Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. CLASS Обзор литератур CLASS ы 9
1.1. Биохимическая характеристика церулоплазмина 9
1.2. Способы выделения церулоплазмина 31
1.3 Клиническое применение церулоплазмина 34
ГЛАВА II. Материалы и методы 39
П. 1. Материалы 39
II.2. Методы 39
П.2. 1. Количественное определение белка в препарате ЦП 39
П.2. 2. Определение степени очистки 39
II. 2. 3. Электрофорез на плёнках из ацетата целлюлозы 39
II.2. 4. Иммуноэлектрофорез по методу Grabar 40
II.2. 5. Гель-проникающая хроматография низкого давления 40
II.2. 6. Определение ферментативной активности 41
II.2. 7. Электрофорез в полиакриламидном геле 41
П.2. 8. Исследование антигипоксических свойств ЦП на модели гипобарической гипоксии 42
II.2. 9. Определение пирувата 43
П.2. 10. Определение количества лактата 43
П.2. 11. Определение свободнорадикальной интенсивности методом индуцированной хемилюминесценции 43
Щ, И.2. 12. УФ-спектроскопия первичных продуктов ПОЛ 44
II.2. 13. Определение активности СОД 44
П.2. 14. Определение активности каталазы 45
П.2. 15. Количественное определение содержания ЦП 45
II. 2.16. Общеклинические показатели 46
II. 2. 17. Иммунизация животных 46
П.2. 18. Методы статистической обработки 46
ГЛАВА III. Результаты исследования 47
III. 1. Оптимизация технологии получения церулоплазмина 47
111.2. Состав и функциональная активность препарата церулоплазмина 50
111.3. Изучение фармакокинетики ЦП в эксперименте на животных 59
111.4. Антигипоксические свойства церулоплазмина 62
Ш.5. Влияние церулоплазмина на показатели эндогенной интоксикации у больных острым деструктивным панкреатитом 66
Заключение 71
Выводы 80
Список литературы 81
- Способы выделения церулоплазмина
- Электрофорез на плёнках из ацетата целлюлозы
- Общеклинические показатели
- Антигипоксические свойства церулоплазмина
Введение к работе
Последние годы характеризуется возрастанием интереса к мультимедийной оксидазе - церулоплазмину. Установлена его структура. Определена роль ионов меди в ферментативном процессе (Hellman N. et al., 2002; Va-chette P. et al., 2002). Показано, что ЦП окисляет токсические формы железа и переводит их в нетоксические, защищая ткани от повреждения их свободными радикалами. На протяжении многих лет ЦП успешно применяли в послеоперационном лечении онкологических больных. Введение ЦП оказывало нормализующее действие на окислительно-антиокислительный баланс (Н.В. Эделева с соавт., 1997; Н.В. Эделева с соавт.,2001).
В настоящее время полагают, что антиоксидантный эффект ЦП может быть важным при лечении различных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера (Patel В. N. et al., 2002). Обнаружена группа наследственных заболеваний - ацерулоплазминемия. У больных с ацерулоплазминемией отмечено накопление железа в тканях, включая печень, поджелудочную железу и мозг, которое стимулирует производство свободных радикалов кислорода и вызывает повреждение тканей. Церулоплазмин уменьшает эту способность (Takeuchi Y.et al., 2002).
Существует вероятность, что ЦП как антиоксидант может быть полезен при явлениях гипоксии - реоксигенации, связанных с окислительными стрессами. В экспериментах на животных показано, что повреждения, вызванные гипоксией и реоксигенацией могут быть уменьшены введением ряда ферментов, контролирующих этот процесс (Horakova, L. et al. 1997).
Расширение спектра применения препарата сдерживается небольшими объемами его производства. Ведутся поиски различных источников получения ЦП, включая создание рекомбинантных форм фермента (Bielli P. et al., 2001). Большинство производителей для получения ЦП используют фракцию III, хотя выход фермента не превышает 5-8 доз с одного килограмма осадка. Для повышения производства препарата необходимо расширить поиск дру-
гих источников сырья. Ранее предпринимались попытки выделить ЦП из фракций, образующихся в процессе спиртово-каприлатного способа получения альбумина (А.Г. Исрафилов, 1993), но они оказались неудачными. Несмотря на многолетний опыт выделения фермента, остаются также нерешенными ряд проблем, связанными с методом получения - повреждениями структуры и потерей ферментативной активности в процессе производства и хранения.
