Введение к работе
Актуальность проблемы. Yersinia pestis – возбудитель чумы – является этиологическим фактором природно-очагового заболевания, к которому чувствительны более 200 видов грызунов. Нозоареалы этой инфекции распространены по всем странам и континентам (кроме Австралии). При обширных эпизоотиях возбудитель может передаваться синантропным грызунам, что увеличивает опасность антропогенного распространения инфекции. Особую опасность представляют легочные и септические формы чумы, сообщения о которых встречаются в последние десятилетия. Так, в 2004 г. легочная чума регистрировалась в Уганде (Begier E.M.et al., 2004); в 2006 г. – в четырех штатах США было 13 случаев чумы, два из которых с летальным исходом (Wkly Epidem. Rec, 2006); в том же 2006 г. в ДР Конго было зарегистрировано 100 случаев легочной чумы (Wkly Epidem. Rec, 2006). Летом 2009 года сообщалось о случаях легочной чумы на Северо-Западе Китая (WHO | Plague in China, 2009). В июле 2010 года в Перу зарегистрировано 17 случаев чумы (WHO | Plague in Peru, 2010). При возможностях современного транспорта и широких международных связях реальна угроза завоза заболевания в Россию в течение срока инкубации у инфицированных и возникновения вспышки заболевания среди людей.
Рекомендуемый в настоящее время арсенал средств этиотропной терапии чумы определен МУ 3.4.2552-09 (2009). Для большинства антибактериальных препаратов доказана эффективность не только в экспериментах на животных, но и при лечении чумы у людей (Perlman D.C. et al., 2002; Boulanger L.L. et al., 2004). К настоящему времени показано снижение эффективности антибактериальной терапии при экспериментальной чуме у мышей, вызванной антигенизмененными (FI-, FI-Tox-) штаммами возбудителя (Рыжко И.В. с соавт., 1998 и др.). При этом доказана нецелесообразность применения таких препаратов, как ампициллин, тетрациклин, доксициклин, т.к. они не освобождают макроорганизм от инфекта (FI- вариант возбудителя), что может вызвать рецидив инфекции (Люкшина Е.Ю., 2004). Поиск антибиотиков, эффективных при инфекции, вызванной не только типичным в антигенном отношении возбудителем, но и его вариантами, утратившими способность продуцировать капсульный антиген FI, является актуальным.
Сообщения B. Rasoamanana et al. (1989), E.F. Lyamuya et al. (1992) , J.D. Wong et al. (2000), T.V. Inglesby et al. (2000) об устойчивости клинических изолятов чумного микроба к стрептомицину, тетрациклину, триметоприму, рифампицину и обнаружение трансмиссивной множественной лекарственной устойчивости, кодируемой R-плазмидами, у двух культур возбудителя, вызвавших случаи заболевания чумой на о. Мадагаскар (Galimand M. et al., 1997; Guyoule et al., 2001), вызывают большую озабоченность специалистов и требуют внедрения в практику лечения чумы новых высокоэффективных антибактериальных препаратов. Кроме того, в настоящее время имеется реальная угроза биотерроризма, а чумной микроб (особенно его антигенизмененные формы) представляет наибольшую опасность (Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; Воробьев А.А., 2001; Гремякова Т.А., 2004).
Чрезвычайная эпидситуация, которая может возникнуть в природных очагах чумы, при заносе инфекции из других стран или в результате актов биотерроризма, потребует большого количества средств для экстренной профилактики и лечения этого тяжелого высококонтагиозного заболевания. Результаты имитационного учения в США (Inglesby T. et al., 2001) по оценке деятельности всех служб в ликвидации акта биотерроризма, агентом которого был определен возбудитель чумы, показали, что одной из основных проблем, с которой придется столкнуться – это серьезный дефицит антибактериальных препаратов. Внедрение в практику новых средств экстренной профилактики и лечения чумы может способствовать уменьшению дефицита антибактериальных препаратов широкого спектра действия, необходимых для ограничения и ликвидации очага инфекции.
В связи с изложенным внедрение в медицинскую практику новых представителей разных групп антибактериальных препаратов с широким спектром и пролонгированным характером действия требует их изучения для расширения арсенала средств этиотропной терапии чумы.
Цель работы. Провести оценку эффективности антибактериальных препаратов из группы аминогликозидов (нетилмицин), карбапенемов (имипенем, меропенем), цефалоспоринов III-IV поколений (цефиксим, цефтибутен, цефепим), фторхинолонов II-III-IV поколений (ломефлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин) и отбор наиболее перспективных для этиотропной терапии чумы; стандартизировать методы определения антибиотикограмм чумного микроба.
