Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Холинергическая система и механизмы ее функционирования... 9
1.2. Функциональное взаимодействие холинергическои и пептидергической систем 14
1.3. Функционирование холинергическои системы при патологиях.. 17
1.4. Нейропептиды и их обмен 20
1.5. Общая характеристика пептидгидролаз нервной ткани нелизосомальной локализации и особенности их функций 23
1.6. Физико-химические свойства и биологическая роль карбоксипептидазо-В-подобных ферментов 29
1.6.1. КарбоксипептидазаН 31
1.6.2. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Материалы исследования 41
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Модель эксперимента: методы введения препаратов 42
2.2.2. Метод определения активности карбоксипептидазы Н 42
2.2.3. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы 43
2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования 44
ГЛАВА 3. Результаты исследования 45
3.1. Распределение активности основных карбоксипептидаз в нервной ткани крыс 45
3.1.1. Распределение активности карбоксипептидазы Н в отделах 46 головного мозга и надпочечниках крыс
3.1.2. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в отделах головного мозга и надпочечниках крыс 47
3.2. Влияние холинотропных препаратов на активность основных карбоксипептидаз в нервной ткани крыс . 48
3.2.1 Влияние ареколина на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы 48
3.2.2. Влияние атропина на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы 54
3.2.3. Влияние никотина на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы 60
3.2.4. Влияние мекамиламина на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы 65
3.3. Активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы in vitro при действии холинотропных препаратов 70
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 72
Выводы 84
Литература 85
- Функциональное взаимодействие холинергическои и пептидергической систем
- Метод определения активности карбоксипептидазы Н
- Влияние ареколина на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
- Влияние мекамиламина на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
Введение к работе
В последние десятилетия, благодаря достижениям фармакологии, практическая медицина обогатилась множеством высокоэффективных лекарственных средств. Несмотря на это проблемы нейропатологии, наркомании и алкоголизма и по сей день остаются во многом нерешенными. Особенно важную роль в попытках решения этих проблем занимают лекарственные препараты, при помощи которых можно корректировать одновременно несколько функций центральной и периферической нервных систем.
Важное место занимают нейротропные вещества, которые воздействуют на холинергическую систему. Холинергические процессы участвуют в контроле психических и моторных функций, в реакции пробуждения, в обучении [55, 60, 54, 74, 91]. В медицинской практике используют центральные холиноблокаторы в качестве анксиолитиков, при паркинсонизме и шизофрении [60, 91]. Вещества, активизирующие центральные холинергические процессы, успешно применяют при болезни Альцгеймера, при которой снижено содержание холинергических нейронов в головном мозге [91, 290]. Общепризнано, что первичная фармакологическая реакция центральных холинотропных препаратов связана с активацией или блокированием холинорецепторов [60, 91, 196, 213]. Однако многообразие фармакологических эффектов (в частности, транквилизирующее, анальгезирующее влияние и т. д.) препаратов этой группы трудно объяснить только с этой позиции. Исследования показали, что действие этих препаратов на обмен медиаторов (норадреналина, серотонина, дофамина) [44, 46, 47, 51, 58], фосфолипидов [50] и синтез белка [32, 85] не дает возможности в полной мере объяснить механизм их действия. Отсутствие полной информации о механизмах функционирования холинергической системы и механизмах ее взаимодействии с другими регуляторными системами не позволяет осуществлять полную коррекцию нарушений ее функционирования при различных заболеваниях [91].
