Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 13
1.1. Распространённость туберкулёза и основные схемы его лечения 13
1.2. Противотуберкулёзные препараты группы рифамицинов -достоинства и недостатки 17
1.3. Основные стратегии в разработке новых противотуберкулёзных препаратов 23
1.4. Наносистемы транспорта для рифамицинов
1.4.1. Полимерные наночастщы и мицеллы 28
1.4.2. Липосомы как системы транспорта рифамицинов 31
1.4.3. Твёрдые липидные наночастщы 37
1.4.4. Ниосомы 38
1.4.5. Наноэмульсии 38
1.4.6. Другие виды наночастиц 39
1.5. Жирные кислоты как потенциальные компоненты наносистемы для транспорта противотуберкулёзных препаратов 41
1.5.1. Влияние жирных кислот на фосфолипидные структуры (липосомы, везикулы) 41
1.5.2. Биологические эффекты жирных кислот и их солей, существенные для использования их в качестве компонентов систем доставки лекарств 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы 50
2.1. Основные материалы 50
2.2. Методы 51
2.2.7. Получение образцов транспортных систем и лекарственных композиций, снабжённых транспортными системами 51
2.2.1.1. Получение образцов рифамицинов, встроенных в фосфолипидную транспортную наносистему 51
2.2.1.2. Получение образцов рифамицинов, встроенных в транспортную наносистему на основе фосфолипида и олеата натрия/олеиновой кислоты 51
2.2.1.3. Получение образцов транспортной системы с различным соотношением фосфолипид/олеат натрия 52
2.2.1.4. Получение образцов рифампицина, встроенного в транспортную наносистему на основе фосфолипида и натриевых солей различных жирных кислот 52
2.2.1.5. Получение образцов с одинаковым соотношением фосфолипид/олеат натрия и различным количеством рифампицина 53
2.2.1.6. Получение образцов фосфолипидной и фосфолипидно-олеатной транспортной наносистемы (ФТН и ФОТН)
2.2.1.7. Получение композиций ФОТН-рифамицинов 54
2.2.2. Определение физико-химических характеристик 55
2.2.2.1. Светопропускание 55
2.2.2.2. Размер (диаметр) наночастиц 55
2.2.2.3. Дзета-потенциал 56
2.2.2.4. Содержание лекарства в композиции 56
2.2.2.5. Процент включения рифамицинов 57
2.2.2.6. Изучение стабильности ФОТН 57
2.2.3. Исследование фармакокинетических свойств композиций рифамицинов, снабжённых фосфолипидно-олеатной транспортной наносистемой (ФОТН)... 58
2.2.3.1. Биодоступность рифамицинов при их пероральном введении в составе ФОТН 58
2.2.3.2. Накопление в органах рифамицинов при их пероральном введении в составе ФОТН 60
2.2.3.3. Распределение рифампицина в составе ФОТН по компонентам плазмы крови 61
2.2.5. Исследование специфической активности композиций ФОТН-рифамицинов
2.2.5.1. Антимикобактериальная активность in vitro композиции ФОТН-рифампицина 62
2.2.5.2. Противотуберкулёзное действие in vivo композиций ФОТН-рифамицинов 63
2.2.6. Исследование общей токсичности композиции ФОТН-рифампщина 66
2.2.6.1. Токсичность композиции ФОТН-рифампицина при внутрижелудочном введении .66
2.2.6.2. Токсичность композиции ФОТН-рифампицина при внутривенном введении 67
2.2.7. Статистическая обработка экспериментальных данных 68
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 69
3.1. Разработка наносистемы транспорта рифамицинов на основе фосфолипидов и жирных кислот 69
3.1.1. Получение образцов рифамицинов, встроенных в фосфолипидную транспортную наносистему 70
3.1.2. Получение образцов рифамицинов, встроенных в транспортную наносистему на основе фосфолипида и олеиновой кислоты 73
3.2. Оптимизация состава наносистемы транспорта на основе
фосфолипидов и жирной кислоты 76
3.2.1. Сравнительное исследование по использованию натриевой соли олеиновой кислоты в составе фосфолипидной транспортной наносистемы 76
3.2.2. Определение оптимального соотношения фосфолипид/жирная кислота... 78
3.2.3. Сравнительное исследование влияния жирной кислоты в составе транспортной наносистемы на биодоступность лекарственного соединения .81
3.2.4. Определение оптимального соотношения фосфолипид/лекарство 85
3.3. Физико-химические свойства фосфолипидно-олеатной транспортной наносистемы (фотн) 87
3.4. Получение композиций рифамицинов, снабжённых фосфолипидно-олеатной транспортной наносистемой, и их характеристика 92
3.5. Фармакокинетические свойства композиций фотн-рифамицинов
3.5.1. Влияние встраивания в ФОТН на биодоступность рифамицинов 100
3.5.2. Влияние встраивания в ФОТН на накопление рифамицинов в тканях 103
