Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные подходы к лечению онкологических заболеваний (обзор литературы) 12
1.1 Противоопухолевые препараты на основе ген-направленных нуклеиновых кислот 13
1.1.1 Механизмы действия противоопухолевых препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот 13
1.1.1.1 Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов 13
1.1.1.2 Механизм действия малых интерферирующих РНК (siPHK) 16
1.1.1.3 Механизм действия рибозимов 17
1.1.1.4 Механизм действия "10-23" ДНКазимов 18
1.1.2 Гены-мишени для лекарственных препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот 18
1.1.3 Применение препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот в культуре клеток, в экспериментальных моделях животных и в клинической практике 29
1.1.3.1 Ras 29
1.1.3.2 C-myc ЗО
1.1.3.3 РКС-а 32
1.1.3.4 Кластерин 32
1.1.3.5 Bcl-2 33
1.1.3.6 RaM 34
1.1.3.7 DNMT1 35
1.1.3.8 RRR2 35
1.1.3.9 VEGF 36
1.1.3.10 neu/HER-2 (ErbB-2) 37
1.1.3.11 Другие гены-мишени 38
1.2 Ферментативные противоопухолевые препараты на основе рибонуклеаз 50
1.2.1 Возможные механизмы цитотоксического действия РНКаз 51
1.2.2 Применение BS-РНКазы для терапии опухолей 55
1.2.3 Применение онконазы для терапии злокачественных заболеваний в эксперименте и в клинике 57
1.2.4 Химически модифицированные РНКазы 59
1.2.5 Мутантные РНКазы 59
1.2.6 Химерные РНКазы 60
1.2.7 Тандемные РНКазы 61
1.3 Активация лекарственного средства через трансдукцию опухолевых клеток генами-самоубийцами 62
1.4 Восстановление функции генов-супрессоров опухоли 68
1.5 Иммуногенная терапия 73
1.6 Заключение 76
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 78
2.1 Материалы 78
2.1.1 Реактивы и препараты 78
2.1.2 Оборудование 78
2.1.3. Плазмиды 79
2.1.4 Олигонуклеотиды 79
2.1.5 Буферы и растворы, использованные в работе 80
2.1.6 Лабораторные животные и опухолевые модели 81
2.2 Методы 81
2.2.1 Гель-электрофорез 81
2.2.1.1 Электрофорез в агарозном геле 81
2.2.1.2 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 82
2.2.1.3 Электрофорез в ПААГ в нативных условиях 82
2.2.2 Получение первичных культур опухолевых клеток из асцитной жидкости 82
2.2.3 Выделение суммарной клеточной РНК 82
2.2.4 Определение уровня экспрессии генов в опухолевых клетках методом ОТ-ПЦР
83
2.2.4.1 Обратная транскрипция 83
2.2.4.2 ПЦР 83
2.2.5 Приготовление дуплексов siPHK 84
2.2.6 Трансфекция клеток siPHK in vitro 84
2.2.7 Трансфекция клеток siPHK ex vivo 85
2.2.8 Определение чувствительности клеток к действию цитостатиков (МТТ тест) .85
2.2.9 Определение чувствительности опухолей LS, RLS и RLS40 к химиопрепаратам in vivo 86
2.2.10 Исследование терапевтического потенциала терапии, включающей трансфекцию опухолевых клеток siPHK ex vivo и in vivo и лечение цитостатиками...86
2.2.10.1 Ex vivo 86
2.2.10.2 In vivo 87
2.2.11 Введение радиоизотопной метки в состав РНК и ДНК с использованием полинуклеотидкиназы 87
2.2.12 Исследование активности РНКазы A in vitro 88
2.2.13 Исследование активности ДНКазы I in vitro 88
2.2.14 Инактивация РНКазы А 88
2.2.15 Исследование каталитической активности РНКазы А после её инактивации 88
2.2.16 Инактивация ДНКазы I 89
2.2.17 Исследование каталитической активности ДНКазы I после её инактивации...89
2.2.18 Определение концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот в плазме крови 89
2.2.18.1 Получение образцов плазмы крови у мышей 89
2.2.18.2 Выделение внеклеточных нуклеиновых кислот и определение их концентрации в плазме крови 90
2.2.18.3 Определение суммарной ДНКазной и РНКазной активности плазмы крови 90
2.2.19 Исследование противоопухолевой и антиметастатической активности РНКазы
А и ДНКазы I in vivo 91
2.2.19.1 Исследование онкосупрессивного действия РНКазы А на модели LLC с применением широкого диапазона доз фермента 91
2.2.19.2 Исследование онкосупрессивного действия РНКазы А и ДНКазы I на моделях LLC и НА-1 91
2.2.19.3 Исследование антиметастатического действия смеси РНКазы А и ДНКазы I на модели LLC 92
2.2.19.4 Исследование онкосупрессивного действия инактивированных ферментов РНКазы А и ДНКазы I на модели LLC 92
2.2.20 Гистология 92
2.2.21 Статистический анализ 93
ГЛАВА 3. Исследование противоопухолевой и антиметастатической активности SIPHK, рнказы а и днказы i - препаратов, способных специфически и неспецифически вызывать деградацию нуклеиновых кислот (результаты и обсуждение) 94
