Введение к работе
Актуальность работы. Известно, что большинство патологических процессов протекает на фоне образования активных форм кислорода (АФК) и усиления свободнорадикального окисления (СРО) биосубстратов. В ответ на это происходит активизация антиоксидантной системы (АОС) клетки. АОС представлена низкомолекулярными соединениями, к которым относят витамины А, С, Е и К, биофлавоноиды, низкомолекулярные тиолы, а также антиоксидантными ферментами (супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГП), глутатионредуктаза (ГР), каталаза и т.д.). Учитывая то, что большинство патологических состояний сопровождается усилением СРО, повреждающим белковые структуры, молекулы ДНК и липидов [Ланкин В.З., 2001; Bakker S.J., 2000; Kowaltowski A.J., 1999] и ослаблением активности АОС, весьма актуальной представляется оценка состояния этих систем с целью ранней диагностики и обоснованного лечения заболеваний.
Действие многочисленных химических веществ на организм человека сложно и многообразно. К числу ксенобиотиков с наиболее высокой степенью избирательной гепатотоксичности относятся хлорированные углеводороды, типичным представителем которых является тетрахлорметан (СС14). Имеющиеся данные свидетельствуют, что развитие ССІд-гепатита сопряжено с интенсификацией СРО [Андреещева Е.М., 2003; Левенкова М.В., 2006]. Организм человека и животных располагает рядом биохимических систем, во многом определяющих чувствительность к действию токсинов. К их числу относится и глутатионовая система, принимающая участие в реализации важнейших физиологических процессов. Так, глутатион, являющийся компонентом данной системы, выступает в качестве резерва цистеина в клетке и воздействует на лимфоциты, обеспечивая иммунный ответ организма, а также оказывает влияние на биохимические превращения витаминов С, Е, липоевой кислоты. Глутатионовая система может принимать участие и в антиоксидантной защите (АОЗ) организма [Кулинский В.И., 1990], являясь важным ее компонентом, поддерживающим на стационарном уровне интенсивность протекания свободнорадикального окисления (СРО) [Владимиров Ю.А., 1972; Кузьменко А.И., 1997; Шишкина Л.Н., 2000]. Благодаря функционированию ГР/ГП системы в клетках млекопитающих обеспечивается детоксикация гидроперекисей и перекисей, являющихся основным источником ОН'-радикала [Осипов А.Н., 1990; Skulachev V.P., 1997].
ГР (КФ 1.6.4.2) - распространенный фермент, катализирущий обратимое НАДФН-зависимое восстановление окисленного глутатиона (GSSG) [Карпищенко А.С, 1999]. Биологическая роль ГР - поддержание высокой внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона (GSH) без увеличения его синтеза. В последнее время значительное внимание уделяется созданию специфических ферментных биотест-систем с использованием ГР для оценки целевой биологической активности антиоксидантной направленности в фармакологически активных веществах [Бродов М.С., 2004].
В настоящее время в литературе имеются данные относительно некоторых каталитических свойств фермента из тканей животных [Gutterer J.M., 1999, Boggaram V., 1979] и человека [Untucht-Grau R., 1981; Krauth-Siegel R.L., 1982] в условиях нормы. Однако особенности функционирования данного фермента при патологии печени остаются не исследованными.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование каталитических свойств и регуляции активности ГР из печени крыс в норме, при экспериментальном токсическом гепатите (ЭТГ) и введении веществ -протекторов: тиоктовой кислоты (ТК) и GSH, при патологии. В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Определение активности и субклеточной локализации ГР из печени крыс в
норме, при развитии токсического гепатита и действии ТК и GSH;
2. Получение гомогенных ферментных препаратов ГР из печени
контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту животных, а также крыс,
которым при патологии вводили вещества-протекторы;
Сравнительная характеристика кинетических параметров каталитического действия ГР из печени крыс в норме, в условиях развития патологического процесса, вызванного введением ССІ4, и действия веществ, обладающих протекторными свойствами при патологии;
Исследование регуляции активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении веществ - протекторов под действием метаболитов цикла Кребса;
Изучение участия интермедиатов пентозофосфатного пути (ПФП) в регуляции активности ГР из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении ТК и GSH при патологии;
Изучение участия ионов металлов и нуклеотидфосфатов в регуляции активности фермента из печени крыс в норме, при развитии токсического гепатита и введении ТК и GSH;
7. Изучение количественной экспрессии гена ГР в печени крыс в норме, при
токсическом гепатите и действии гепатопротекторов при патологии.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование особенностей регуляции активности ГР в условиях развития оксидативного стресса при ЭТГ у крыс. Разработаны способы очистки и получены гомогенные препараты ГР из печени контрольных и подвергнутых токсическому гепатиту крыс, а также животных, которым при развитии патологии вводили вещества-протекторы. Выявлены особенности экспрессии фермента и дана сравнительная характеристика его каталитических и регуляторных свойств в норме, патологическом состоянии и при введении тиоктовой кислоты и восстановленного глутатиона при токсическом поражении печени. Впервые установлено, что введение протекторов сопровождается изменением активности и уровня экспрессии фермента, возрастающих при токсическом гепатите, в сторону значений в норме. Полученные данные представляют собой интерес с точки зрения регуляции образования АФК за счет изменений активности ГР, взаимосвязанных с модификацией экспрессии, а также кинетических и регуляторных свойств фермента под действием ионов металлов, интермедиатов цикла Кребса, пентозофосфатного пути, нуклеотидфосфатов. Проведенные исследования способствуют расширению и углублению фундаментальных представлений о механизмах регуляции образования АФК с помощью одного из ключевых ферментов антиоксидантной системы в условиях развития токсического гепатита и действия протекторов.