В последнее время широко обсуждается участие пептидергической системы в механизмах действия холинотропных препаратов [42, 43, 60]. Установлено, что при их введении в мозге и сыворотке крови существенно меняется уровень целого ряда нейропептидов [42, 43, 100], многие из которых играют важную роль в этиологии и патогенезе алкоголизма, наркомании, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера - заболеваний, в развитии которых участвует холинергическая система [25, 60, 91, 139, 260, 290]. Возможно, что через пептидергическую систему опосредуется значительная доля физиологических эффектов, вызванных изменениями в функционировании холинергической системы [59, 60, 161]. Молекулярные механизмы действия холинотропных препаратов на уровень биологически-активных пептидов не изучены. Активная форма регуляторных пептидов образуется в результате протеолитического процессинга пропептидов [27]. В конечных стадиях этого процесса, в результате которого образуются биологически-активные пептиды, участвуют основные карбоксипептидазы -экзопептидазы, отщепляющие «лишние» остатки аргинина и лизина с С-конца пропептидов [13, 15], в частности КПН и ФМСФ-КП. Известно, что КПН участвует в биосинтезе многих нейропептидов, таких как инсулин [13, 162,275], глюкагон [96], энкефалины [96,98], АКТГ [102], вазопрессин [103], окситоцин [104], вещество Р [105], атриальный натрийуретический фактор [86]. Поскольку многие из этих пептидов принимают участие в ответе организма на введение холинотропных препаратов [42, 43, 52, 60, 69, 100, 130, 158, 185, 248], то возможно, что КПН вовлекается в развитие этих реакций. Предполагают, что функции недавно обнаруженной ФМСФ-КП сходны с таковыми КПН [18, 21, 27]. Однако роль этого фермента, практически, не изучена.
Целью нашей работы было выяснение роли основных карбоксипептидаз (КПН и ФМСФ-КП) в механизмах взаимодействия холинергической и пептидергической систем при введении токсических доз холинотропных препаратов.
При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
Изучить активность исследуемых карбоксипептидаз в динамике у крыс при введении м-холиномиметика ареколина (2 мг/кг), м-холинолитика атропина (2,5 мг/кг) в различных отделах головного мозга и надпочечниках.
Изучить активность исследуемых карбоксипептидаз в динамике у крыс при введении н-холиномиметика никотина (1 мг/кг) и н-холинолитика мекамиламина (1 мг/кг) в различных отделах головного мозга и надпочечниках.
Изучить активность исследуемых ферментов in vitro при действии аналогичных доз данных препаратов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние холинотропных препаратов на активность КПН и ФМСФ-КП. Установлена зависимость изменения активости исследуемых ферментов от типа холинотропного воздействия, отдела нервной системы и времени после введения. Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов функционирования холинергической и пептидергической систем и проясняют роль основных карбоксипептидаз в механизмах взаимодействия систем классических нейромедиаторов с пептидергическими системами. Полученные результаты могут быть положены в основу при разработке эффективных терапевтических воздействий в лечении комплексных заболеваний ЦНС, таких, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, наркомания и алкоголизм, затрагивающих одновременно несколько регуляторных систем.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Международной нейрохимической конференции (Россия, Москва,
14-16 марта 2005 г), на V Сибирском физиологическом съезде (Россия, Томск, 29 июня - 1 июля 2005 г) и на итоговых научных конференциях ПГПУ (2005, 2006 гг.). По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на 114 страницах, иллюстрирована 8 рисунками, 12 таблицами и схемой. Список литературы содержит 299 наименований на русском и иностранных языках.
Функциональное взаимодействие холинергическои и пептидергической систем
В последние годы появляется все больше сведений о том, что холинергическая система имеет тесные функциональные связи с пептидергической. Для многих холинреактивных нейронов установлена совместная локализация в пресинаптическом окончании везикул содержащих АХ и некоторые нейропептиды, в том числе нейропептид Y, который является трансмиттером симпатической системы [130, 296]. Предполагается возможность непосредственного взаимодействия многих холинотропных препаратов с опиатными рецепторами [60]. Проведенные исследования показали, что под влиянием холиноблокаторов снижается рецепторное связывание опиоидных пептидов [60]. Было обнаружено значительное изменение уровня многих регуляторных пептидов при действии высоких доз холинотропов. Так, агонисты н-ХР вызывают снижение концентрации АКТГ, соматотропина, пролактина, лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, вазопрессина, /3-эндорфина и гонадотропин-рилизинг-фактора в крови животных [100, 158]; холиноблокаторы вызывают отчетливое снижение содержания в мозге и сыворотке крови энкефалинов и /3-эндорфина [42, 43]. По данным Hortnagl et al. [185] ингибирование холинацетилтрансферазы приводит к снижению уровня соматостататина и повышению уровня нейропептида Y в мозге крысы. Под контролем холинергических нейронов находится секреция атриального натрийуретического пептида [158].