3.1 Противоопухолевый потенциал siPHK в комбинации с химиотерапией 94
3.1.1 Описание субштаммов лимфосарком LS и RLS 94
3.1.2 Сравнение профиля экспрессии генов, вовлечённых в формирование синдрома МЛУ, в клетках опухолей LS и RLS и их чувствительности к цитостатикам 95
3.1.3 Определение уровня экспрессии генов в клетках опухолей LS и RLS 97
3.1.4 Селекция высокорезистентной клеточной линии RLS40 98
3.1.5 Оценка чувствительности клеточных линий RLS5, RLS10, RLS2o и RLS4o к цитостатикам 100
3.1.6 Определение уровня экспрессии генов mdrla, mdrlb, bcl-2 и р53 в клетках линии RLS4o 101
3.1.7 Исследование способности клеток линии RLS40 формировать опухоль in v/Vo101
3.1.8 Сравнение чувствительности опухолей LS, RLS и RLS4o к цитостатикам in vivo 102
3.1.9 Обращение фенотипа МЛУ клеток линии RLS40 под действием siPHK/'n wfro.103
3.1.10 Исследование влияния siPHK на уровень мРНК генов mdrla, mdrlb и bcl-2 в клетках линии RLS40 103
3.1.11 Восстановление чувствительности клеток линии RLS40 к винбластину под действием mdrlb siPHK 105
3.1.12 Обращение фенотипа МЛУ опухоли RLS40 под действием siPHK ex vivo 106
3.1.13 Обращение фенотипа МЛУ под действием siPHK/л vivo 110
3.1.14 Заключение 111
3.2 Исследование противоопухолевого и антиметастатического потенциала РНКазы
АиДНКазы! 111
3.2.1 Выбор и описание моделей опухолевой прогрессии 112
3.2.2 Выбор диапазона доз РНКазы А и ДНКазы I для экспериментов in vivo 112
3.2.3 Исследование влияния РНКазы А на рост первичной опухоли LLC 113
3.2.4 Исследование влияния ДНКазы I на рост первичной опухоли LLC 116
3.2.5 Исследование влияния РНКазы А и ДНКазы I на развитие метастазов 116
3.2.6 Гистологическое исследование метастазов у мышей контрольных групп 117
3.2.7 Гистологическое исследование метастазов в группах мышей, получавших лечение РНКазой А и ДНКазой 1 119
3.2.8 Влияние РНКазы А и ДНКазы I на площадь, занимаемую метастазами, в лёгких у мышей с LLC и печени у мышей с НА-1 120
3.2.9 Анализ корреляции между каталитической функцией РНКазы А и ДНКазы I и их противоопухолевой и антиметастатической активностями 123
3.2.9.1 Определение концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот и суммарной рибо/дезоксирибонуклеазной активности в плазме крови мышей, получавших лечение РНКазой А и ДНКазой 1 123
3.2.9.2 Определение концентрации внДНК и суммарной ДНКазной активности в плазме крови мышей с LLC и НА-1 до и после лечения ДНКазой 1 124
3.2.9.3 Определение концентрации внеклеточных РНК и суммарной РНКазной активности в плазме крови мышей с LLC и НА-1 до и после лечения РНКазой А 125
3.2.9.4 Исследование влияния ферментов РНКазы А и ДНКазы I с инактивированной каталитической функцией на развитие первичной опухоли и метастазирование 126
3.2.10 Заключение 128
Выводы 132
Список литературы 134
- Механизмы действия противоопухолевых препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот
- Применение препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот в культуре клеток, в экспериментальных моделях животных и в клинической практике
- Буферы и растворы, использованные в работе
- Противоопухолевый потенциал siPHK в комбинации с химиотерапией
Введение к работе
На современном этапе развития медицины приоритетной задачей практической онкологии является повышение эффективности лечения злокачественных новообразований путём поиска и разработки принципиально новых методических подходов, а также усовершенствованием традиционных способов терапии неоплазий.
Сочетание хирургической помощи, радиационного облучения и химиотерапии остается золотым стандартом лечения онкологических больных, успехи которого позволили увеличить выживаемость пациентов в 8 раз за последние 30 лет. Неудовлетворительные результаты только хирургического лечения проявляются в виде местного рецидивирования опухоли, появления метастазов, а также возникновения неоперабельных форм злокачественных заболеваний. Это заставляет обращаться к применению радио- и химиотерапии. Однако, даже комбинация мощных противоопухолевых программ, во многих случаях оказывается бездейственной. Поэтому, несмотря на безусловные достижения современной онкологии, проблема повышения эффективности методов воздействия на злокачественные новообразования является крайне важной.