3.5.3. Влияние встраивания рифампицина в ФОТН на его распределение по компонентам плазмы крови 105
3.6. Специфическая активность композиций фотн-рифамицинов 108
3.6.1. Исследование in vitro антимикобактериальнои активности композиции ФОТН-рифампицина 108
3.6.2. Исследование in vivo противотуберкулёзной активности композиций ФОТН-рифамицинов 112
3.7. Изучение токсичности фотн-рифампицина 116
3.7.1. Исследование токсичности композиции ФОТН-рифампицина при внутрижелудочном введении 116
3.7.1.1. Исследование острой токсичности 116
3.7.1.2. Исследование субхронической токсичности 117
3.7.2. Исследование токсичности композиции ФОТН-рифампицина при внутривенном введении 118
Заключение 119
Выводы 122
Публикации по теме диссертации 123
Список литературы
- Наносистемы транспорта для рифамицинов
- Получение образцов транспортных систем и лекарственных композиций, снабжённых транспортными системами
- Исследование общей токсичности композиции ФОТН-рифампщина
- Получение композиций рифамицинов, снабжённых фосфолипидно-олеатной транспортной наносистемой, и их характеристика
Введение к работе
Актуальность работы. Повышение эффективности существующих лекарств путём разработки для них систем транспорта с применением нанотехнологий -современное, активно развивающееся направление биомедицинских наук. Для ряда агентов, например, противоопухолевых, уже имеются формы с системами транспорта (липосомальные), которые широко востребованы. Однако для противотуберкулёзных препаратов и, в частности, для препаратов группы рифамицинов такие формы отсутствуют. Необходимость их разработки обусловлена такими фактами, как: (1) высокая распространённость туберкулёза и смертность от туберкулёза; (2) важное место, которое занимают лекарства группы рифамицинов в терапии этого заболевания; (3) существенные недостатки, ограничивающие использование этих препаратов; (4) отсутствие на фармацевтическом рынке новых антибиотиков, способных составить альтернативу рифамицинам. За последнее время появилось множество работ по конструированию различных систем транспорта для рифампицина, в меньшей степени, для его аналогов - рифабутина и рифапентина. Наиболее распространённый тип носителей для пероральных форм рифампицина -полимерные наночастицы, для инъекционных и ингаляционных форм -липосомы.
Ряд исследований показывает, что наночастицы (с размером менее 100 нм) имеют определённые преимущества при доставке лекарств перед более крупными частицами (Seki et al., 2004; Moghimi et al., 2001; Wang et al., 2010). Они способны дольше циркулировать в крови, лучше проникать в поражённые области и др. В ФГБУ "ИБМХ" РАМН разработана оригинальная фосфолипидная транспортная наносистема с размером частиц до 30 нм (Патент РФ №2391966, Патент РФ №2406537). Включение лекарственных субстанций в такие наночастицы оказывает существенное влияние на их фармакокинетику, способствуя повышению терапевтической эффективности (Ипатова и др., 2010; Широнин и др., 2011; Zykova et al., 2012). Однако включение соединений группы рифамицинов в наночастицы на основе только фосфатидилхолина не позволяло получить стабильную композицию с высоким содержанием транспортируемого лекарства. В связи с этим возникла необходимость оптимизировать состав фосфолипидной транспортной системы так, чтобы при
минимальном размере наночастиц (до 50 нм) включение в них лекарственных субстанций группы рифамицинов было максимальным. Это должно обеспечить прохождение транспортируемого лекарства через высоко гидрофобную клеточную стенку микобактерий для реализации специфического механизма действия рифамицинов, которое заключается в ингибировании бактериальной РНК-полимеразы. Свойства разрабатываемой системы должны способствовать повышению биодоступности рифамицинов, их накоплению в легких и доставке в альвеолярные макрофаги.
Настоящая работа выполнена в рамках госконтракта № 8338р/13241 от 31 августа 2010 года "Разработка технологии получения инновационных высокоэффективных противотуберкулёзных лекарственных средств на основе фосфолипидной транспортной наносистемы".
Цель работы: на основе фосфолипидных наночастиц разработать систему транспорта для противотуберкулёзных препаратов группы рифамицинов и доказать ее эффективность. Задачи:
-
Разработать на основе фосфолипидных наночастиц и жирных кислот систему транспорта для рифампицина, рифабутина и рифапентина и определить её физико-химические характеристики.
