Введение к работе
Актуальность проблемы.
Изучение механизмов адаптивных процессов на различных уровнях организации биосистем остается одной из центральных проблем современной биологии и медицины. В настоящее время сформулированы представления о роли стресс-синдрома и закономерностях формирования ответных реакций организма в процессе его фенотипической адаптации [Панин Л.Е., 1978, 1983; Панин Л.Е., Соколов В.П., 1981; Панин Л.Е., Кузьменко Д.И., 1982; Панин Л.Е. и др., 1982, 1983; Меерсон Ф.З., 1981; Казначеев В.П., Казначеев С.В., 1986; Айрапетянц М.Г., Гуляева Н.В., 1988; Кулинский В.И., Ольховский И.А., 1992; Коренева Е.А., 1996; Судаков К.В., 1996; Волчегорский И.А., 1997, 1998; Яковлев Г.М., и др., 1990; Kvetnansky R., 1995; Stratakis C.A., Chrousos G.P., 1995]. Вместе с тем, очевидно, что эти достижения не исчерпывают всей сложности вопроса. В своей начальной стадии находится решение комплексной проблемы изучения вклада различных внутриклеточных сигнальных систем в реализацию компенсаторно-адаптивных реакций. Безусловный интерес представляет изучение роли сфингомиелинового цикла (СМ цикла), как сигнального пути, активно участвующего в регулировании основополагающих процессов жизнедеятельности клетки, включая баланс между пролиферацией и апоптозом. [Hannun Y.A,. Luberto Ch., 2000; Futerman A.H., Hannun Y.A. 2004; Ruvolo P.P., 2001, 2003; Hannun Y.A., Obeid L.M., 2002].
Ключевым эвеном реализации долговременной фенотипической адаптации организма является формирование на определенной стадии стресс-реакции системного структурного следа, позволяющего достигнуть предельного уровня работоспособности функциональных систем, доминирующих в приспособлении организма к изменившимся условиям существования [Меерсон Ф.З., 1981; Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988; Судаков К.В., 1996]. Пластическое обеспечение функций и формирование системного структурного следа адаптации неразрывно связано не только с адаптивной гиперплазией клеточных ультраструктур, но и с процессом регулируемой оптимизации состава клеточной популяции – апоптозом, в ходе которого осуществляется избирательная элиминация нежизнеспособных клеток [Лушников У.Ф., Абросимов А.Ю., 2001; Швембергер И.Н., Гинкул Л.Б., 2002; Москалева Е.Ю., Северин С.Е., 2002; Kiechle F.L., Zhang X., 2002]. Одними из регуляторов апоптоза являются компоненты СМ цикла, обладающие свойствами вторичных посредников. Это, прежде всего, проапоптотик церамид и сфингозин-1-фосфат – активатор пролиферативных процессов [Hannun Y. A., 1994; Alessenko, A.V., 2000; Huwiler A., 2000; Andrieu-Abadie N. et al., 2001; Pettus B.J., 2002; Ruvolo P.P., 2003].
В настоящее время интерес к углубленному исследованию биохимии голодания во всем мире обусловлен перспективой создания научно обоснованных технологий лечебного голодания, основанных на новых принципах и свободных от эмпирических подходов, которые станут не только более эффективными средствами профилактики и борьбы с избыточной массой тела, но также займут достойное место среди дополнительных методов коррекции состоянии организма при социально значимых заболеваний, таких как сердечно-сосудистая патология, сахарный диабет и злокачественные новообразования [Kerndt P.R.,et al., 1982; Vina J., et al., 2005; Gerstenblith G., 2006; Varady K.A., Hellerstein M.K., 2007; Fontana L., Klein S, 2007; Hulbert A.J. et al., 2007].
Печень – жизненно важный орган, одна из ключевых функций которого при голодании состоит в поддержании энергетического гомеостаза на уровне целостного организма, что обеспечивается адаптивным переключением метаболизма с «углеводного» типа на «жировой» [Панин Л.Е., 1978, 1983; Панин Л.Е., Соколов В.П., 1981] и синтезом кетоновых тел. Известно, что активность внутриклеточных сигнальных путей находится в тесной зависимости от окислительно-восстановительного статуса клетки, в изменение которого существенный вклад способно вносить нарушение нормального протекания процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Турпаев К.Т., 2002; Меньшикова Е.Б. и др., 2006; Won Je-S., Singh I., 2006; Janssen-Heininger Y.M.W. et al., 2008]. Феномен активации процессов ПОЛ в печени при голодании известен [Панин Л.Е., 1978, 1983; Панин Л.Е., Соколов В.П., 1981; Marczuk-Krynicka D. et al., 2003], однако он недостаточно изучен в динамике. Этот аспект важен ещё и потому, что активность ключевого фермента СМ-цикла - нейтральной сфингомиелиназы (нСМазы), также зависит от окислительно-восстановительного состояния цитоплазмы клетки [Won Je-S., Singh I., 2006]. В связи с этим, существенный интерес представляет оценка активности процессов ПОЛ на I и II фазах голодания, [Li Rong-Ying et al., 2006], то есть на тех сроках, когда происходят, соответственно, мобилизация и реализация адаптивных механизмов в печени.
Цель: Изучить состояние сфингомиелинового цикла и процессов свободнорадикального окисления липидов в печени крыс при голодании различной продолжительности.
Задачи исследования:
-
Охарактеризовать эндокринно-метаболический статус организма крыс (масса тела, концентрация в крови кортикостерона, глюкозы, неэтерифицированных жирных кислот и фактора некроза опухоли-альфа) при голодании продолжительностью 1, 2, 3 и 6 суток.