Применение широкого спектра противоопухолевых антибиотиков остаётся неотъемлемой частью терапии онкологических заболеваний. Комбинации лекарственных препаратов, различных по структуре и механизмам действия, используемых в программах химиотерапии, оказывают значительное токсическое действие не только на клетки опухоли, но и на организм в целом, и часто приводят к развитию множественной лекарственной устойчивости. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) -приобретение опухолевыми клетками устойчивости к широкому спектру лекарственных веществ - является одной из основных причин неудовлетворительных результатов лечения онкологических больных. Молекулярные механизмы МЛУ опухолевых клеток многообразны [1]. Синдром МЛУ может быть обусловлен нескольким причинами: гиперэкспрессией генов, кодирующих трансмембранные транспортёры (например, гены mdrl, тгр и другие), что приводит к выведению противоопухолевых препаратов из клеток [2, 3]; нарушением экспрессии про- и анти-апоптотических генов (р53 и генов семейства Bcl-2), в результате чего опухолевые клетки приобретают повышенную способность к выживанию [4]; индукцией ферментов системы глутатион-в-трансфераз, инактивирующих цитотоксические препараты [1]; аномалиями функций топоизомераз [1, 2], что приводит к нарушению системы репарации. Вещества различной химической структуры: блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы кальмодулина, стероиды, антибиотики, иммуносупрессоры, транквилизаторы могут в той или иной степени преодолевать МЛУ [5, 6]. Однако клинические испытания таких модуляторов продемонстрировали их высокую токсичность [7, 8], поэтому проблема повышения эффективности действия противоопухолевых препаратов в отношении резистентных опухолевых клеток актуальна и в настоящее время.
С целью повышения эффективности традиционных методов лечения разрабатываются подходы по сочетанному применению хорошо известных программ химиотерапии с различными модуляторами канцерогенеза, в том числе с препаратами, которые сами по себе не обладают противоопухолевым действием. При этом можно ожидать достижения аддитивного или синергического эффекта, то есть повышения чувствительности опухолевых клеток к химио-, лучевой и другой терапии у больных, имеющих злокачественные новообразования. Такой подход получил название химиосенсибилизации.
Известно, что важную роль в онкогенезе играют гены, гиперэкспрессия которых приводит к неконтролируемой пролиферации [9], отмене апоптоза [4], нарушениям дифференцировки [10] и генетической стабильности [11], повышению ангиогенных и инвазивных свойств клетки [12, 13]. Всё больше появляется свидетельств того, что в злокачественных опухолях различного происхождения экспрессия большинства miPHK, участвующих в регуляции опухолеспецифичных генов, нарушена [14, 15]. Так, показано повышение экспрессии mir-9 в случае рака молочной железы, которое приводит к снижению уровеня Е-кадхерина и усилению метастазирования [16]. Высвобождение опухолевыми клетками miPHK и их предшественников во внеклеточную среду и кровоток может способствовать повышению концентрации внРНК в плазме онкологических пациентов. Было показано, что в плазме больных плоскоклеточным раком языка повышен уровень miR-184, которые оказывают стимулирующее влияние на антиапоптотические и пролиферативные свойства опухолевых клеток [17].
Помимо классической теории возникновения метастазов путём миграции онкоцитов [18], известна так называемая «геном-генометастатическая гипотеза», которая говорит о том, что опухолеспецифичная ДНК, циркулирующая в кровотоке, трансфецирует восприимчивые клетки органов и тканей, что приводит к возникновению метастазов [19].
На основе общемировых экспериментальных данных трудно утверждать насколько этот механизм метастазирования является состоятельным, однако нельзя исключить, что он может являться составной частью сложного комплекса событий опухолевой прогрессии.
Недавно открытая роль miPHK в регуляции онкогенеза и возможное участие опухолеспецифической ДНК в процессах метастазирования позволяют по-новому взглянуть на использование в противоопухолевой адъювантной терапии препаратов, разрушающих нуклеиновые кислоты. Препараты на основе природных РНКаз и ДНКаз давно рассматриваются исследователями как перспективная альтернатива химиотерапии рака в связи с их основной функцией - деградацией нуклеиновых кислот. В качестве перспективного подхода к терапии онкопатологий рассматривается также применение малых интерферирующих РНК, механизм действия которых заключается в привлечении эндогенных рибонуклеаз для деградации специфических мРНК в составе RISC комплекса, что приводит к выключению ассоциированных с заболеванием генов.
В мире широко ведутся исследования противоопухолевого потенциала экзогенных рибонуклеаз. На сегодняшний день продемонстрирован высокий противоопухолевый потенциал BS-РНКазы [20-23] и онконазы [24-25], относящихся к семейству РНКазы А. Однако первые исследования противоопухолевой активности рибонуклеаз этого семейства были проведены именно с РНКазой А. Полученные в этих экспериментах данные оказались достаточно противоречивыми [27]. В ряде работ была продемонстрирована её высокая противоопухолевая активность [28-30], в других - её полное отсутствие [31]. Антиметастатический потенциал ДНКазы I был продемонстрирован на модели опухоли L5178Y-ML, метастазирующей в печень [32], in vivo. Однако, использование ДНКазы I в качестве агента адьювантной терапии при лечении рака не получило распространения.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование противоопухолевой и антиметастатической активности siPHK, гомологичных мРНК генов mdrlb и bcl-2 мыши, РНКазы А и ДНКазы I - препаратов, способных специфически (siPHK) и неспецифически (РНКаза А и ДНКаза I) вызывать деградацию нуклеиновых кислот. В ходе исследования решались следующие задачи: 1. Разработка модели опухолевой прогрессии, проявляющей фенотип множественной лекарственной устойчивости, на основе субштамма лимфосаркомы RLS мыши, устойчивой к действию циклофосфамида.