Взаимодействие пептидной и холинергической систем, вероятно осуществляется как на пре-, так и на постсинаптическом уровне. Это было продемонстрировано на изолированной мембране диализированных нейронов виноградной улитки. Было установлено, что энкефалины повышают амплитуду входящего тока мембраны в ответ на действие ацетилхолина и, кроме того, замедляют время полного блокирования ацетилхолинового ответа мембраны при аппликации холиноблокаторов [81, 161]. Таким образом, снижение уровня опиоидных нейропептидов при действии холинолитиков, с одной стороны, способствует усиленному высвобождению медиаторов из пресинаптического депо [45, 46, 47, 51, 58], а с другой, - уменьшает эффективность холинергической передачи на постсинаптическом уровне [81, 161]. В экспериментах на сердце моллюска аплизии показано, что экстракт из пазушных клеток моллюска, содержащий нейропептиды, вызывающие откладку яиц, запускает остановленное сердце и увеличивает ритм и амплитуду сокращений; чувствительность к АХ, определяемая по величине тонической реакции, возрастает в несколько раз; увеличивается время выхода из торможения [69]. Интересной представляется способность экстракта из пазушных клеток устранять десенситизацию, вызванную медиатором: даже кратковременная обработка сердца нейропептидами приводит не только к полному восстановлению, но и к увеличению уровня чувствительности к АХ [69]. Бергман, Нистратова сообщают о значительном усилении ацетилхолинового эффекта в кишке морской свинки под влиянием вещества Р и эледоизина [69].
В настоящее время не вызывает сомнений, что через пептидергическую систему опосредуются транквилизирующий и анальгезирующий эффекты высоких доз АХ и его блокаторов, нарушение памяти, внимания, а также эффекты психомоторного возбуждения или торможения. Было установлено, что при повторных введениях холинолитиков в психотоксических дозах наблюдается редукция психопатологической симптоматики, то есть развивается эффект толерантности [59]. При этом в плазме крови и ликворе животных значительно увеличивается концентрация энкефалинов и /5-эндорфина, которые, возможно, и выполняют функцию факторов толерантности [59]. Это подтверждается данными о том, что мет-энкефалин способен купировать психомоторное возбуждение у крыс, вызванное хинуклидинил-3-бензилатом [197]. Имеются также данные о том, что вазопрессин, окситоцин и его С-концевой трипептид способны восстанавливать след памяти при амнезии, вызванной интоксикацией гликолатами [24].
Показанное во многих исследованиях участие нейропептидов в регуляции деятельности холинергическои системы делает вполне обоснованным предположение о том, что в механизмах действия холинотропных препаратов на процессы обучения и памяти существенная роль принадлежит регуляторным пептидам. Изменения функционального состояния холинергическои системы мозга путем оперативных или фармакологических воздействий приводили к выраженным модификациям эффектов ряда энкефалинов [61]. В частности, повышение содержания ацетилхолина в мозге предотвращало вызванное мет-энкефалином ухудшение обучения, хотя введение мет-энкефалина не сопровождается изменениями содержания моноаминов в мозге. Кроме того, под влиянием системного введения аналогов вазопрессина изменялась чувствительность кортикальных нейронов к микрофоретически подводимому ацетилхолину [61]. Следствием изменений хемореактивных свойств нейронов являются изменения эффективности соответствующих нейромедиаторных систем, что может приводить к модификациям процессов обучения и памяти [61].
Таким образом, факты, свидетельствующие о влиянии холинотропных препаратов на функционирование пептидергических систем, позволяют предположить, что холинергическая система играет важную роль в регуляции обмена нейропептидов. В связи с этим представляет интерес изучение активности ферментов обмена нейропептидов: КПН и ФМСФ-КП при введении разных типов холинотропных препаратов: м-холиномиметика ареколина, м-холинолитика атропина, н-холиномиметика никотина и н-холиноблокатора мекамиламина.
Отделы лимбической системы, гипоталамус и продолговатый мозг являются отделами, в которых содержание холинергических нейронов составляет значительную долю их содержания во всем мозге [60, 91, 196, 213]. Гипофиз и гипоталамус составляют функционально связанный элемент, в котором обнаружена наиболее высокая активность КПН, в надпочечниках обнаружена высокая активность ФМСФ-КП у многих видов животных [27]. Кроме того, следует отметить, что в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме, обонятельном мозге и надпочечниках уровень нейропептидов является очень высоким [3, 33,34, 35].
Именно поэтому активность исследуемых ферментов определяли в гипофизе, гипоталамусе, обонятельном мозге, стриатуме, гиппокампе, четверохолмии, продолговатом мозге и надпочечниках.