-
Определить условия максимального встраивания рифамицинов в разработанную транспортную наносистему. Получить соответствующие лекарственные композиции и исследовать их физико-химические свойства.
-
Провести исследования некоторых фармакокинетических параметров полученных лекарственных композиций (биодоступность, распределение по органам, связывание с компонентами плазмы крови и др.) в сравнении со свободными лекарственными субстанциями.
-
Исследовать в экспериментах in vitro и in vivo специфическую активность полученных композиций рифамицинов.
-
Оценить изменения токсичности на примере рифампицина при его встраивании в разработанную систему транспорта.
Научная новизна. Получена на основе фосфатидилхолина и олеата натрия принципиально новая система транспорта лекарств, которая представляет собой стабильную монодисперсную наноэмульсию с размером частиц менее 20 нм. Определены основные физико-химические характеристики этой системы. Разработаны условия включения рифампицина, рифабутина и
рифапентина в наносистему транспорта, и получены композиции этих лекарственных препаратов в сухом лиофилизированном виде.
Впервые удалось получить транспортную систему, способствующую максимальному увеличению противотуберкулёзной эффективности рифамицинов, наряду со снижением их токсического побочного действия. Предельно малый размер наночастиц транспортной системы обеспечивает доставку рифамицинов внутрь клетки и реализацию их механизма действия.
По результатам работы получено 2 патента. Практическая значимость. Способ получения рифампицина, снабжённого фосфолипидно-олеатной наносистемой транспорта, масштабирован и оптимизирован в условиях опытного производства. Получены лекарственные композиции рифампицина для перорального и внутривенного введения, доклинические испытания которых проходят в настоящее время в рамках ФЦП "Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу" (Госконтракт № 14.N08.11.0004 от 20.11.2012). Выполнение Госконтракта позволит в достаточно короткие сроки и с меньшими экономическими затратами вывести на фармрынок новую, оригинальную форму рифампицина, отличающуюся высокой противотуберкулёзной эффективностью и сниженными побочными действиями, что даст возможность уменьшить применяемые терапевтические дозы лекарства, разработать новую, эффективную схему химиотерапии туберкулёза.
Разработанная наносистема транспорта является универсальной и может быть использована для получения новых лекарственных форм препаратов других терапевтических групп.
Апробация. Основные положения диссертационной работы были доложены на XII международной научно-практической конференции "Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности" (Санкт-Петербург, Россия, 2011); на конкурсе молодых учёных международной научно-практической конференции "Фармацевтические и биомедицинские технологии" (Москва, Россия, 2012); на VII Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах, определённых ВАК, 2 патента РФ, 3 публикации в сборниках докладов научных конференций.
Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах печатного текста, содержит 15 рисунков и 21 таблицу, состоит из введения, трёх глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 190 источников.
Наносистемы транспорта для рифамицинов
С момента введения в клиническую практику в 1968 году первого их них, рифампицина, до настоящего времени эти препараты составляют основу терапии туберкулёза. Применение рифампицина в составе комбинированной терапии в 70-х гг. позволило сократить продолжительность лечения в два раза - с 18 до 9 месяцев. Современный вид химиотерапия приобрела с включением в неё в 80-х гг. пиразинамида. Рифабутин стал использоваться в медицине с 1992 года, рифапентин - с 1998 года.
Антибиотики группы рифамицинов обладают высокой бактерицидной активностью по отношению к широкому спектру Грам-положительных бактерий (стрептококки, энтерококки, стафилококки и др.) и, в меньшей степени, к Грам-отрицательным бактериям, а также способны воздействовать на некоторые типы вирусов. Но особое значение имеет их мощное, стерилизующее действие против микобактерий. Рифампицин и его аналоги способны уничтожать активно размножающиеся микроорганизмы, находящиеся вне клеток в очагах поражения, микобактерий внутри макрофагов и бациллы с пониженной активностью, персистирующие в тканях [Chaisson, 2003]. Это обусловлено, во-первых, строением рифамицинов. В отличие от других противотуберкулёзных препаратов первого ряда, рифамицины являются цвиттер-ионами, а не основаниями и имеют более высокие значения logP, т.е. более высокую липофильность, что позволяет им преодолевать мембранный барьер клеток и проникать не только в основное место локализации микобактерий — альвеолярные макрофаги [Acocella et al., 1985; Carl one et al., 1985], но и внутрь бацилл [Kolyva и Karakousis, 2012]. Во-вторых, высокая антибактериальная активность рифампицина обусловлена уникальным механизмом его действия, который, как полагают, состоит в стерическом блокировании ДНК-зависимой РНК-полимеразы, что препятствует удлинению РНК-цепи более чем на 2-3 нуклеотида [Aristoff et al., 2010; Feklistov et al., 2008]. Причём ингибирование оказывается специфическим для прокариот, для которых константа связывания рифампицина с (3-субъединицей РНК-полимеразы как минимум в 10000 раз выше, чем для клеток эукариот [Aristoff et al., 2010].