2. Изучение противоопухолевого потенциала mdrlb и bcl-2 siPHK, гомологичных мРНК генов mdrlb и bcl-2 мыши, на модели опухоли RLS40 в комплексе с химиотерапией.
3. Исследование на двух моделях опухолевой прогрессии, карциноме лёгких Льюис и гепатоме А-1 мышей, противоопухолевого и антиметастатического потенциала РНКазы А и ДНКазы I.
4. Анализ корреляции между каталитической функцией РНКазы А и ДНКазы I и их противоопухолевой и антиметастатической активностями.
Механизмы действия противоопухолевых препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот
Противоопухолевые препараты на основе нуклеиновых кислот представляют собой высокоспецифичный инструмент модуляции экспрессии генов и давно привлекают внимание исследователей в качестве регуляторов канцерогенеза на молекулярном уровне. Подавление гиперфункции ряда генов, аномально высокая экспрессия которых возникает при неопластической трансформации, можно осуществить с помощью препаратов на основе нуклеиновых кислот, таких как антисмысловые олигонуклеотиды (asON), малые интерферирующие РНК (siPHK), рибозимы и дезоксирибозимы. В общем, механизм подавления экспрессии онкогенов под действием этих препаратов заключается в их сиквенс-специфическом связывании с мРНК-мишенью с образованием комплементарного комплекса, после чего либо целевая мРНК подвергается расщеплению, либо блокируется процесс трансляции мРНК рибосомой. asON представляют собой синтетические одноцепочные ДНК длиной 15-20 нуклеотидов, которые способны формировать комплементарный комплекс с целевой последовательностью мРНК [38]. Подавление биосинтеза белка под действием asON происходит либо вследствие того, что мРНК-мишень в составе гибридного ДНК/РНК комплекса с asON расщепляется внутриклеточной РНКазой Н (Рис. 1 А), либо вследствие блокирования трансляции, так как образование гибридного комплекса препятствует продвижению рибосомы по мРНК (Рис. 1 Б) [39]. В последнее время были получены asON, способные препятствовать транспорту сплайсированной мРНК из ядра в цитоплазму, а также asON, которые в результате блокирования сайта сплайсинга в пре-мРНК способны приводить к экспрессии альтернативного варианта белка [40, 41].
Впервые возможность избирательного подавления продукции определённого белка под действием asON была продемонстрирована в работе Zamecnik и Stephenson в 1978 году [36]. Они показали, что 13-звенный олигонуклеотид, комплементарный З -концевой последовательности РНК вируса саркомы Рауса, ингибирует репликацию вируса in vitro [42-45]. Эта работа послужила толчком к длительному и плодотворному изучению потенциала asON в качестве терапевтических средств для лечения онкологических и вирусных заболеваний, воспалительных процессов, болезней крови, расстройств сердечно-сосудистой системы [43, 46].
Ввиду того, что природные олигодезоксирибонуклеотиды в культуре клеток и в условиях in vivo подвергаются быстрому расщеплению под действием нуклеаз, для повышения их метаболической стабильности в asON вводят различные химические модификации [43]. Введение модификаций в структуру олигонуклеотида не только приводит к повышению устойчивости asON к нуклеазам, но и увеличивает эффективность его биологического действия, улучшает его гибридизационные свойства и облегчает его захват клетками. Фосфотиоатные олигонуклеотиды (P-asON) являются основными представителями первого поколения модифицированных аналогов олигонуклеотидов, у которых один из атомов кислорода, не участвующий в формировании фосфодиэфирной связи заменён на атом серы. P-asON были впервые синтезированы в 1969 году [43], и для биологического применения впервые апробировались в качестве ингибиторов репликации вируса иммунодефицита человека [47]. Фосфотиоаты активно используются для разработки противоопухолевых препаратов благодаря своей повышенной устойчивости к действию нуклеаз, хорошей растворимости, хорошим гибридизационным свойствам и тому, что гетеродуплекс такого олигонуклеотида с мРНК является субстратом РНКазы Н [43]. Существенным недостатком этого класса asON является их повышенное сродство к ряду белков, что в некоторых случаях может вызывать нежелательные побочные эффекты, а также препятствовать проникновению P-asON в клетки [48, 49]. Несовершенство фосфотиоатов было преодалено при разработке второго поколения asON, содержащих звенья с алкильными заместителями в 2 -положении рибозы: 2 -0 метильные и 2 -0-метоксиэтильные олигорибонуклеотиды. Эти аналоги олигорибонуклеотидов были менее токсичными, чем фосфотиоаты, однако это свойство уравновешивалось тем неблагоприятным фактом, что 2 - Э-модифицированные олигорибонуклеотиды не активировали расщепление мРНК РНКазой Н [50], а были способны лишь стерически блокировать трансляцию. Весьма радикальное изменение естественной структуры олигонуклеотида было предложено Nielsen с соавторами, которые заменили весь сахарофосфатный остов на М-(2 -аминоэтил)-глицин полиамидную структуру [51]. Эти пептидил-нуклеиновые кислоты (PNA) были отнесены к третьему поколению asON. Такие аналоги ДНК обладают высокой гибридизационной способностью и биологической стабильностью, однако они не активируют РНКазу Н, и их действие не сопровождается расщеплением мРНК-мишени. Кроме того, PNA являются нейтральными