Практическая значимость.
Разработанные способы очистки ГР могут применяться для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Специфические ферментные биотест-системы in vitro, основанные на
использовании ГР, могут применяться как в медицине, так и в фармации [Бродов М.С., 2004]. Результаты исследования регуляции активности глутатионзависимых ферментов, к числу которых относится ГР, могут использоваться для контроля за состоянием антирадикальной защиты, дифференциальной диагностики, объективизации контроля эффективности терапии, прогнозирования течения некоторых заболеваний.
Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Свободнорадикальные процессы», «Медицинская биохимия», а также спецкурсов по аналитической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами Воронежского госуниверситета.
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены в межрегиональном сборнике научных работ «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2006), на научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» Ростов-на-Дону, 2006), на 20-м съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова при РАН (Москва, 2007), на 3-ей Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2007), на международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е.В. Сапожниковой (Саранск, 2008), в материалах Всероссийской научной конференции «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболевай человека» Российской академии естествознания (Москва, 2008), на Международной студенческой биологической конференции, посвященной 90-летию Ереванского государственного университета и 75-летию факультета биологии (Ереван, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных «Актуальные вопросы медицинской науки», (Ярославль, 2009), на Всероссийской научной конференции учащихся, студентов и молодых ученых "Научное творчество XXI века", (Красно ноярск, 2009), на Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик», (Курск, 2009), на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз, Россия - 2009", (Пермь, 2009), на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009), на Международной научно-практической конференции «Современные проблемы гуманитарных и естественных наук» (Москва, 2009), на Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009), а также на ежегодной научной отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2009).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 18 публикациях - в 5 статьях и 13 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения:
1. В условиях интенсификации СРО при ЭТГ происходит увеличение активности и уровня экспрессии ГР в печени крыс, которые снижаются при введении животным ТК и GSH при патологии. При этом субклеточная
локализация, молекулярная масса, рН-оптимум и электрофоретическая подвижность фермента не изменяются.
2. С использованием гомогенных ферментных препаратов выявлена
модификация некоторых кинетических и физико-химических параметров
каталитического действия ГР: Км, Еакт, температурного оптимума,
термостабильности. Введение гепатопротекторов приводит к изменению значений
исследованных параметров в сторону нормальных величин.
3. При ЭТГ происходят изменения регуляции активности ГР
интермедиатами пентозофосфатного пути и цикла Кребса, нуклеотидфосфатами,
ионами некоторых металлов. Ряд модификаций регуляторных свойств ГР,
характерных для фермента из пораженной гепатотоксином печени, такие как
9-І-
уменьшение чувствительности к ингибирующему действию изоцитрата, ионов Fe
Q_i_
и Fe , усиление активирующих эффектов цитрата и АМФ, очевидно, могут способствовать увеличению активности фермента при патологии.
4. С учётом полученных данных по исследованию функционирования ГР в
печени крысы при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов
предложена гипотетическая схема, отражающая регуляцию активности
исследуемого фермента, принимающего участие в контроле интенсивности СРО в
патологическом состоянии.
Структура и объем работы. Диссертация представлена на 222 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (6 глав), заключения, выводов, списка литературы (343 источника) и приложения. Иллюстративный материал включает 59 рисунков и 9 таблиц. В приложении содержится 26 рисунков.