Биодоступность рифампицина и рифапентина у человека составляет около 70%, в то время как для рифабутина она существенно ниже (всего 20% ) [Aristoff et al., 2010; Sana и Kole, 2005; Burman et al., 2011]. Особенностью рифампицина, снижающей его биодоступность при пероральном введении, является его низкая растворимость при нейтральных значениях рН (1-2 мг/мл), что на порядок ниже, чем у пиразинамида, и в 100 раз ниже, чем у изониазида и этамбутола [Sosnik et al., 2010]. В кислой же среде, при рН 1-2, растворимость рифампицина существенно выше [Du Toit et al., 2006]. За счёт этого он, в отличие от большинства лекарств, слабо абсорбируется в тонком кишечнике, но начинает всасываться ещё в желудке, в целом поглощаясь из желудочно-кишечного тракта быстрее, чем рифабутин и рифапентин.
Необходимо отметить, что в кислой среде желудка, наряду с всасыванием, происходит частичное разложение (гидролиз) рифампицина с образованием менее растворимых соединений - 3-формилрифампицина SV и 1-амино-4-метилпиперазина [Sosnik et al., 2010]. Показано, что за время пребывания в желудке, которое может составить от 15 минут до 3-х часов (для некоторых таблетированных или капсульных форм до 6 часов), степень гидролиза рифампицина варьирует от 8,5 до 50% [Du Toit et al., 2006]. В кишечнике, при значениях рН 7.4-8.2, молекула рифампицина дезацетилируется и/или окисляется до нерастворимого производного хинона, что оказывает существенное влияние на уровень лекарства в крови и, соответственно, на эффективность химиотерапии [Sosniketal.,2010].
Ещё одним фактором, уменьшающим биодоступность рифамицинов, является их пресистемный метаболизм. При этом разрушение в печени рифампицина ограничено пределом насыщения. Преодоление этого предела требует введения высоких доз, а также приводит к нелинейному возрастанию концентраций рифампицина в крови при увеличении его дозы (от 5 до 13 мг/кг) [Burman et al., 2011; Davies и Nuermberger, 2008]. Значительный пресистемный метаболизм, а также метаболизм в стенках кишечника и выведение с желчью указывают в числе основных причин низкой биодоступности рифабутина [Burman et al., 2011; Blaschke и Skinner, 1996].
Следует отметить, что для различных пациентов наблюдаются более чем 10-кратные различия в максимальной концентрации препаратов группы рифамицинов в крови, что особенно характерно для рифампицина. Это обусловлено индивидуальной вариабельностью процессов, определяющих биодоступность этих лекарств: различной интенсивностью абсорбции, а также различной скоростью метаболизма в печени и тонком кишечнике. Поэтому концентрации этих препаратов у многих пациентов оказываются неоптимальными или иногда вообще недостаточными для оказания терапевтического действия [Burman et al., 2011]. Это увеличивает риск постепенного формирования резистентности, что в дальнейшем существенно затрудняет лечение конкретного больного. Поэтому в химиотерапии туберкулёза низкая биодоступность рифампицина является важной проблемой.
Попав в системный кровоток, рифамицины хорошо распределяются по организму и проникают в большинство тканей. Высокие концентрации в лёгких, в несколько раз (в 5-Ю раз) превышающие концентрации в плазме, отмечают для рифабутина [Kurashima et al., 2010]. Есть данные по определению внутрилёгочных концентраций рифампицина и рифапептина [Davies и Nuermberger, 2008; Rodvold et al., 2011]. Их содержание в жидкости эпителиальной выстилки лёгких меньше, чем в крови, однако при этом оно остаётся выше минимальной ингибирующей концентрации, которая для большинства штаммов М. Tuberculosis составляет 0,5 мкг/мл [Ziglam et al., 2002; Conte et al., 2000]. Показано, что рифампицин может накапливаться в альвеолярных макрофагах [Ziglam et al., 2002].