молекулами, что создаёт определённые трудности при их растворении и проникновении в клетки [52, 53]. Олигонуклеотиды третьего поколения N3 -N5 -фосфороамидаты (NP), имеющие З -аминогруппу вместо З -гидроксильной кольца 2 -дезоксирибозы, были предложены в 1994 году [54]. Ингибирующая функция этих аналогов олигонуклеотидов осуществляется за счёт стерического блокирования трансляции и модуляции сплайсинга. Одними из наиболее многообещающих химически модифицированных аналогов олигонуклеотидов являются LNA (Locked Nucleic Acids) -олигонуклеотиды, имеющие дополнительный структурный элемент в виде 2 -0,4 -С-метиленового мостика, фиксирующего сахарный остаток в СЗ -эндо-конформации [55, 56]. LNA проявляют стабильность к нуклеазному расщеплению и обладают исключительно высоким сродством к нуклеиновым кислотам. Перспективность использования LNA in vivo подтверждается тем, что они отличаются чрезвычайно низкой токсичностью при внутривенном введении, а также при микроинъекциях в мозг животных [57]. К третьему поколению модифицированных олигонуклеотидов относят также морфолино-олигонуклеотиды (MF), основу скелета в которых составляют морфолин и диметиламидофосфитный линкер [58]. Молекулярный механизм действия подобных олигонуклеотидов заключается в блокировании трансляции за счёт связывания asON с целевой мРНК и модуляции сплайсинга [58]. MF применяют преимущественно для изучения биологии развития на эмбрионах полосатых данио (danio rerio или zebra-fish) [59].
Применение препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот в культуре клеток, в экспериментальных моделях животных и в клинической практике
In vitro. Установленная локализация точечных мутаций в последовательности мРНК онкогена ras позволяет разрабатывать препараты олигонуклеотидов, точно адресованные в абберантный сайт мРНК-мишени, и «выключать» работу онкогена с высокой эффективностью. Первым для подавления экспрессии онкогена ras был разработан фосфотиоатный asON (сейчас известный как ISIS 2503), адресованный к инициирующему кодону мРНК гена H-ras [185]. Обработка клеток карциномы шейки матки HeLa, трансфецированных плазмидой, содержащей объединённый ген ras-люцифераза, приводила к 98%-ному подавлению экспрессии репортёрного гена. В работах китайских исследователей обработка клеток гепатомы человека фосфотиоатным олигонуклеотидом в течение 5 дней приводила к ингибированию роста клеток на 87.8% [186]. При этом наблюдалась блокировка H-ras-зависимого перехода раковых клеток в S-фазу клеточного цикла, а ДНК фрагментация, зафиксированная в обработанных клетках, указывала на запуск апоптоза [186].
Активно исследуется противоопухолевый потенциал рибозимов, направленных на подавление синтеза белков семейства Ras. На клеточной модели меланомы, карциномы глотки и рака мочевого пузыря разными группами исследователей было показано, что Н-ras рибозимы вызывали индукцию апоптоза, ингибирование пролиферации опухолевых клеток и способствовали восстановлению дифференцировки клеток [78-82].
Альтернативным подходом подавления экспрессии генов семейства Ras является применение технологии РНКи. Ретровирус-опосредованная экспрессия siPHK, гомологичной мРНК генов H-ras и K-ras, эффективно подавляла синтез этих белков в клетках рака яичников и карциномы поджелудочной железы [187, 188], снижала пролиферативную активность раковых клеток в результате увеличения количества клеток в GQ/GT фазе клеточного цикла до 66.2 % [187] и увеличивала количество клеток в состоянии апоптоза с 4 до 21% [187]. Zhang с соавторами, применив аденовирусную систему доставки siPHK в клетки, получили 80%-ное снижение количества белка K-ras в клетках рака лёгкого и подавление пролиферации опухолевых клеток [189].
In vivo. Предварительная трансфекция клеток гепатоцеллюлярной карциномы с помощью asON, направленной на подавление онкогена H-ras, приводила не только к снижению веса опухолей у мышей [186, 190], но и ингибировала процессы метастазирования [190]. Эффективность противоопухолевого действия asON ISIS 2503 у мышей с опухолями предстательной железы увеличивалась при введении в последовательность препарата LNA-нуклеотидов [191]. На сегодняшний день фосфотиоатный олигонуклеотид ISIS 2503 находится на стадии клинических испытаний. В фазе I клинических испытаний пациенты ежедневно в течение 14 дней получали инъекции asON ISIS 2503 в дозе 10 мг/кг [83, 192]. Через неделю курс инъекций повторяли. asON ISIS 2503 не проявил выраженной токсичности и в некоторых случаях способствовал стабилизации заболевания. В данный момент ISIS 2503 тестируется в фазе II клинических испытаний для лечении пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы.
Применение анти-H-ras рибозимов in vivo приводило к существенному торможению роста опухолей у мышей, снижению их инвазивного потенциала и двукратному увеличению продолжительности жизни животных [78-80]. Kijima и соавторы разработали рибозим, направленный в область кодона 12 мутантного транскрипта гена K-ras (замена триплета GGT на GTT), и получили рекомбинантный аденовирус, экспрессирующий рибозим [193]. Внутриопухолевое введение такого препарата атимусным мышам с трансплантированной карциномой поджелудочной железы вызвало регрессию опухоли у 68% мышей [193].