Метод определения активности карбоксипептидазы Н
В настоящее время обнаружено несколько видов мембраносвязанной и растворимой форм фермента, отличающихся по молекулярной массе. В растворимой фракции очищенных секреторных гранул, содержащих инсулин, выявлена форма КН с Mr 55 кДа [123]. В передней доли гипофиза обнаружено две формы КПН - с Mr 56 и 53 кДа, а в задней - только форма с Mr 53 кДа. Эти формы имеют сходные каталитические свойства [243, 244]. Различия в молекулярной массе мембраносвязанной и растворимой форм КПН, по-видимому, связано с наличием у первой, так называемого "мембранного якоря". С-концевая область мембраносвязанной КПН (51 аминокислотный остаток) образует амфифильную сс-спираль, которая и может служить гидрофобным "мембранным якорем" [137, 229, 287]. С другой стороны, D. Parkinson [243, 244] высказывает сомнения относительно возможности перехода мембраносвязанной формы в растворимую посредством С-концевого протеолиза.
Карбоксипептидаза Н является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится Zn2+ [180,181]. Фермент имеет оптимум рН 5,5-6,0 [131,160,181,265,294], pi 4,9 [211],ингабируетсяСиС12,НС12,р хлормеркурфенил сульфатом, АПМЯК, 2-меркаптометил-З гуанидилэтилтиопропановой кислотой, ЭДТА и 1,10-фенантролином [131, 155, 176, 181]. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с Kj 8,8 и 7,5, соответственно [123, 151, 257, 280]. КПН ингибируется Met- и Leu-энкефалинами, веществом Р, вазопрессином, окситоцином, тиреотропин-рилизинг-фактором [179, 246, 258]. С окситоцином и АКТГ ингибирование проявляется уже при концентрации 2-20 мМ [179]. К, для Met-энкефалина, Leu-энкефалина, Ме энкефалин-А -Gly -Leu и Met-энкефалин-А 6-Рпе7 равны, соответственно, 12,0, 6,5, 7,0 и 5,5 мМ [179]. Лизин и аргинин являются конкурентными ингибиторами КПН. Kj для аргинина и лизина равны, соответственно, 4,6±1,3 и 7,6±1,9 [175]. Бромацетил-D-Arg, необратимый ингибитор КПВ и KIIN, также ингибирует и КПН [151]. Сульфат цинка, хлорид кальция, N-этилмалеимид и ФМСФ не влияют на активность КПН [131]. Фермент активируется ионами Со в 5-Ю раз, ионами Ni2+ в 2-3 раза, [123, 131, 155, 181, 257, 279, 280]. КПН способна связывать ионы Са [235]. При повышенной температуре она дестабилизируется ионами Са и стабилизируется низкой концентрацией 1-і этиленгуанидинтетрауксусной кислотой [235]. Ионы Са не влияют на активность фермента [235]. Этиленгуанидинтетрауксусная кислота в микромолярных концентрациях активирует КПН. В этом случае происходит изменение Vmax, а не Кт [235]. Уменьшение рН и увеличение концентрации ионов Са2+ индуцируют агрегацию данного фермента [276]. Освобождение КПН и инсулина из изолированных клеток Лангерганса крысы ингибируется удалением ионов Са2+ из среды [162, 163]. Таким образом, присутствие ионов Са2+ в среде может способствовать тепловой дестабилизации КПН, а также агрегации ее в проводящих путях комплекса Гольджи и освобождению из клетки. Она обладает, практически, абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми основными аминокислотами [26, 30, 131, 289]. КПН хорошо отщепляет остатки -Lys и -Arg от Arg8-вазопрессин-Gly-Lys-Arg, а также превращает 1251-Ме1 энкефалин-Ащ и 1251 35 Ме энкефалин-Ьуэ в I-Met-энкефалин [176, 181]. Фермент отщепляет остатки -Lys15-Lys16-Arg17 с карбоксильного конца фрагмента АКТГ (АКТГі. і4) и остатки -Arg с С-конца гиппурил-L-Arg и Leu-энкeфaлин-Arg [289]. КПН с очень низким сродством отщепляет остаток гистидина с карбоксильного конца проокситоцина [238,272]. Уровни мРНК КПН и активности КПН в мозге и тканях в целом коррелируют между собой [107, 146]. мРНК КПН и ферментативная активность обнаружена в клонах эндокринных клетках - AtT-20, GH-3, GH4C1 и неэндокринных -L, ЗТЗ, SK-HEP-1, НЕК293, COS, С127 [133,191]. Наивысшие уровни мРНК КПН обнаружены в пирамидальных клетках гиппокампа, в передней и промежуточной долях гипофиза, эпендимных клетках боковых желудочков мозга, базолатеральной миндалине, супраоптическом и паравентрикулярном ядрах. Средние уровни мРНК КПН у крыс обнаружены в таламусе, медиальном коленчатом ядре, коре мозжечка и промежуточной оливе. Наименьшие уровни выявлены в гранулярном клеточном слое гиппокампа, латеральном гипоталамусе, бледном шаре и в ретикулярной формации ножки мозга [210]. Высокая экспрессия мРНК КПН отмечена в паравентрикулярном и супраоптическом ядрах гипоталамуса - местах преимущественного синтеза окситоцина и вазопрессина [112]. Обнаружено увеличение концентрации мРНК КПН при увеличении содержания этих двух пептидов [112]. В то же время, в других зонах мозга с высоким уровнем нейропептидов не наблюдается изменений уровня мРНК КПН при осмотической стимуляции [112].
Отделы мозга отличаются по уровню активности КПН более чем в 10 раз. Распределение активности этой карбоксипептидазы в целом соответствует распределению нейропептидов [31, 41, 155, 209]. Максимальная активность растворимой формы фермента обнаружена в гипофизе: в передней доли - в 20 раз больше, чем в задней [155, 207, 243, 277,281]. Далее по мере снижения активности следуют стриатум, гиппокамп, кора больших полушарий, таламус с гипоталамусом, средний мозг и мозжечок [277]. При этом в гипоталамусе высокая активность КПН обнаружена в медиальном возвышении, супраоптическом, паравентрикулярном и супрахиазматическом ядрах [159]. Супраоптическое ядро (богатое телами нейронов) содержит, в основном, неактивную 65 кДа форму КПН. Срединное возвышение и гипофизарная ножка - богатые аксонами области - содержат формы КПН как с Mr 65 к Да, так и с Mr 55 кДа. Нервные окончания задней доли гипофиза содержат, в основном, форму КПН с Mr 55 кДа [178]. В стриатуме высокое содержание имуннореактивной КПН отмечено в стриасомах (клетках богатых веществом Р) [119, 246]. В гиппокампе КПН обнаружена в пирамидальных клетках и во внутренней части молекулярного слоя зубчатой извилины. Фермент также обнаружен в центральных нейронах миндалины [207]. Кроме этого, активность КПН обнаружена в сердце - правом и левом предсердиях (активность в тканях желудочков очень низкая) [208, 209]. Имеются сведения о наличии активности КПН в водянистой жидкости глаза человека [242]. Тканевое и региональное распределение КПН сходно у разных видов животных (например, у быка, крысы, мыши, акулы, Xenopus и Aplysia) и человека [150, 191].
Влияние ареколина на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
Результаты исследования активности КПН в отделах мозга и надпочечниках самцов крыс при введении ареколина в дозе 2 мг на кг массы представлены на рис. 3.2.1.1. Через 4 и 24 ч после инъекции активность фермента в гипофизе по сравнению с контрольными самцами была ниже примерно на 30% и 40% соответственно. В гипоталамусе и четверохолмии активность КПН была снижена через 24 ч на 30% и 50% соответственно, а через 72 ч на 40% в обоих отделах. В продолговатом мозге, гиппокампе и стриатуме активность исследуемой карбоксипептидазы через 0,5 ч снижалась примерно на 20%, через 4 и 72 ч на 50%». В обонятельном мозге активность фермента снижалась через 4, 24 и 72 ч на 40% по сравнению с контролем. В надпочечниках активность исследуемого фермента была снижена на 55% через 0,5 ч, а через 4, 24 и 72 ч не отличалась от таковой у контрольных животных.
Для более полного понимания характера выявленных изменений активности основных карбоксипептидаз первичный экспериментальный материал бы подвергнут дисперсионному анализу влияния времени после инъекции ареколина (таблица 3.2.1.1).