В системном кровотоке основная доля рифамицинов связывается с белками плазмы крови, что снижает количество свободного лекарства и, следовательно, его эффективность. Так, в среднем 60-70% перорально введённого рифампицина связывается с белками крови, для рифабутина эти значения достигают 65-90%, для рифапентина - 90% и более [Aristoff et al, 2010; Jonson и Smith, 2006]. Рифапентин и рифабутин циркулируют в крови намного дольше, чем рифампицин. Это свойство, вместе с более выраженной антимикобактериальной активностью по сравнению с рифампицином, позволяет принимать рифапентин один раз в неделю или даже в две недели. Для всех трёх антибиотиков условиях in vitro наблюдался постантибиотический эффект, т.е. продолжение подавления роста бактерий после удаления антибиотика из среды, что является одним из факторов их высокой терапевтической активности [Aristoff et al., 2010].
Рифамицины могут взаимодействовать с прегнановым X рецептором (PXR), что вызывает индукцию и повышенную регуляцию множества метаболизирующих ферментов (прежде всего, CYP3A4) и транспортёров лекарств (Р-гликопротеинов) в печени и тонком кишечнике [Aristoff et al., 2010; Burman et al., 2011]. Это приводит к нежелательным лекарственным взаимодействиям как с противотуберкулёзными препаратами, так и с лекарствами другого назначения. Например, индукция CYP3A4 рифампицином вызывает ускоренный метаболизм антиретровирусных лекарств - ингибиторов протеазы, что может резко снизить их концентрации в крови [Aristoff et al., 2010]. Некоторые исследователи отмечают, что рифамицины способны инициировать индукцию ферментов собственного метаболизма (так называемое явление самоиндукции рифамицинов). Например, для рифапентина в I фазе клинических испытаний недавно было показано уменьшение AUC на 20% у 13 здоровых волонтёров после 7 дней его трёхразового приёма в дозе 900 мг [Van den Boogaard et al., 2009].
Получение образцов транспортных систем и лекарственных композиций, снабжённых транспортными системами
Ниосомы - везикулы на основе нейонного сурфактанта, которые по физическим свойствам похожи на липосомы.
Ниосомы лишены недостатков липосом, таких как нестабильность, склонность к окислению природных фосфолипидов. Однако компоненты липосом - более естественный биологический материал. В одной из работ использовали смесь эфиров сорбитана и холестерина в соотношении 50:50 (мольные доли). Максимальное встраивание и минимальная скорость высвобождения рифампицина были характерны для ниосом, полученных с использованием более липофильного Span-85. После их внутрибрюшинного введения крысам уровень рифампицина в грудном лимфатическом протоке был выше по сравнению с раствором рифампицина [Jain et al., 2006].
В другой работе ниосомы на основе Тритона XI00 использовали для инкапсуливания рифампицина, изониазида и пиразинамида. Для всех противотуберкулёзных препаратов достигались высокая эффективность встраивания и длительное высвобождение. Было также определено положение лекарств в ниосомах: рифампицин располагался в бислое, изониазид - внутри, пиразинамид - на внешней поверхности частиц [Mehta et al., 2011].
Сообщается о включении рифампицина в ниосомы с отрицательным зарядом - за счёт добавления дицетилфосфата [Singh et al., 2010], а также о включении изониазида [Singh et al., 2011]. Ниосомы с рифампицином и изониазидом могут уменьшить дозу, частоту введения лекарства, его токсичность, что может благоприятно повлиять на соблюдение пациентом режима лечения. Авторы сходятся во мнении, что ниосомы являются перспективной системой для доставки противотуберкулёзных препаратов.
Некоторые исследователи разрабатывали наноэмульсии специфического состава для включения противотуберкулёзных препаратов с использованием для эмульгирования веществ, входящих в список GRAS-ингредиентов (Generally Recognized As Safe), т.е. признанных безопасными и разрешённых FDA (Управление по контролю продуктов питания и лекарств в США). Например, встраивали рифампицин в систему, содержащую Твин 80, Твин 85 и Sefsol 218 (эфиры полиольных жирных кислот, солюбилизаторы) в физрастворе. Оценивая размер капель, вязкость, гомогенность и рН, авторы подобрали оптимальный состав, обеспечивающий стабильность наноэмульсии в течение более чем 19 месяцев, с перспективой использования её для внутривенного введения [Ahmed et al., 2008].
Имеются также отдельные работы по включению противотуберкулёзных препаратов в другие виды наночастиц - дендримеры и циклодекстрины [Sosnik et al., 2010; Shegokar et al., 2011].