Поэтому поиск новых источников сырья и разработка условий стабилизации ЦП является важнейшей научно-производственной задачей.
Цель исследования
Разработка технологии получения стабильного церулоплазмина из фракции плазмы крови IV-I Кона и оценка его свойств в эксперименте и клинике.
Задачи исследования
Провести сравнительную оценку содержания фермента в неиспользуемых фракциях спиртового метода при производстве иммуноглобулинов и альбумина.
Разработать технологию получения стабильного высокоочищенного препарата из фракции IV-I Кона и оценить изменения параметров лекарственного средства в процессе производства и хранения.
Изучить фармакокинетику препарата при введении экспериментальным животным.
Исследовать влияние церулоплазмина на экспериментальных животных в условиях гипобарической гипоксии.
Изучить влияние ЦП на биохимические показатели у больных с острым деструктивным панкреатитом.
Научная новизна
Разработан метод получения ЦП, включающий избирательную денатурацию балластных белков фракции IV-I при рН 5,6-5,7 и температуре 60С, адсорбцию фермента из раствора на ДЕАЕ-сефадексе А-50, элюцию ЦП с анионообменника при данном рН с последующей его очисткой хлороформом и концентрированием этанолом. На новые элементы технологии получен патент на изобретение №2162338.27.01.2001.
Установлено, что изменение физико-химических свойств и оксидазной активности ЦП на этапах лиофилизации и в процессе хранения связаны с превращением голо-ЦП в апо-ЦП и полимеризацей апо-ЦП.
Разработан новый способ стабилизации голо-ЦП посредством добавления в препарат маннитола.
Впервые продемонстрирован антигипоксический эффект ЦП на модели гипобарической гипоксии. Показано, что антигипоксический эффект отмечается, как при внутривенном, так и при внутримышечном введений.
Впервые показано, что ЦП способствует нормализации параметров воспалительного ответа и показателей эндогенной интоксикации при панкрео-некрозах.
Практическая значимость
Технология получения ЦП из фракции плазмы крови IV-I Кона внедрена на Нижегородском государственном предприятии - фирме «Имбио». По материалам настоящей диссертационной работы разработан промышленный регламент на препарат церулоплазмин лиофилизированный для инъекций №01898718-30-2000, согласованный с Гематологическим научным центром РАМН.
В экспериментах на животных установлен факт поступления в кровяное русло ЦП при внутримышечном введении с сохранением ферментативной активности, что свидетельствует о возможности внутримышечного введения препарата.
Установлено, что введение ЦП больным острым деструктивным панкреатитом снижает эндогенную интоксикацию организма, что может явиться основанием применения препарата при данном заболевании.
Основные положения, выносимые на защиту:
Технология получения ЦП из фракции плазмы крови IV-I Кона, состав и свойства препарата.
Антигипоксический эффект ЦП проявляется как при внутривенном, так и при внутримышечном введении.
ЦП корректор эндогенной интоксикации у больных острым деструктивным панкреатитом.
Способы выделения церулоплазмина
В настоящее время известно большое число методов получения ЦП. Фермент может быть выделен, как из цельной сыворотки крови, так и из различных фракций образующихся при спиртовом разделении плазмы крови.
В период 50-60-х годов последовал ряд работ по выделению ЦП, в которых были использованы различные подходы, с использованием различных фракционирующих агентов: осаждение солями, органическими растворителями, разнообразные методы хроматографии (Берлинских с соавт., 1992; Ис-рафилов А.Г. с соавт., 1993; Соколов А.В., Соловьев К.В. 2003; Steinbuch et al., 1961; Morell et al., 1969; Oosthuizen et al., 1985; Calabrese et al., 1988; Ehrenwald, Fox, 1994; Kouoh Elombo et al.,2000).
