесть семян огурца определяют на седьмые сутки, энергию прорастания - на третьи сутки (ГОСТ 12038-84).