Дисперсионный анализ показал отсутствие влияния времени на активность КПН при введении ареколина в гипофизе, обонятельном мозге, продолговатом мозге, гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках. Однако в четверохолмии и гиппокампе наблюдается достоверная зависимость активности исследуемого фермента от времени. При этом в четверохолмии наблюдается повышение активности лишь через 4 ч, в то время как в гиппокампе активность КПН повышалась через 24 ч с последующим резким снижением активности через 72 ч.
Таким образом, введение ареколина в дозе 2 мг/кг вызывало существенное снижение активности карбоксипептидазы Н во всех отделах мозга и надпочечниках, причем наблюдались длительные, сохраняющиеся, по крайней мере, в течение 72 часов изменения активности фермента.
В гипофизе активность ФМСФ-КП после введения ареколина через 0,5, 4 и 24 ч была ниже соответственно на 55, 50 и 65% по сравнению с контролем (рис. 3.2.1.2). В обонятельном мозге через 0,5 ч после введения активность исследуемого фермента не изменялась, а через 4, 24 и 72 ч снижалась на 40,20 и 45% соответственно. В четверохолмии активность ФМСФ-КП через 4 и 24 ч снижалась на 45-55% относительно контроля. В продолговатом мозге и стриатуме активность исследуемой карбоксипептидазы снижалась через 4 ч на 40-45%, а через 24 и 72 ч не отличалась от контрольной группы. В гипоталамусе активность данного фермента через 4 ч была на 55%, а через 72 ч на 50%) ниже, чем у контрольных животных. В гиппокампе активность ФМСФ-КП не отличалась от контроля во все исследуемые промежутки времени. В надпочечниках наблюдалось снижение активности исследуемого фермента через 0,5 ч на 40%), а через 4 ч на 65%, тогда как через 24 и 72 ч активность фермента не отличалась от контроля.
Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции при введении ареколина на активность ФМСФ-КП (таблица 3.2.1.2) показал, что статистически значимая динамика изменения активности ферментанаблюдается в гипофизе, обонятельном мозге, гипоталамусе, гиппокампе, стриатуме и надпочечниках.
В гипофизе и обонятельном мозге активность ФМСФ-КП изменялась сходным образом: повышалась через 4 ч с последующим снижением активности через 24 и 72 ч. В гипоталамусе и гиппокампе наблюдалась скачкообразная динамика изменения активности: понижение активности через 4 ч с последующим повышением через 24 ч и понижением через 72 ч. В стриатуме активность ФМСФ-КП плавно снижалась к 72 ч, в то время как в надпочечниках активность фермента повышалась через 24 ч и понижалась через 72 ч.
Таким образом, активность ФМСФ-КП при введении ареколина изменялась сходным с КПН образом - наблюдалось значительное снижение активности во всех отделах мозга и надпочечниках, однако в изменении активности ФМСФ-КП наблюдались некоторые отличия: в гипофизе и надпочечниках снижение активности данного фермента было более выражено, тогда как для КПН было характерно более значительное снижение активности в стриатуме. Поскольку КПН и ФМСФ-КП отличаются субстратной специфичностью [21, 176,177], то возможно, подобное различие в изменении активности связано с участием исследуемых карбоксипептидаз в процессинге разных биологически активных пептидов, уровень которых в гипофизе, стриатуме, гиппокампе и надпочечниках по-разному изменяется при введении ареколина [185,296].
Влияние мекамиламина на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
Использование природных нейропептидов и их синтетических аналогов открыло перспективы для их применения при разного рода нарушениях в функционировании холинергической системы и при интоксикациях холинотропами [24, 59, 197]. Однако, ограничения, связанные с трудностью введения регуляторных пептидов в мозг, снижают возможности их использования и дальнейшего изучения возможностей их применения при различного рода нарушениях в функционировании холинергической системы [27, 60]. Знание путей образования и инактивации регуляторных пептидов, участвующих в функционировании холинреактивной системы, позволит, избирательно воздействуя на ферменты их метаболизма, регулировать уровень регуляторных пептидов.
Максимальная активность КПН у интактных животных обнаружена в гипофизе, а также в гипоталамусе, то есть в тех отделах, которые характеризуются высоким уровнем нейропептидов [33, 34, 35, 127]. Низкая активность фермента выявлена в надпочечниках.