Впервые выделение ЦП из свиной сыворотки произвел Holmberg (1948). Основой послужил метод спиртового фракционирования по Кону. Далее проводили спиртово-хлороформенное осаждение с последующим фракционированием и высаливанием сульфатом аммония 50-65% насыщения. Получали медь содержащий белок с содержанием меди 0,35% (Holmberg, Laurell 1948).
Steinbuch et al., (1961) впервые опубликовали данные о возможности использования риванола для получения ЦП. Сопутствующие глобулины осаждали риванолом при рН 6,0. ЦП преципитировался после доведения рН до 7,8 и добавления другой порции риванола до значения рН 7,3-7,5. Риванол-протеиновый комплекс диссоциирует при рН 4,0, сопутствующие белки осаждают при рН 4,0- 50% этанола.
В литературе имеются данные по выделению ЦП с помощью сульфата аммония, но недостатком данного технологического процесса было использование высоких концентраций сульфата аммония и нестабильность полученного фермента (Osaki, 1966).
Высокую степень очистки можно получить, используя хроматографию на анионо- и катионообменниках в различных условиях (Morell et al., 1969; Lowenstein 1975; Oosthuizen et al., 1985; Calabrese et al., 1988; Ehrenwald, Fox, 1994; Kouoh Elombo et al., 2000). Эти методы основаны на способности ио-нообменников адсорбировать белки сыворотки крови с определенным зарядом молекулы в зависимости от рН среды.
Детально разработан ряд схем с использованием хроматографии на ДЭ-АЭ-целлюлозе. Авторами рекомендована хроматография, как наиболее мягкий способ выделения фермента (Richterich et al., 1961; Morell et al., 1969; Legras et al., 1980; Okumura et al., 1991).
Broman (1963) получил ЦП из сыворотки крови человека с помощью колоночной хроматографии на гидроксилапатите. Колонка уравновешивалась К-фосфатным буфером при значениях рН 6,8. Полученный препарат отмечался нестабильностью.
Curzon et al., (1966) выделил ЦП из отходов производства гамма-глобулина, полученного фракционированием плазмы по методу Kekwick and Маскау. Экстракцию проводили 0,07М NaCl с рН 7,0. Для освобождения от липопротеидов использовали диссоциацию и денатурацию замораживанием при температуре минус 25С; преципитацию примесей осуществляли избытком эфира. Осаждение ЦП в эфирнасыщеном экстракте проводили при рН 4,8, удаление примесей - при рН 5,35, а преципитация самого ЦП путем дальнейшего снижения ионной силы до 0,0045 М NaCl. Выход ЦП по окси-дазной активности составил 45% в сравнении с активностью в экстракте. Хроматографию проводили бач-методом. ЦП адсорбировали при рН 5,7 в 0,05М ацетатном буфере, содержащем 0,08 М NaCl. Элюцию вели тем же буфером, но с рН 5,2 и содержащим 0,25 М NaCl. До хроматографии степень очистки составляла 0,019, дальнейшая очистка на ДЭАЭ-целлюлозе повысило этот показатель до 0,033. Однако при сушке наблюдалась потеря оксидаз-ной активности.
Часто авторами предлагались комбинированные способы получения фермента.
Deutch (1960), выделил кристаллический ЦП из плазмы крови человека используя сульфат аммония и хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе уравновешенной в 0,05 М ацетатном буфере с рН 5,5. ДЭАЭ-целлюлоза бралась из расчета 5-10 мг/мл сыворотки. Около 65% ЦП выделяли хроматографически. ЦП в элюате преципитировали сульфатом аммония 40% насыщения с растворением осадка в воде с содержанием белка около 1%. Далее осуществляли сдвиг рН 7,2±0,2, с последующим центрифугированием при 0 С, преципитат удаляли. Центрифугат нагревали до температуры 19-20С и после дегазации наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,05 М ацетатным буфером с рН 7,2. Элюция проводилась при тех же условиях. Элюат собирали и осаждали 40% сульфатом аммония и доводили общий объем раствора до 1,5-3% белка. В дальнейшем проводилась кристаллизация на холоду в 0,025 М натрий ацетатном буфере с рН 5,5. По их мнению при этом значении рН сокращалась потеря меди. ЦП более стабилен в присутствии натрия хлорида, ацетата, тетрабората, а также натриевых солевых растворов. Zgirski et al., (1978), описали процесс получения бычьего ЦП хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе А-50, осаждением смесью этанол-хлороформа, солевой экстракцией, препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле.