Дендримеры - разветвлённые макромолекулы с уникальной структурой, позволяющей им служить переносчиками лекарств. Kumar at al. разработали дендримерные наночастицы на основе полипропиленимина для доставки рифампицина в макрофаги. Для селективного поглощения наноносителей с лекарством фагоцитирующими клетками поверхность дендримеров модифицировали с помощью молекул маннозы. С одной стороны, это способствовало значительному снижению гемолитической токсичности дендримеров с концевыми аминогруппами (с 15,6 до 2,8 %). С другой стороны, это уменьшало нагрузку лекарством: с 52 мг/мл - для немодифицированных дендримеров до 5 мг/мл - для маннозилированных дендримеров. Показано поглощение рифампицина в таких частицах альвеолярными макрофагами, а также снижение его гемолитического эффекта и цитотоксичности. В другом исследовании для снижения гемолитической активности дендримеров с концевыми ИНг-группами их поверхность модифицировали с помощью ПЭГ, что привело к увеличению процента встраивания рифампицина и уменьшению скорости его высвобождения. Циклодекстрины - природные и синтетические циклические олигосахариды, состоящие из 6-12 0-(+)-глюкопиранозных единиц, связанных а-(1-4)-связями. Их структура, объединяющая внешнюю гидрофильную поверхность и внутреннюю гидрофобную полость, даёт возможность частичного или полного включения гидрофобных молекул, что повышает их растворимость в воде. В нескольких работах сообщается о получении комплексов рифампицина с различными молекулами циклодекстринов. В составе образованных комплексов повышалась термическая стабильность лекарства и его антибактериальная активность, что выражалось в снижении минимальной ингибирующей концентрации для дикого штамма микобактерий.
Таким образом, несмотря на множество публикаций, связанных с разработкой систем транспорта для противотуберкулёзных препаратов, сегодня эти работы практически остаются на уровне НИР или R&D (исследований и разработок). Информация о продвижении таких разработок или их клинических испытаниях отсутствует. В отличие от других отраслей медицины, для которых подчёркивается значимость систем доставки, не меньшая, чем новых лекарств, во фтизиатрии сложилась иная ситуация. Лечение туберкулёза проводится только свободными препаратами в различных лекарственных формах, включающих отдельные лекарства и их сочетания (FDC). Новые, запатентованные лекарства, какими бы эффективными они ни были, проходят клинические испытания и ещё далеки от выхода на рынок. Поэтому ещё длительное время будут сохранять свою терапевтическую значимость применяемые сейчас в лечении туберкулёза препараты, в частности, рифампицин и его аналоги. Следовательно, остаются актуальными исследования по разработке эффективных систем транспорта для препаратов группы рифамицинов. При этом, как и для лекарств других терапевтических групп, перспективным является использование транспортных наносистем на основе липидов, в частности фосфолипидов, способных, как отмечено выше, оказывать существенное влияние на биодоступность и терапевтическую эффективность включённых в них лекарств [Allen и Cullis, 2013; Chang и Yeh, 2012; Pandey et al., 2005].
Исследование общей токсичности композиции ФОТН-рифампщина
Как было отмечено выше, в лаборатории фосфолипидных нанолекарств и транспортных систем получен ряд лекарственных композиций на основе фосфолипидной транспортной наносистемы, которые в настоящее время находятся на стадии доклинических исследований. Например, композиции доксорубицина, хлорина Е6, индометацина, арбидола и др. Эти композиции отличаются высоким процентом включения лекарственных соединений в фосфолипидные наночастицы (96-98%) [Патент РФ № 2417079; Zykova et al, 2012]. Для получения этих композиций отработаны технические условия и оптимизированы основные технологические параметры. С использованием накопленного опыта нами были проведены эксперименты по встраиванию рифампицина, рифабутина и рифапентина в фосфолипидную транспортную наносистему. Условия получения и соотношение компонентов соответствовали разработанным ранее для других лекарственных соединений [Патент РФ №2391966] (см. раздел 2.2.1.1). Основные характеристики полученных композиций (процент включения лекарственного соединения в фосфолипидные наночастицы, диаметр частиц и светопропускание) представлены в Таблице 5. Принимая во внимание, что при взаимодействии лекарственного соединения и фосфолипидной наночастицы образуются межмолекулярные связи, которые могут быть разрушены в процессе лиофильного высушивания, измерение основных характеристик полученных препаратов проводили до и после процесса высушивания.