Обработка клеток in vitro ретровирусным вектором, содержащим siPHK, гомологичной мРНК генов K-ras и H-ras, приводила к полному подавлению роста карциномы поджелудочной железы и 80%-ному ингибированию развития рака яичников у мышей [187, 188]. Однократная внутриопухолевая инъекция siPHK в составе аденовируса, гомологичная мРНК гена K-ras, подавляла развитие рака лёгких на 45%, а многократный режим инъекций полностью подавлял рост опухоли у 8 из 10 мышей. При этом апоптотическая активность опухолевых клеток увеличивалась в 2.8 раза [189].
In vitro. Первым кандидатом препарата, направленного на специфическое подавление протоонкогена с-тус, выступил фосфодиэфирный asON, который вызывал 50%-ное снижение уровня белка в клетках лейкемии и ингибировал их пролиферацию на 50% после 5-дневной инкубации с олигонуклеотидом [194]. Watson и соавторы разработали фосфотиоатный олигонуклеотид, который продемонстрировал более продолжительное (до 9 дней) и эффективное (75%-ное) подавление пролиферации клеток карциномы молочных желёз и вызывал 95%-ное ингибирование эстроген-индуцированной гиперэкспрессии гена с-тус [195]. Следующим этапом стала замена фосфотиоатного остова на морфолино-фосфодиамидатный в структуре анти-c-myc asON. ЭТОТ олигонуклеотид не только вызывал снижение уровня белка, но и приводил к полному аресту клеточного цикла в фазе G0/Gi [196].
Для подавления синтеза белка С-тус был разработан рибозим типа «головки молотка». Трансфекция клеток ретровирусным вектором, содержащим рибозим, приводила к снижению количества белка в клетках гепатомы в 1.7 раза и снижала пролиферативный потенциал клеток в 1.85 раза [197].
Способность подавлять гиперфункцию белка С-тус была оценена и для ген-направленных препаратов на основе siPHK. Было показано, что siPHK вызывает 60 - 92%-ное снижение уровня мРНК гена и 55 - 83%-ное ингибирование синтеза белка [198, 199]. Подавление экспрессии гена с-тус было ассоциировано с 2.5-кратным торможением роста клеток в случае эпидермоидной карциномы человека КВ-3-1, и полной остановкой деления в случае неиробластомы SK-N-MC [199]. Для повышения стабильности и облегчения проникновения в клетки был разработан поли-ДНФ-РНК (поли-2-0-(2,4-динитрофенил)-олигорибонуклеотид - poly-DNP-RNA). Этот препарат понижал уровень мРНК гена с-тус до 15% в клетках молочных желёз и аденокарциномы лёгких [200].
In vivo. В экспериментах in vivo было показано, что морфолино-олигонуклеотид AVI-4126 (AVIBioPharma, США), разработанный для ингибирования экспрессии белка С-тус, вызывает 80%-ное подавление роста опухоли предстательной железы у атимусных мышей [84]. Сейчас этот препарат находится в фазе II клинических испытаний. В фазе I клинических испытаний AVI-4126 было отмечено отсутствие серьёзных побочных эффектов у здоровых людей после однократной внутривенной инъекции AVI-4126 в дозе 90 мг [85]. Параллельно оценивали биоаккумулирование препарата в тканях опухолей предстательной и молочных желез через сутки после введения препарата в дозе 90 мг (анализ проводили после хирургического удаления опухолей у пациентов) [85].
Подавление экспрессии гена с-тус с помощью РНКи в преклинических испытаниях выглядит достаточно обнадёживающим. Клетки карциномы молочных желёз, трансфецированные плазмидой, содержащей анти-c-myc-siPHK, при трансплантировании мышам не давали развития опухоли [201]. На модели трансгенных мышей с развивающейся лимфомой методом ОТ-ПЦР в реальном времени было зафиксировано снижение экспрессии мРНК гена с-тус под действием поли-ДНФ-РНК в плазме крови больных мышей до 15-20% [200].
Буферы и растворы, использованные в работе
Последовательности олигонуклеотидов, использованных в качестве праймеров приведены в таблице 7. ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл содержащей 1 мкл кДНК, полученной с помощью реакции обратной транскрипции (п. 2.2.4.1), по 6 пмолей специфических праймеров, 2 ед. Taq-полимеразы и 0.05 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов для генов bcl-2, р53, mdrlb и 0.2 мМ - для гена mdrla. Для получения специфических продуктов для генов mdrla и mdrlb использовали 26 и 24 циклов амплификации, соответственно; для генов bcl-2 и р53 использовали 31 цикл амплификации. Праймеры р-актина добавляли в реакционную смесь для генов mdrla, mdrlb после 3-ого и 1-ого цикла, соответственно, и для генов bcl-2 и p53 после 6-ого цикла. Амплификацию проводили в следующих условиях: 1 цикл, денатурация - 95С, 5 мин; плавление праймеров - 57С; 1 мин; элонгация - 72С, 1 мин. Следующие циклы амплификации проводили в условиях: 94С, 1 мин; 57С, 1 мин; 72С, 1 мин. Последний цикл амплификации, элонгацию, проводили в течение 5 мин при 72С. Отсутствие загрязнений в ПЦР контролировали при замене кДНК пробы на чистую дистиллированную воду. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле, либо с помощью 8%-ного ПААГ электрофореза в нативных условиях. Полученные изображения полос обрабатывали с помощью компьютерной денситометрии (Gel-Pro Analyzer 4.0). Для определения уровня экспрессии мРНК интегральную оптическую плотность полос, соответствующих ген-специфическим ПЦР-продуктам, нормализовали на оптическую плотность продукта В-актина.