Наибольшая активность ФМСФ-КП отмечена в надпочечниках и гипофизе. В надпочечниках синтезируется достаточно большое количество мет-энкефалина [33, 34, 35], однако активность КПН в этом органе невелика. Обнаружена примерно одинаковая активность КПН и ФМСФ-КП в гипоталамусе и стриатуме, некоторые отличия в активности ферментов в гипофизе и существенные в надпочечниках, где активность ФМСФ-КП существенно выше, чем КПН.
Необходимо отметить, что в гипофизе - отделе, в котором синтезируются многие нейропептиды и гормоны пептидной природы [256], активность КПН существенно не отличается от таковой для ФМСФ-КП, в то время как в надпочечниках - отделе, где синтезируется большое количество мет-энкефалина [16, .17], активность ФМСФ-КП существенно выше активности КПН. Как показывают данные некоторых исследований, пептидные гормоны, синтезирующиеся в гипофизе, содержат в неактивной форме перед остатком основной аминокислоты остатки аминокислот -аланина и глицина [27]. Образующиеся в надпочечниках энкефалины содержат в качестве предпоследних остатки гидрофобных аминокислот -лейцина и метионина [27]. Принимая во внимание особенности регионального распределения КПН и ФМСФ-ингибируемой КП можно высказать предположение об участии этих ферментов в процессинге предшественников неиропептидов, различных по своему качественному составу. Возможно, что ФМСФ-КП участвует в процессинге проформ, содержащих в качестве предшествующей основным аминокислотам -аргинину и лизину, гидрофобной аминокислоты. Что же касается КПН, то она, вероятно, участвует в процессах модификации большой группы пропептидов с предшествующей..аминокислотой, содержащей короткий алифатический радикал (аланин и глицин) [12, 13, 145], а не только в процессинге энкефалинов, как предполагалось ранее [144, 151, 154, 155]. Подобное предположение позволяет объяснить противоречие в несоответствии распределения по отделам КПН и энкефалинов.
Наши данные по распределению ФМСФ-КП в нервной ткани крысы хорошо согласуются с данными других авторов о распределении фермента в мозге крыс, кошек, мышей и ежа, и в целом, - с распределением по отделам неиропептидов [27]. Максимальная активность фермента обнаружена в гипофизе и надпочечниках, то есть в органах, связанных с образованием неиропептидов, участвующих в нейрогуморальной регуляции функций организма [33, 34, 35], это позволяет сделать предположение о возможном участии ФМСФ-КП в процессинге биоактивных пептидов.
Влияние ареколина, атропина, никотина и мекамиламина на активность как КПН, так и ФМСФ-КП, у крыс было однонаправленным: активность ферментов снижалась в большинстве отделов нервной системы (рис. 3.2.1.1,3.2.1.2, 3.2.2.1,.3.2.2.2, 3,2.3.1, 3.2.3.2, 3.2.4.1 и 3.2.4.2). Эти результаты хорошо согласуются с наблюдаемым торможением ВНД (подавление условных и безусловных рефлексов, нарушение внимания и всех видов памяти) при действии высоких доз холинактиваторов и холиноблокаторов [46, 47, 54, 55, 60, 66, 82, 89, 141, 231, 232, 251, 252, 295], а также с данными о снижения уровня большинства нейропептидов в мозге и сыворотке крови при введении холинотропных препаратов [42, 43, 59, 60, 69, 100, 130, 158, 185, 248]. Так, высокие концентрации м-холинактиваторов вызывают снижение уровня атриального натрийуретического пептида в мозге животных, уменьшение концентрации нейропептида Y в гипоталамусе крыс [158, 185]. При введении атропина наблюдается отчетливое снижение уровня мет- и лей-энкефалинов и /3-эндорфина в мозге и сыворотке крови крыс [42, 43, 60]. Кроме того, блокада м-холинреактивной системы, наблюдаемая при действии атропина, приводит к понижению содержания соматостатина в гиппокампе крыс [185]. Высокие дозы никотина вызывают изменение концентрации целого ряда регуляторных пептидов в сыворотке крови животных: АКТГ, соматотропина, пролактина, лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, вазопрессина, /?-эндорфина и гонадотропин-рилизинг-фактора [100]. Введение блокаторов н-холинорецепторов приводит к снижению уровня атриального натрийуретического пептида в мозге животных [185].