Oosthuizen et al., (1985) использовали для выделения ЦП плазму крови человека. Преципитация полиэтиленгликолем 4000, сорбция на QAE-сефадексе, сорбция и градиентная элюция на ДЭАЭ-сефарозе CL-6B.
Берлинских с соавт., (1992), описали способ выделения ЦП из осадка Б, образующегося при производстве гаммаглобулина с использованием хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Недостатками описанного метода явилась небольшая обменная емкость сорбента и выход конечного продукта.
Исрафилов А.Г. с соавт., (1993) предложил промышленную технологию выделения ЦП из осадка Б, с проведением хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе. Это позволило улучшить степень очистки препарата.
Таким образом, используемые сегодня методы выделения ЦП не позволяют получать стабильный белок. Поэтому оптимизация существующих технологических методов производства медь содержащего фермента является достаточно актуальной.
Электрофорез на плёнках из ацетата целлюлозы
Материалом для исследований служили плазма крови человека, фракции III, IY-1 спиртового метода, а также производственные серии препарата церулоплазмина Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов - фирмы «ИмБио» выпущенные в период с 1999-2002 года.
В экспериментах использованы лабораторные животные: кролики породы шиншилла, половозрелые белые беспородные крысы-самцы (питомник "Столбовая" РАМН).
П. 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ II. 2.1. Количественное определение белка в препарате Церулоплазмин
Концентрацию белка в исследуемых образцах ЦП определяли спектро-фотометрически, измеряя оптическую плотность раствора при длине волны 280 нм, на спектрофотометре СФ-26 («ЛОМО», г.Санкт-Петербург). Определение проводили с учетом коэффициента поглощения раствора ЦП содержащего 1 мг/мл, равного 1,5, и величины разведения раствора образца.
Степень очистки ЦП определяли как соотношение оптических плотностей образца при длине волны 610 нм и 280 нм.
Анализ осуществляли с использованием прибора для электрофореза ЭФПА-30 (Львовприбор, Украина), мембран "Владипор МФА-МА" (Владимир), разделение проводили в веронал-мединаловом буфере рН 8,6 (мединал-10,3 г, веронал 1,84 г, азид натрия 0,001 г), при напряжении 150В и силе тока 8—10 мА, в течение 30 мин. В качестве контроля использовали стандартную сыворотку. Электрофореграммы окрашивали 5% раствором нигрозина водорастворимого ("Chemapol", Чехословакия) в 10% ТХУ, в течение 3 минут, затем отмывали в 1% растворе ТХУ. Отмытые электрофореграммы смачивали в растворе, полученным при смешивании равных объёмов 90% этанола и ЛУК, и высушивали в термостате при температуре 80С до достижения прозрачности плёнки. Электрофореграммы денситометрировали на приборе АФ-1 (Львовприбор, Украина).
П. 2. 4. Иммуноэлектрофорез по методу Grabar (Grabar/Williams, 1953)
Анализ проводили с использованием комплекса приборов для электрофореза ПЭФ-3 (г. Фрунзе), при силе тока 40 мА и напряжении 220В в течение 1,0—1,5 часа, на пластинах из 1% агарового геля ("Difco", США), в веронал-мединаловом буфере рН 8,6, состав которого приведён выше. В качестве контроля использовали стандартные антисыворотки к сывороточным белкам, а также антисыворотку полученную при иммунизации кроликов вы-сокоочищенным ЦП и спиртовой фракцией IV-1 (используемую при производстве ЦП) ("ИмБио" Н. Новгород). Пластины с агаром инкубировали 24-30 часов при комнатной температуре во влажных камерах, а затем иммунопре-ципитаты фотографировали в рассеянном свете.