-
Определить содержание компонентов сфингомиелинового цикла (сфингомиелина, церамида и сфингозина), активность нейтральной сфингомиелиназы, а также каспазы-3 в печени крыс при голодании продолжительностью 1, 2, 3 и 6 суток.
3. Оценить содержание продуктов реакций свободнорадикального окисления липидов, образующихся на начальных (диеновые конъюгаты и кетодиены) и конечных (ТБК-активные продукты) его этапах, а также активность каталазы и содержание восстановленного глутатиона в печени крыс при голодании продолжительностью 1, 2, 3 и 6 суток.
-
Выявить характер взаимоотношений между функциональным состоянием сфингомиелинового цикла и активностью процессов свободнорадикального окисления липидов в печени крыс на I фазе (1, 2 и 3 сутки) и II фазе (6 сутки) голодания.
Научная новизна работы
В работе впервые исследовано участие сфингомиелинового цикла в динамике ответной реакции печени крыс на голодание: рассмотрены фазы голодания, наиболее важные с точки зрения адаптивного ответа органа. I фаза, в течение которой происходит мобилизация генетически детерминированных механизмов адаптации, включая формирование системного структурного следа адаптации печени, и II фаза, на протяжении которой реализуется потенциал адаптивного процесса, который позволяет животному поддерживать достаточную физическую активность и адекватные поведенческие реакции, необходимые для выживания.
Впервые показано, что в зависимости от сроков голодания крыс, в печени происходят закономерные изменения баланса между метаболитами СМ цикла (церамида и сфингомиелина), которые обусловлены фазным изменением активности его ключевого фермента – нСМазы. Установлено, что изменения активности нСМазы сопряжены с синхронным увеличением концентрации в крови голодавших животных активаторов фермента: прежде всего, поливалентного цитокина ФНО-a, а также НЭЖК.
Впервые установлено, что в печени экспериментальных животных на фоне повышения активности нСМазы и увеличения соотношения между содержанием церамида и сфингомиелина, происходит транзиторная активация каспазы-3. Эти факты свидетельствовуют о том, что в течении I фазы голодания в печени формируются условия для проявления церамид-опосредованной проапоптотической сигнализации.
Нами обнаружено, что переход I фазы голодания во II, сопряжен с закономерным изменением соотношения между функциональным состоянием СМ цикла и интенсивностью процессов ПОЛ в печени. На протяжении I фазы голодания система АО защиты печени сохраняет высокую активность, что, способствует проявлению церамид-опосредованной проапоптотической сигнализации. Во II фазу голодания, вследствие исчерпания функциональных резервов АО системы, в печени развивается окислительный стресс.
Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа вносит вклад в развитие фундаментальных знаний об участии внутриклеточных мессенджеров, продуцируемых сфингомиелиновым циклом, в механизме формирования системного структурного следа адаптации печени, что важно для сохранения жизнеспособности организма в течении начальных фаз голодания. Полученные в ходе исследований данные выявили участие церамид-опосредованной проапоптотической сигнализации, которая является одним из элементов управления адаптивным ответом печени на голодание.
Данные о существенном истощении функциональных резервов АО системы печени после перехода голодания из I во II его фазу необходимо учитывать при разработке новых технологий лечебного голодания: включать в медикаментозную поддержку организма препараты – антиоксиданты.
Положения, выносимые на защиту
1. К завершению I фазы голодания (3 сутки эксперимента) в печени крыс происходит активация сфингомиелинового цикла, выражающаяся в стимуляции активности его ключевого фермента – нейтральной сфингомиелиназы и в изменении баланса между церамидом и сфингомиелином (увеличение отношения содержания церамида к сфингомиелину).
2. К завершению I фазы голодания (3 сутки эксперимента) в печени животных формируются условия для проявления церамид-опосредованной проапоптотической сигнализации. Свидетельством этого явилось повышение в печени крыс активности каспазы-3, максимум которой пришелся на 3 сутки голодания.
3. В начале I фазы голодания крыс (1 и 2 сутки) в печени сохраняется высокая функциональная активность антиоксидантной системы. К завершению I фазы (3 сутки голодания крыс) в печени наблюдали признаки активации процессов перекисного окисления липидов. На 6 сутки эксперимента, что соответствовало II фазе голодания, в печени животных формируется окислительный стресс.
4. На протяжении I и II фаз голодания в печени крыс закономерно изменяется соотношение между функциональным состоянием сфингомиелинового цикла и активностью процессов перекисного окисления липидов. Если к завершению I фазы голодания в печени животных формировались условия для проявления церамид-опосредованной проапоптотической сигнализации, то переход от I фазы голодания ко II фазе сопряжен с преобладанием процессов свободнорадикального окисления липидов. Нарастающий окислительный стресс вызывает необратимые повреждения клеток и биомолекул и таким образом участвует в формировании несовместимых с жизнью сдвигов метаболизма на III фазе голодания.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской 66-й итоговой студенческой научной конференции им. Н.И.Пирогова (Томск, Россия, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008); научно-практическом симпозиуме с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, Россия, 2008); Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица, приуроченной к 65-летию Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, Россия, 2009); 11th International Conference “Bioactive Lipids In Cancer, Inflammation And Relted Diseases”. (Cancun, Mexico, 2009); IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, Россия, 2010).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав: «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение результатов», заключения и выводов. Работа изложена на 151 странице машинописного текста, включая 18 таблиц и 2 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 310 источников.