Как видно из данных, представленных в Таблице 5, до лиофильного высушивания лучше всего в фосфолипидные наночастицы встраивался рифабутин (89%о). Процент включения рифампицина составил только 76. Размер наночастиц в полученных образцах также существенно отличался. В образцах с рифабутином он составлял в среднем 30 нм, а размер наночастиц, содержащих рифапентин, был в среднем 60-70 нм. Полученные образцы отличались и по светопропусканию. Так, наиболее прозрачными оказались образцы с рифабутином, что согласуется с наименьшим размером наночастиц в этих образцах. После лиофильного высушивания и регидратации образцов характеристики основных показателей существенно изменились. Процент включения лекарственных субстанций в наночастицы, достаточно высокий до высушивания (76-89%), снизился примерно на 30% и составил всего 52-62%. Диаметр наночастиц несколько увеличился и составлял в среднем 45 и 55 нм для рифабутина и рифампицина соответственно и более 70 нм для рифапентина. Представленные результаты свидетельствуют о том, что полученные образцы нестабильны. Почти половина от встроенного количества лекарственной субстанции выпадает в виде нерастворимого в воде осадка. Увеличение размера частиц до 55-70 нм также можно считать отрицательным фактором, так как эффективность действия систем транспорта лекарств в значительной степени определяется наноразмером частиц-переносчиков и оказывается лучшей для частиц меньшего размера [Wang et al., 2010; Seki et al., 2004; Moghimi et al., 2001]. Светопропускание образцов с рифампицином и рифапентином было ниже значения, допустимого для лекарственных препаратов, предназначенных для инъекционного введения (необходимо 60%).
Таким образом, проведённые исследования показали, что рифампицин, рифабутин и рифапентин ограниченно встраиваются в фосфолипидную транспортную наносистему, основным компонентом которой является фосфатидилхолин (не менее 94%). Для получения стабильных композиций с максимальным встраиванием рифамицинов необходимо изменить состав транспортной наносистемы и оптимизировать способ её получения. 3.1.2. Получение образцов рифамицинов, встроенных в транспортную наносистему на основе фосфолипида и олеиновой кислоты
Преимуществом фосфолипидной системы транспорта является то, что, благодаря амфифильности фосфатидилхолина, она способна служить переносчиком как для гидрофильных, так и для гидрофобных лекарственных соединений. Известно, что степень растворимости в липидах по отношению к растворимости в воде характеризует липофильность соединения, которую определяют как коэффициент распределения в системе растворителей октанол-вода (log Р). Считается, что для эффективного встраивания в липосомы плохо растворимых в воде лекарственных соединений величина log Р должна быть больше 3 [Хи и Burgess, 2012]. Для молекул, которые ионизуются в зависимости от рН, определяют коэффициент распределения log D при соответствующем значении рН. Значения log D для исследуемых соединений (рифампицина, рифабутина и рифапентина) при рН 6,5-7,5 не превышают
Учитывались также поверхностно-активные свойства ЖК. Так, известно, что возможность солюбилизации трудно растворимых соединений и свойства полученных водных дисперсий зависят от гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) их компонентов, т.е. соотношения в молекуле каждого из них доли гидрофильной и гидрофобной части. Значения ГЛБ определяют экспериментально или на основании расчётов [Miraglia, 2011]. Известно, что сочетание сурфактантов с более низким и более высоким значениями ГЛБ способствует увеличению растворимости гидрофобных соединений и оптимизирует свойства полученных дисперсий [Cannon, 2011; Rukmini, 2012]. Фосфатидилхолин и олеат натрия являются поверхностно-активными соединениями с величинами ГЛБ, отличающимися друг от друга более чем в 2 раза (-7,6 [Patent US №5626873] и 18 [Miraglia, 2011; Kumar и Biswas, 2011] соответственно), т.е. их сочетание должно способствовать получению устойчивых дисперсий с предельно малым размером частиц.
Для доказательства правильности выбора нового компонента системы были проведены эксперименты. Рифампицин, рифабутин и рифапентин в условиях, применяемых ранее (см. раздел 3.1.1.), встраивали в фосфолипидную транспортную наносистему, дополнительно содержащую олеиновую кислоту в виде натриевой соли в соотношении к фосфолипиду 1:10. В полученных образцах до и после лиофильного высушивания определяли размер наночастиц, процент включения лекарственной субстанции и светопропускание. Полученные результаты приведены в Таблице 6.
Получение композиций рифамицинов, снабжённых фосфолипидно-олеатной транспортной наносистемой, и их характеристика
Из данных, представленных на Рисунке 14, видно, что свободный рифампицин в основном связывался с белками и ЛВП (суммарно около 80%), в то время как для рифампицина, встроенного в фосфолипидно-олеатную транспортную наносистему (ФОТН-рифампицин), лекарство обнаруживалось преимущественно во фракции ЛНП: 60% по сравнению с 21% для свободного рифампицина (р 0,01). При этом для ФОТН-рифампицина количество лекарства во фракциях белка и ЛВП уменьшалось в 2-3 раза.