П. 2. 5. Гель-проникающая хроматография низкого давления Гель-хроматографию осуществляли на колонке производства фирмы "Рпаггпасіа"(Швеция), 2,6x100 см, заполненной Ultrogel АсА34
("Pharmacia"), уравновешенной 0,1 М трис-буферным раствором, рН 8,0-8,2. Все эксперименты проводили с помощью системы для хроматографии низкого давления фирмы LKB (Швеция), состоящей из: насоса "Miniperpex", прототочного фотометра "Uvicord S", самописца "LKB 2210" и коллектора фракций "Helirac". Препарат наносили в объёме 0,5 мл на колонку. Проводили ретроградную элюцию со скоростью 30 мл/час. Запись вели в автоматическом режиме при длине волны 280 нм. Колонку калибровали смесью веществ с известной молекулярной массой: голубой декстран (2 000 000 Д), БСА (67 кД), овальбумин (45 000 Д), химотрипсиноген (25 000 Д), ДНФ-лейцин (297 Д).
Определение ферментативной активности осуществляли по методу Ravin (1956). В 2 пробирки вносили по 200 мкл исследуемого раствора ЦП, с концентрацией белка 100-500 мкг/мл, и по 4 мл 0,1 М натрий-ацетатного буферного раствора, рН 5,45, предварительно нагретого до температуры 37С. Затем в пробирки добавляли по 2 мл раствора п-фенилендиамин-гидрохлорида (3 мг/мл), отмечая время добавления с помощью секундомера. Пробы инкубировали при температуре 37С. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1,5 М раствора азида натрия, спустя 10 и 20 минут после начала инкубации, добавляя азид натрия вначале в первую, затем во вторую пробирку. В контрольную пробу вместо ЦП вносили 200 мкл буферного раствора. Измеряли оптическую плотность проб против контрольной при длине волны 530 нм на спектрофотометре СФ-26 («ЛОМО», г.Санкт-Петербург). Единица активности при этом определялась как количество ЦП, изменяющее оптическую плотность раствора на 0,001 в минуту.
Электрофорез в ПААГ проводили с использованием прибора для электрофореза ("Хийу-Калур", Эстония), и набора стандартных реактивов ("Reanal", Венгрия), в 7,5% геле, при силе тока 50мМ, в течение 2-3 часов в трис- глициновом буфере, рН 8,3 (0,6 г Трис, 2,88 г глицина на 1 литр воды), по методике, описанной Маурером (1971).
Пластины геля окрашивали раствором амидочёрного 1 ОБ в уксусной ки-слоте, отмывали от избытка красителя 0,1М раствором уксусной кислоты и высушивали между диализными мембранами.
Общеклинические показатели
Определение биохимических показателей крови проводили в соответствии с методиками, изложенными в «Справочнике по клиническим лабораторным методам исследования».
Животных (кроликов) иммунизировали 5-кратно с интервалом 7-10 дней: при первых четырех инъекциях антиген вводили внутрикожно, при пятой инъекции - внутривенно. Доза на одного животного составляла 1 мг белка на одну инъекцию. Антиген вводили в несколько точек предварительно смешанный с равным объемом адъюванта Фрейнда. При внутривенном введении - в ушную вену. Через 6-7 дней после окончания цикла иммунизации производили пробное взятие крови. После свертывания крови отделяли сыворотку и определяли в ней содержание специфических антител методом иммуноэлектрофореза.
Статистический анализ представленных в диссертационной работе результатов исследования проводили с помощью статистических методов, принятых в биологии и медицине (Лакин Г.Ф., 1990).
Полученный данные были обработаны с помощью программного продукта «Microsoft Excel» на IBM PC/AT. Вероятность различий показателей средних в группах определяли с использованием критерия Стьюдента (t). Различия считали достоверными при уровне значимости р 0,05. . Оптимизация технологии получения церулоплазмина
Большинство производителей для получения ЦП используют фракцию III, хотя выход фермента не превышает 5-8 доз с одного килограмма осадка (А.Г. Исрафилов, 1993). Для повышения выхода необходимо было наряду с этой фракцией расширить поиск других источников фермента, таких как фракции IY-1.