Основные задачи исследования.
1. Изучить чувствительность 20 FI+ и 30 FI- штаммов возбудителя чумы к представителям аминогликозидов, карбапенемов, цефалоспоринов III-IV поколений, фторхинолонов в опытах in vitro.
2. Оценить эффективность антибактериальных препаратов при экспериментальной чуме белых мышей, вызванной Y. pestis 231 и его изогенным вариантом 231 FI-, и дать сравнительную характеристику их профилактической и лечебной активности в сравнении с другими представителями соответствующих групп антибиотиков:
- нетилмицина в сравнении с другими аминогликозидами;
- имипенема и меропенема (карбапенемы) в сравнении с ампициллином;
- цефиксима, цефтибутена (цефалоспорины III поколения), цефепима (IV поколения) в сравнении с ранее изученными цефтриаксоном, цефотаксимом, цефтазидимом;
- фторированных хинолонов – ломефлоксацина, левофлоксацина, моксифлоксацина в сравнении с ранее изученными ципрофлоксацином, офлоксацином, пефлоксацином.
3. Оптимизировать методические подходы к определению антибиотикограмм возбудителя чумы с учётом обязательного проведения внутреннего лабораторного контроля качества исследования и разработать критерии интерпретации результатов (чувствительность/устойчивость) для трех питательных сред: агар Мюллера-Хинтона, Хоттингера, АГВ.
Научная новизна. В ходе исследований впервые доказано:
- штаммы чумного микроба независимо от фенотипа (20 FI+ и 30 FI-) чувствительны к представителю аминогликозидов – нетилмицину, карбапенемам (имипенему, меропенему), цефалоспоринам III-IV поколений (цефиксиму, цефепиму, цефтибутену), фторхинолонам (ломефлоксацину, левофлоксацину, моксифлоксацину);
- нетилмицин – аминогликозид, устойчивый к действию инактивирующих ферментов, высокоэффективен при экспериментальной чуме, обусловленной как FI+, так и FI- штаммами возбудителя, и перспективен в качестве средства этиотропной терапии этой инфекции;
- при наличии чувствительности чумного микроба in vitro к карбапенемам штаммы возбудителя вызывают у белых мышей инфекционный процесс, при котором эффективность имипенема и меропенема сопоставима с ампициллином, что не позволяет рекомендовать карбапенемы для профилактики и лечения чумы, дополнительно учитывая их высокую стоимость;
- сравнительное изучение эффективности оральных форм цефалоспоринов III поколения цефиксима и цефтибутена выявило значительные преимущества первого по показателям ЕД50, эффективности при инфекции, вызванной не только FI+, но и FI- возбудителем, в то время как цефтибутен, обеспечивая 90-100% выживание мышей, при лечебных дозах, соответствующих максимальным терапевтическим человекодозам, не санирует в достаточной мере макроорганизм от инфекта. В связи с этим, для экстренной профилактики и лечения чумы может быть перспективен только цефиксим;
- цефепим (цефалоспорин IV поколения) высокоэффективен при экспериментальной чуме белых мышей, обусловленной как FI+,так и FI- возбудителем, может пополнить арсенал средств этиотропной терапии чумы;
- ломефлоксацин не имеет преимуществ перед ципрофлоксацином, офлоксацином и может использоваться в максимальных терапевтических дозах и сроком не менее 7 сут.;
- в отличие от ранее изученных фторхинолонов (ципрофлоксацина, офлоксацина, пефлоксацина) левофлоксацин и моксифлоксацин высокоэффективны не только при инфекции, обусловленной типичным по антигенному составу штаммом чумного микроба, но и в 5-дневной профилактике экспериментальной чумы, вызванной FI- вариантом возбудителя, обеспечивая санацию макроорганизма от инфекта (контрольное внутрибрюшинное введение выжившим мышам гидрокортизона).
В результате проведенных исследований впервые:
- разработаны ориентировочные схемы экстренной профилактики, лечения бубонной, септической и легочной форм чумы нетилмицином, цефиксимом, цефепимом, ломефлоксацином, левофлоксацином и моксифлоксацином;
- стандартизированы условия определения антибиотикограмм возбудителя чумы для трех питательных сред (две отечественного производства); разработаны критерии интерпретации результатов исследования – отнесения штаммов к разряду чувствительных/устойчивых на основе сопоставления чувствительности штаммов чумного микроба in vitro и эффективности антибактериальных препаратов in vivo; даны диапазоны значений МПК и зон ингибиции роста для 50 антибиотикочувствительных штаммов возбудителя чумы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Показано, что высокая чувствительность штаммов чумного микроба к антибактериальным препаратам, в частности к карбапенемам (имипенему, меропенему), цефтибутену, не всегда коррелирует с высокой эффективностью in vivo и особенно, если инфекция вызвана возбудителем с FI- фенотипом. Это свидетельствует о возможности применения для экстренной профилактики и лечения чумы только тех антибактериальных препаратов, эффективность которых доказана в терапии экспериментальной чумы.