Реакционную смесь, содержащую антисмысловую и смысловую цепи siPHK (по 20 мкМ для экспериментов in vitro и ex vivo и по 3 мкг для экспериментов in vivo) в буфере Н, инкубировали в течение 1 мин при 90С, затем в течение 1 часа медленно охлаждали до 37С в алюминиевом термоблоке. Образование дуплекса анализировали электрофорезом в 15%-ном ПААҐ в нативных условиях в буфере ТВЕ. Полученные дуплексы siPHK хранили при - 20С.
Трансфекцию клеток RLS40 проводили в присутствии липофектамина в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Перед трансфекцией клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин. в течение 5 мин. Супернатант удаляли, к осадку клеток добавляли свежую IMDM, не содержащую сыворотки и антибиотиков до конечной концентрации 1.25x106 кл/мл. Далее клетки рассаживали по 1.2 мл на лунку 12-луночного и 2 мл на лунку 6-луночного планшета. Липофектамин смешивали с Opti-MEM (4 мкл липофектамина и 150 мкл среды на лунку 12-луночного и 8 мкл липофектамина и 250 мкл среды на лунку 6-луночного планшета) и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. siPHK и FITC-asE смешивали с Opti-MEM таким образом, что при добавлении к клеткам диапазон концентраций siPHK составлял от 20 - 200 нМ (1.5 - 15 мкл 20 мкМ siPHK и 150 мкл Opti-MEM на лунку 12-луночного и 2.5 - 25 мкл 20 мкМ siPHK и 250 мкл Opti-MEM на лунку 6-луночного планшета). Растворы липофектамина и siPHK смешивали, инкубировали 20 мин при комнатной температуре для образования комплексов и добавляли к клеткам. Трансфекцию клеток проводили в атмосфере 5%-ного С02 при 37С в течение 4 ч, после чего среду заменяли на среду IMDM, содержащую 10%-ную FBS и 1%-ный раствор антибиотиков и антимикотика и инкубировали при 37С в течение 24 - 96 ч.
На 10 - 12 день развития опухоли RLS4o асцитную жидкость собирали, получали первичную культуру опухолевых клеток, как описано в 2.2.2. 4.8 мл клеточной суспензии с концентрацией 1.25х106 кл/мл помещали в культуральный флакон. 20 мкл липофектамина смешивали с 600 мкл Opti-MEM и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. siPHK смешивали с Opti-MEM таким образом, что при добавлении к клеткам концентрация siPHK составляла 100 нМ для mdrib-siPHK (30 мкл 20 мкМ mdrib-siPHK и 600 мкл Opti-MEM) и 200 нМ для bcl-2 siPHK (60 мкл 20 мкМ bcl-2-siPHK и 600 мкл Opti-MEM). Растворы липофектамина и siPHK смешивали, инкубировали 20 мин при комнатной температуре для образования комплексов и добавляли к клеткам. Трансфекцию клеток проводили в атмосфере 5%-ного С02 при 37С в течение 4 ч. По окончании инкубации клетки два раза отмывали в PBS и разводили в нём же до концентрации 2x106 кл/мл для трансплантации мышам.
Собственную чувствительность клеток линий LS, RLS и RLS4o к цитостатикам, а также их восприимчивость к цитостатикам после трансфекции siPHK, определяли с помощью МТТ теста [405]. Для этого интактные клетки или/и клетки, проинкубированные с siPHK, через 2-е суток после трансфекции высаживали в 96-луночные планшеты по 3x104 клеток на лунку, добавляли винбластин (в диапазоне концентраций 1 - 100 нМ для клеток линии LS и RLS и 10 - 700 нМ для клеток линии RLS4o), либо доксорубицин (в диапазоне 1 - 200 нМ для клеток линии LS и RLS и 0.5 -30 мкМ для клеток линии RLS4o), либо цитарабин (в диапозоне - 0.1 - 1 мкМ для клеток линии LS и RLS и 0.1 — 4 мкМ для клеток линии RLS40) и инкубировали в течение 48 часов при 37С в атмосфере 5%-ного С02. После окончания инкубации к клеткам добавляли раствор МТТ до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3-4 ч в тех же условиях. Среду удаляли, образовавшиеся в клетках кристаллы формазана растворяли в 100 мкл DMSO и измеряли оптическую плотность по разности поглощения на длинах волн Д(А57о - А6зо) нм на многоканальном спектрофотометре. Данные представляли в виде процента живых клеток относительно контроля.
