Введение к работе
Актуальность исследования. Одна из наиболее актуальных в физико-химическом аспекте проблем биохимии алкоголизма – регуляция активности алкогольдегидрогеназы (АДГ). В ряде исследований (Островский Ю.М., Сатановская В.И., Садовник М.Н., 1969; White, A.M., 1998; Нужный В.П., 2002 и др.) установлено, что в качестве субстрата фермента наиболее часто используется этанол. Достаточно полно изучен физиологический аспект действия этанола на организм человека (Бурков Ю.В., Иванова Н.Н., 2008), а также исследован ферментативный механизм утилизации этанола в организме человека (Груздева К. Н., 2001 и др.) при участии фермента алкогольдегидрогеназы. Однако вопросы регуляции ферментативной активности алкогольдегидрогеназы изучены недостаточно.
Алкогольдегидрогеназа – фермент класса оксидоредуктаз (1.1.1.1), катализирующий процессы окисления никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) первичных алифатических спиртов в соответствующие альдегиды (Диксон М., Уэбб Э., 2005). Алкогольдегидрогеназы найдены в тканях животных (печени лошади) (Xie P., 2005), растениях (томатах и картофеле), грибах, дрожжах, бактериях (Авилова Т.В., 2001) и др. Наиболее изученными ферментами являются алкогольдегидрогеназы, выделенные из дрожжей, а также печени лошади (Сапожников Г.П., Лозитнова А.Б., 2004; Лапина Г.П., Золотарева Н.В., 2006 – 2008).
Алкогольдегидрогеназы являются недостаточно исследованными биокатализаторами c точки зрения использования различных фармпрепаратов, применяемых для лечения больных хроническим алкоголизмом (Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 2002). До настоящего времени актуальным является поиск специфических эффекторов фермента алкогольдегидрогеназы, окисляющих этанол, с целью регулирования концентрации этанола и ацетальдегида в организме, что важно в изучении молекулярных основ биохимии алкоголизма (Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 1984; Марри Р., Греннер Д., 1993; Goldberg L., Rudberg U., 2004).
Вопросы изучения и установления молекулярных механизмов такого рода эффекторов (активаторов или ингибиторов фермента) относятся к перспективным направлениям современной энзимологии и обсуждались на Symposium of A.I. Oparin: «Biochemistry of the twenty-first century: problems and frontiers», 1994; а также в работах (Бонитенко Е.Ю., 2003; Zidoni Е., Кrеter M., 2004 и др.). Поиск решения поставленной задачи и определяет актуальность данной работы.
В практической медицине довольно широко используются фармпрепараты Пирацетам и Зорекс (Wyllie M. G., Paciorec P. M., 2001; Waterfall J. F., 2003). Физиологические основы действия данных регуляторов известны: Пирацетам, являясь ноотропным фармпрепаратом, изменяет метаболические и биоэнергетические процессы в нервной клетке, улучшает функции головного мозга, усиливая кровоток (Руденко Г. М., 1996; Benzi G., Pastoris O., 1997); Унитиол, в свою очередь, в составе Зорекса способствует восстановлению обмена веществ в нервных клетках и выведению продуктов распада этанола из органов и тканей (Ostrovskaja R. U., Hoffmann W., Molodawkin G. M., 1993; Roglev M., 2001).
Эффективное использование этих фармпрепаратов базируется на информации о молекулярно-кинетическом характере их действия на фермент АДГ, который в полной мере не изучен.
Цель работы: исследование молекулярно-кинетического механизма действия фармакологических препаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола (составной части Зорекса) на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы в условиях in vitro.
Задачи исследования:
-
Выделить и очистить алкогольдегидрогеназу из пекарских дрожжей по методу Г.А. Кочетова. Определить субстратную специфичность фермента в группе этанол-бутанол-изопропанол и рассчитать его основные ферментативные параметры и выявить оптимальную концентрацию специфичного субстрата. Сравнить ферментативные показателей алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей и алкогольдегидрогеназы печени лошади.
-
Разработать многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в присутствии регуляторов и оптимизировать его:
- рассчитать значения важнейших ферментативных параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади для системы контроля;
- выявить влияние Пирацетама и никотинамидадениндинуклеотида на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы. Найти их оптимальные концентрации;
- определить действие Зорекса и Унитиола на активность биокатализатора.
-
Установить тип регулирования (активации или ингибирования) алкогольдегидрогеназы в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола.