Поскольку ЦП относится к аг-глобулинам, на первом этапе работы необходимо было установить их содержание во фракциях при спиртовом фракционировании и определить оксидазную активность фракций. Анализу по этим показателям были подвергнуты плазма, фракция IY-1 и III. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Как свидетельствуют данные таблицы, по сравнению с плазмой наблюдалось небольшое увеличение аг-глобулинов во фракции III. Максимальное значение аг-глобулинов наблюдалось во фракции IY-1. По сравнению с плазмой оно было увеличено в 4,1 раза. Наличие в этих фракциях функционально активного ЦП оценивалось по удельной оксидазной активности осадков. Проведенные исследования позволили установить, что наибольшей оксидазной активностью обладала фракция IY-1 и была в 6,5 раза выше, чем фракция HI.
Таким образом, результаты проведённых исследований показали, что для выделения ЦП предпочтительнее использовать фракцию IY-1, содержащую максимальное количество фермента.
Существующая технология выделения ЦП из фракции III Кона предусматривала растворение фракции III в 0,05 М растворе хлористого натрия в соотношении 1:100, адсорбцию ЦП на ДЭАЭ-целлюлозе и удаление не связавшихся белков с ионообменника посредством промывки целлюлозы 0,08 М раствором хлористого натрия с последующей элюцией ЦП с сорбента 0,16 М раствором хлорида натрия. Для устранения липопротеидов в технологический процесс была включена стадия обработки элюата смесью хлороформ-этанол при конечной концентрации хлороформа в смеси 4 %, этанола 24 %. Недостатком указанной схемы являлись нестабильность ЦП в 0,05 М растворе хлористого натрия, низкая обменная ёмкость анионообменника, отсутствие дополнительных стадий вирусной инактивации и небольшой выход конечного продукта.
Используя принципы, заложенные в данной технологии, была разработана новая технологическая схема получения ЦП (рис.2).
Для стабилизации ЦП осадок IV-I на первой стадии суспендировали в 0,05 М ацетатном буфере с рН 5,6-5,7 и проводили прогрев суспензии при 60С. При этом большинство балластных белков денатурировалось, а термостабильный ЦП оставался в растворе. Как показали дальнейшие исследования прогрев фракции при 60С не влиял на ферментативную активность ЦП. Цветность препарата - один из важнейших показателей, отражающий связывание ионов меди с молекулой ЦП - не претерпевала изменений. Очищенный ЦП был устойчив к действию температуры. При пастеризации не изменялись физико-химические свойства препарата. После центрифугирования проводили сорбцию белков на анионообменнике. Увеличение адсорбции достигали при использовании в качестве анионообменника ДЭАЭ-сефадекса А-50, который обладал обменной ёмкостью в 5,9 раза выше, чем ДЭАЭ-целлюлоза. В дальнейшем, ЦП элюировали с анионообменника 0,4 М ацетатным буфером рН 5,6- 5,7. Дальнейшую очистку ЦП проводили, добавляя в элюат хлороформ до 2 %. Содержащиеся в элюате липопротеиды и другие белки удалялись с осадком. Очищенный ЦП концентрировали 30%-ным этанолом. Осадок растворяли до содержания белка 5,0-6,0 % и подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации. Препарат разливали в ампулы и лиофилизировали.
Антигипоксические свойства церулоплазмина
Известно, что одним из универсальных патологических процессов на уровне клетки при всех критических состояниях является гипоксическии синдром. В клинических условиях «чистая» гипоксия встречается редко, чаще всего она осложняет течение основного заболевания (В.В. Абрамченко, 2001). При нарушении энергетического гомеостаза клетки, как ключевого звена формирования гипоксического синдрома, необходимо введение средств нормализующих энергетический обмен. Такими препаратами являются антигипоксанты, способные предотвратить, уменьшить, или ликвидировать проявление гипоксии благодаря поддержанию энергетического обмена в режиме, достаточном для сохранения структуры и функциональной активности клетки хотя бы на уровне допустимого минимума (В.В. Абрамченко, 2001).