Сравнительное изучение эффективности антибактериальных препаратов позволяет определить приоритетность их выбора для этиотропной терапии чумы: в группе аминогликозидов – нетилмицин; в группе беталактамов – цефтриаксон, цефиксим, цефепим; в группе фторхинолонов – левофлоксацин, моксифлоксацин.
Полученные в ходе настоящего исследования результаты позволили оформить раздел по чуме в Методических указаниях «Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам» (МУ 4.2. 2495 – 09).
Разработаны: 1) методические рекомендации «Ориентировочные схемы применения цефепима и цефиксима для экстренной профилактики и лечения чумы, вызванной типичными штаммами чумного микроба и их антигенизмененными (FI-) вариантами»; 2) методические рекомендации «Ориентировочные схемы применения ломефлоксацина, левофлоксацина и моксифлоксацина для экстренной профилактики и лечения чумы, вызванной типичными штаммами чумного микроба и их антигенизмененными (FI-) вариантами», рассмотрены Учёным Советом Ростовского НИПЧИ и утверждены директором института (протокол № 14 от 18.12.2009 г.).
Основные положения, выносимые на защиту.
-
При анализе антибиотикограмм 20 FI+ и 30 FI- штаммов чумного микроба определена их чувствительность к нетилмицину (группа аминогликозидов), к карбапенемам (имипенем, меропенем), цефалоспоринам III поколения – цефиксиму, цефтибутену, цефалоспорину IV поколения – цефепиму и фторхинолонам – ломефлоксацину, левофлоксацину и моксифлоксацину.
-
При экспериментальной чуме белых мышей, вызванной возбудителем с FI+ и FI- фенотипом, показана высокая эффективность нетилмицина, цефиксима, цефепима, что позволяет считать их перспективными для расширения арсенала средств этиотропной терапии чумы в отличие от карбапенемов, эффективность которых сравнима с ампициллином, но стоимость значительно выше.
-
Представитель фторхинолонов ломефлоксацин по эффективности сравним с ранее изученными ципрофлоксацином и офлоксацином и может быть использован в максимальных терапевтических дозах курсом не менее 7 сут., в то время как левофлоксацин и моксифлоксацин более эффективны, санируют макроорганизм от возбудителя и перспективнее в экстренной профилактике чумы при курсе 5 сут.
-
Оптимизированы подходы к определению антибиотикограмм возбудителя чумы с учётом осуществления внутрилабораторного контроля качества исследования, предложены критерии интерпретации результатов определения антибиотикограмм на агаре Мюллера-Хинтона, Хоттингера и АГВ.
Апробация работы: результаты исследования по теме диссертации были доложены на: научных конференциях молодых ученых Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института в 2008-2010 гг.; заседаниях Ученого совета РостНИПЧИ 2009-2010 гг.; Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: Современные проблемы диагностики и лечения» – Санкт-Петербург, 2008 г.; IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников содружества независимых государств» – Волгоград, 2008 г.; IV Общероссийской научной конференции «Современные проблемы науки и образования», Москва, 2009 г.; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», Оболенск, 2009 г.; XI Международном конгрессе MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии, Москва, 2009 г. (где получена грамота за первое место среди постерных сообщений); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней», посвященной 75-летнему юбилею ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока», Иркутск, 2009 г.; юбилейной научно-практической конференции, посвященной 100-летию Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Ростов-на-Дону, 2009 г.; XII Международном конгрессе MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии, Москва, 2010 г.; научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», Оболенск, 2010 г.
Диссертационная работа выполнена в рамках завершенной государственной темы № ГР 01.2.006.05688 «Экспериментальная оценка перспектив расширения арсенала средств этиотропной терапии чумы и туляремии за счет новых представителей различных групп антибактериальных препаратов», где автор является ответственным исполнителем в части I отчёта (Чума). Заключительный отчёт по теме утверждён Межведомственным совещанием по проблемам санитарно-эпидемиологической охраны территории Российской Федерации (октябрь 2010 г.).
План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора (протокол № 7 от 9.04.2009 г.).
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликованы 11 работ, в том числе 3 в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание искомой ученой степени.
Структура работы. Диссертация изложена на 186 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 320 библиографических источника, из которых 181 – отечественных, 139 – иностранных. Работа проиллюстрирована 55 таблицами.