-
Для изученных ферментативных систем построить геометрический «портрет» в трехмерной Kм' V' – системе координат и на этой основе рассчитать дополнительный ферментативный параметр (длину -, -, - векторов).
Научная новизна результатов исследования
Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению влияния фармакологических препаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол на каталитическую активность АДГ.
Впервые выявлены типы активации АДГ при действии на фермент фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола и установлена эффективность функционирования биокатализатора на основе векторных построений данных ферментативной кинетики в трехмерной Kм'V' – системе координат, позволивших впервые получить визуализацию хода ферментативного процесса с участием АДГ в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола и рассчитать новый ферментативный параметр – длину вектора, характеризующего интенсивность активации фермента и отражающего суммарную эффективность функционирования биокатализатора.
Теоретическая и практическая значимость работы. Работа носит фундаментальный характер и направлена на изучение молекулярно-кинетического поведения алкогольдегидрогеназы.
Полученные данные в рамках разработанного в данной работе многоэтапного научно-методического подхода расширяют и развивают теоретические представления об эффективности регулирования биокатализа в присутствии различных добавок.
Разработанная схема изучения типа регулирования (активации или ингибирования) АДГ для фармакологических препаратов (Пирацетам, Зорекс и Унитиол), направленная на поиск оптимальных условий течения ферментативной реакции, может служить моделью для изучения других фармпрепаратов, действующих на фермент утилизации этанола – алкогольдегидрогеназу – с целью устранения последствий интоксикации организма.
Часть полученных данных и сделанные выводы использованы при выполнении проекта № 2.1.1/1897 «Исследование взаимосвязи структурно-динамических свойств ферментов с их функциональной активностью и разработка новых биокатализаторов на основе иммобилизованных окислительно-восстановительных ферментов для биомедицинской и пищевой промышленности», выполняемого по аналитической ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)». (Заказчик проекта – Министерство образования и науки Российской федерации, Федеральное агентство по образованию).
Научные результаты, выносимые на защиту:
1. Максимальная субстратная специфичность выделенной и очищенной из пекарских дрожжей алкогольдегидрогеназы среди спиртов различного строения наблюдается к этиловому спирту. Рассчитаны значения важнейших ферментативных параметров биокатализатора (Кm, Vmax и Kкат). Выявлена оптимальная концентрация специфичного субстрата – этанола, равная 1,510-2М.
2. Разработанный многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы позволил установить, что фармпрепарат Пирацетам как активатор алкогольдегидрогеназы обладает большей эффективностью в сравнении с Зорексом и Унитиолом.
3. Пирацетам, Зорекс и Унитиол по-разному активируют алкогольдегидрогеназу, а именно в случае Пирацетама – двухпараметрически рассогласованный тип активации (IIa-тип, Крупянко В.И., 1994), для Зорекса и Унитиола – двухпараметрически согласованный тип активации (Ia-тип, Крупянко В.И., 1994) фермента.
4. Расчет дополнительного ферментативного параметра – значения длины вектора – на основе векторного построения геометрического «портрета» алкогольдегидрогеназной реакции подтвердил наибольшую эффективность фармпрепарата Пирацетама в сравнении с Зорексом и Унитиолом.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Полученные результаты соответствуют пункту 4 паспорта специальности 03.01.04 «Биохимия (биологические науки)».
Апробация и реализация результатов диссертации
Основные положения и выводы диссертации апробированы в выступлениях на научных конференциях. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на V и VII научных конференциях аспирантов и студентов химического факультета (Тверской государственный университет, Тверь, 2006 и 2008); на XVI и XVII Региональных Каргинских чтениях «Физика, химия и новые технологии» (Тверской государственный университет, Тверь, 2009 и 2010); на Международной конференции «Состояние воды в биологических и модельных системах» (Тверская государственная медицинская академия, Тверь, 2007); Всероссийской научной школе для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных органических соединений» (Тверская государственная сельскохозяйственная академия, Тверь, 2010), а также на научных семинарах кафедры физико-химической экспертизы биоорганических соединений ТвГУ и при выполнении дипломных работ, в которых соискатель был научным руководителем дипломников.
Полученные результаты по выявлению особенностей ферментативного поведения алкогольдегидрогеназы печени лошади и оптимизации метода выделения фермента из пекарских дрожжей используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре физико-химической экспертизы биоорганической экспертизы ТвГУ: в курсе лекций, при подготовке курсовых и дипломных работ студентов.
Публикации. Результаты исследования отражены в 9 публикациях, 3 из которых в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 182 источника, из которых 70 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 68 рисунками.