Снижение доли лекарства, ассоциированного с белками плазмы (альбумином или/и альфа-1-кислым гликопротеином), с соответствующим перераспределением его в ЛВП или ЛНП описано для липосомальных форм ряда лекарств [Dutta, 2007; Wasan et al., 1994], что связывают с функционированием липид-переносящих белков плазмы [Торховская и др., 2010]. В частности, полагают возможность совместного транспорта с помощью этих белков липофильного лекарства вместе с фосфолипидами из частицы-переносчика к ЛВП или/и, вместе с этерифицированным холестерином, - из ЛВП к ЛОНП и ЛНП [Wasan et al., 1994]. Во многих случаях такое перераспределение лекарств, например, противоопухолевых и противовоспалительных, сопровождается повышением их фармакологической эффективности, за счёт появления возможности рецепторного взаимодействия с клеткой-мишенью [Masquelier et al., 2000; Dutta, 2007]. Полагают также, что снижение связывания лекарства с белками плазмы делает его более доступным для осуществления фармакологического действия [Tesseromatis и Alevizou, 2008]. В этом отношении полученные данные о снижении связывания рифампицина с белками при его включении в ФОТЫ (Рисунок 14) можно рассматривать как положительный факт. Более того, высокое сродство ФОТН-рифампицина к ЛНП (Рисунок 14) (в 3 раза выше, чем у свободного рифампицина) также указывает на возможность увеличения специфической (противотуберкулёзной) активности полученной композиции. Имеются данные о поглощении макрофагами ЛНП как путём рецепторного взаимодействия [Palanisamy et al., 2012], так и в результате жидкофазного пиноцитоза [Buono et al., 2009]. При воспалительных процессах в макрофагах происходит накопление ЛНП, в том числе их окисленных форм, которые образуются под действием активных форм кислорода [Palanisamy et al., 2012; Ye et al., 2009]. Связывание рифампицина с ЛНП создаёт возможность использования этих естественных путей транспорта для доставки лекарства в поражённые микобактериями макрофаги [Mankertz et al., 1997].
Таким образом, сравнительные исследования распределения ФОТН-рифампицина по компонентам плазмы крови показали, что включение лекарства в фосфолипидно-олеатную транспортную наносистему снижает степень его ассоциации с белками и обеспечивает преимущественное, в 3 раза большее связывание с ЛНП, что подтверждает возможность его повышенного транспорта в макрофаги.
Специфическую активность рифампицина, включённого в фосфолипидно-олеатную наносистему транспорта в сравнении со свободной субстанцией исследовали в экспериментах in vitro по их влиянию на клеточный рост бактерий М. tuberculosis H37Rv в автоматизированной системе в течение 42 дней.
Предварительно были проведены эксперименты по подбору концентрации препарата в среде, которая позволила бы выявить различия в эффективности исследуемых препаратов. При чрезмерно высоких концентрациях рифампицина (сильного антибиотика) быстрое и интенсивное подавление роста клеток может замаскировать различия между препаратами, а низкие концентрации могут не оказать влияния на клеточный рост в любой форме введения. Была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК), при которой происходит полное угнетение роста бактерий М. tuberculosis H37Rv в течение всего эксперимента, для обеих форм рифампицина. В среде без добавления препаратов рост бактерий начинался с 7-8-го дня. В присутствии же рифампицина рост клеток в течение эксперимента ингибировался в зависимости от концентрации лекарства. Полученные результаты представлены в Таблице 16.
Как видно из данных, представленных в Таблице 16, при добавлении в среду 1 мг/мл рифампицина, как свободного, так и включённого в разработанную систему транспорта, роста клеток не наблюдалось в течение всего эксперимента (42 дней), т. е. происходило 100%-ное ингибирование роста микобактерий. Те же результаты были получены и для концентраций 5 и 2 мг/мл (данные не приведены). При концентрации 0,5 мг/мл в среде с добавлением свободного рифампицина в последние 2-3 дня (на 40-42-ой дни) наблюдался небольшой рост клеток, менее процента от такового в среде без лекарства. Следовательно, для свободного рифампицина минимальная ингибирующая концентрация (МИК) была 1 мг/мл. В среде же с добавлением рифампицина, встроенного в транспортную наносистему (ФОТН-рифампицина), при концентрациях 1 мг/мл и 0,5 мг/мл роста клеток до конца эксперимента не наблюдалось вообще. Лишь при концентрации 0,25 мг/мл в последний, 42-ой, день фиксировали небольшой рост, т. е. величина МИК для ФОТН-рифампицина была 0,5 мг/мл - вдвое меньше, чем для свободной субстанции. Сходные результаты были получены ранее в работе Changsan et al., где на клетках Mycobacterium bovis показано, что для рифампицина, включённого в липосомы из соевого фосфатидилхолина с холестерином (1:1), величина МИК была существенно ниже, чем для свободного лекарства [Changsan, Nilkaeo et al., 2009].