Поэтому мы изучили влияние различных форм ЦП при гипобарической гипоксии in vivo. Данная модель позволяет напрямую оценить антигипокси-ческое действие препарата и проанализировать вклад феррооксидазной активности ЦП в реализацию этого эффекта. С этой целью мы использовали две формы ЦП - с максимальной (189 ед/мг) и минимальной (91 ед/мг) ферментативной активностью. Образцы вводили по 50 мг белка внутрибрюшин-но за 20 минут до создания гипоксии, и в той же дозе внутримышечно и внутрибрюшиннно за сутки до эксперимента. В контрольной группе использовали стерильный физиологический раствор в соответствующих количествах при внутрибрюшинном введении.
Проведенные эксперименты показали, что использование ЦП позволило увеличить выживаемость животных при гипобарической гипоксии (табл. 6). При этом защитный эффект проявлялся при различных значениях от окси-дазной активности препарата, и был максимально выражен при введении препарата за сутки до эксперимента, независимо от способа введения. Так, время жизни (Тж) при введении ЦП за сутки увеличилось в 5,3 раза по срав 64
нению с контролем при внутримышечном введении, и в 5,0 раз - при внутрибрюшинном. Показатели устойчивости к гипоксии значительно улучшались при введении препарата за сутки до эксперимента: появились высокоустойчивые особи - 16 % при внутрибрюшинном и 25 % при внутримышечном введении; в то время как в контрольной и в опытных группах при введении ЦП за 20 минут до гипоксии, таких животных не наблюдалось.
Что касается формы препарата с высокой ферментативной активностью, некоторые показатели устойчивости к гипоксии (Тж, количество среднеус-тойчивых животных, ВПП) были достоверно выше, чем в контрольной группе, однако, значения Тж и ВПП были ниже, чем при использовании препарата с низкой ферментативной активностью.
Поскольку гипоксия сопровождалась проявлениями метаболического ацидоза, нами была проведена оценка влияния ЦП на показатели углеводного обмена в плазме крови животных (табл.7).
Достоверное снижение лактатацидоза и соотношения лактат/пируват в крови животных наблюдалось только при введении препарата за сутки до эксперимента. Аналогичная зависимость отмечалась при анализе состояния про- и антиоксидантної систем организма (табл.8). Основные показатели окислительной активности плазмы - I max, ДК, ТК - достоверно изменялись по сравнению с контролем при введении препарата за сутки до эксперимента: отмечалось достоверное увеличение активности СОД (основного медь-зависимого антиоксидантного фермента тканей) во всех опытных группах; однако, максимальные изменения наблюдались при введении препарата за сутки.
Таким образом, нами продемонстрировано антигипоксическое действие ЦП. Усиление эффекта препарата при введении за сутки свидетельствует о том, что эффект ЦП является не прямым, а опосредованым влиянием на другие защитные системы организма. Ш. 5. Влияние церулоплазмина на показатели эндогенной интоксикации у больных с острым деструктивным панктеатитом
Поскольку ЦП является белком острой фазы воспаления и стресса, повышение его концентрации характерно для любых заболеваний, сопровождающихся деструкцией тканей, развитием окислительного стресса и воспаления. В последние годы внимание исследователей было привлечено к специфической активности ЦП, т.е. отношению ферментативной активности к концентрации ЦП. Показано, что значение этого параметра изменяется при различных патологических состояниях, в частности, увеличивается при воспалительных заболеваниях (Louro О., et al., 2000). Специфическая активность ЦП отражает баланс окислительной/антиокислительной систем организма, поскольку имеются доказательства, что при некоторых условиях ЦП способен проявлять прооксидантные свойства.
Нами проведен анализ зависимости специфической активности ЦП от характера течения острого деструктивного панкреатита, который занимает 3 место среди острых заболеваний органов брюшной полости. Это заболевание «полиэтиологическое», но «монопатогенетическое». Взаимоотношение деструктивных и воспалительных изменений в поджелудочной железе отличается большим разнообразием и определенной стадийностью (фазностью) развития.
При лечении острого деструктивного панкреатита, не существует какого-либо эффективного, одного метода и лекарственного средства.