Противоопухолевый потенциал siPHK в комбинации с химиотерапией
Несмотря на достижения современной фармакологии, эффективность химиотерапии опухолей остается недостаточной. Серьёзным препятствием в достижении желаемого эффекта терапии является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - приобретение опухолевыми клетками перекрёстной устойчивости к широкому спектру химиопрепаратов. Для преодоления приобретённого в результате лечения синдрома МЛУ раковых клеток необходимо увеличивать дозы химиопрепаратов, что оказывает значительное токсическое действие на организм и еще больше закрепляет и усиливает неблагоприятный синдром. МЛУ опухолевых клеток обеспечивается несколькими механизмами [1], основными из которых являются обратный транспорт цитостатиков из опухолевых клеток под действием Р-гликопротеина [2, 3], кодируемого геном mdrl у человека и генами mdla и mdrlb у мыши, и нарушение механизмов апоптоза в результате гиперэкспрессии генов супрессоров апоптоза bcl-2 и bcl-x [4]. Поэтому проблема повышения эффективности действия противоопухолевых препаратов в отношении резистентных к химиотерапии опухолевых клеток является актуальной в настоящее время. Генная модуляция опухолевых клеток, основанная на явлении РНК интерференции, может оказаться перспективным инструментом для увеличения чувствительности опухолевых клеток к химиотерапии. В данной работе была проведена оценка потенциала малых интерферирующих РНК, гомологичных мРНК генов mdrlb и bcl-2 у мыши, в комбинированной терапии опухоли с выраженным синдромом МЛУ, включающей избирательное подавление экспрессии генов mdrlb и bcl-2 и последующее лечение цитостатиками in vitro и in vivo.
Для тестирования комбинированной терапии было необходимо разработать адекватную модель опухоли на мышах, обладающей выраженным фенотипом МЛУ. В качестве кандидатов для разработки модели нами были рассмотрены два субштамма перевиваемых лимфосарком у мышей - LS и RLS, полученных профессором к.б.н. Поповой Н.А. и коллегами (ИЦиГ СО РАН). Эти субштаммы характеризуются разной чувствительностью к апоптогенному действию циклофосфамида, метаболит которого, образующийся в печени, является индуктором апоптоза. Лимфосаркома LS, полученная у мышей линии СВА путем однократной инъекции нитрозометилмочевины [Ошибка! Закладка не определена.], проявляла высокую чувствительность к циклофосфамиду: её полная регрессия достигалась при внутрибрюшинном введении препарата животным в дозе 50 мг/кг. Субштамм RLS был получен из опухоли LS путем ее многократного пассирования при низких дозах циклофосфамида (15-20 мг/кг) in vivo [402]. Схема получения RLS представлена на рисунке 11. После проведения нескольких циклов селекции под действием низких доз циклофосфамида был получен субштамм RLS, который характеризовался устойчивостью к действию циклофосфамида: при его дозе 150 мг/кг регрессия опухоли RLS составила только 50%.
На первом этапе исследования был проведен поиск молекулярно-генетических различий между двумя субштаммами лимфосарком LS и RLS, проявлявших разную чувствительность к циклофосфамиду. Из асцита субштаммов лимфосарком LS и RLS были получены первичные культуры опухолевых клеток, как описано в разделе 2.2.2. Далее с помощью МТТ-теста была проведена оценка чувствительности полученных клеточных культур к набору лекарственных препаратов, традиционно используемых в химиотерапии. Для этого клетки инкубировали в присутствии винбластина, доксорубицина или цитарабина при 37С и 5%-ном насыщении С02 в течение двух суток. Восприимчивость опухолевых клеток к цитостатикам определяли с помощью МТТ-теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате [405]. На основании данных МТТ-теста определяли значение ІС5о - дозу цитостатика, при которой 50% клеток погибали. За 100% принимали количество живых клеток в контроле (клетки инкубировали в отсутствие цитостатиков). Значения 1С50 цитостатиков приведены в таблице 9. Как видно из представленных данных, значения 1С5о цитостатиков для клеток линий LS и RLS различаются. Для клеток линии RLS значения 1С5о винбластина было выше в 1.5 раза, доксорубицина - в 2,9 и цитарабина - в 1,6 раза по сравнению с соответствующими значениями Ю5о для клеток субштамма лимфосаркомы LS. Таким образом, очевидно, что линия RLS, прошедшая селекцию под действием малых доз циклофосфамида in vivo, приобрела перекрёстную резистентность и к другим цитостатикам, стандартно используемым при лечении опухолей.
На рисунке 12 представлено изменение количества живых клеток линий LS и RLS в зависимости от концентрации винбластина, доксорубицина и цитарабина. Видно, что жизнеспособность клеток линии LS снижается на 90% в диапазоне концентраций винбластина до 10 нМ. Далее в диапазоне концентраций винбластина 10-70 нМ примерно 10% клеток выживают. В опухолевой линии RLS процент выживших клеток в этом диапазоне концентраций винбластина в 2.5 - 3 раза выше, что составляет приблизительно 30% популяции. Мы предположили, что именно этот клон опухолевых клеток имеет фенотип МЛУ, и после пассирования на низких концентрациях циклофосфамида in vivo выживает и пролиферирует. Из рисунка видно, что клетки линии RLS проявляли устойчивость и к другим препаратам, таким как доксорубицин и цитарабин.
