Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Обзор литературы CLASS 13
1.1. Процессы пероксидного окисления липидов и система антиоксидантнои защиты в норме и при патологии 13
1.2. Роль перекисного окисления липидов и системы антиоксидантнои защиты в патогенезе токсического повреждения печени 25
1.3. Оксид азота и его роль при токсическом повреждении печени 35
2. Объекты и методы исследования 52
2.1. Объекты исследования 52
2.2. Методы исследования 52
2.2.1. Экспериментальное ССЦ-индуцированное токсическое повреждение печени 52
2.2.2. Методы биохимических исследований 53
2.2.2.1. Определение активностей индикаторных ферментов печени и некоторых других биохимических показателей 53
2.2.2.2. Определение продуктов пероксидного окисления липидов 53
2.2.2.3. Определение НАДФН-зависимого и аскорбатзависимого ПОЛ в печени 54
2.2.2.4. Определение степени окислительной модификации белков
плазмы крови 54
2.2.2.5. Определение активности супероксиддисмутазы в крови 56
2.2.2.6. Определение активности каталазы в крови 57
2.2.2.7. Определение активности глутатионпероксидазы в крови 58
2.2.2.8. Определение активности глутатионредуктазы в крови 59
2.2.2.9. Определение содержания в крови небелковых SH-групп 60
2.2.2.10. Определение субклеточной локализации генерации супероксиданиона в печени 61
2.2.2.11. Определение стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови 62
2.2.2.12. Определение S-нитрозотиолов в плазме крови 62
2.2.2.13. Выделение субклеточных фракций из гомогената печени крыс 63
2.2.2.14. Определение активности индикаторных ферментов субклеточных фракций 63
2.2.2.15. Статистическая обработка данных 64
3. Результаты собственных исследований 65
3.1. Пероксидная модификация липидов, белков и состояние антиоксидантной системы при токсическом повреждении печени 65
3.1.1. Влияние CCU-интоксикации на функциональное состояние печени и общее состояние животных 65
3.1.2. Субклеточная генерация супероксиданиона при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном 68
3.1.3. Пероксидное окисление липидов и белков, состояние антиоксидантной системы у животных при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном 75
3.1.3.1. Пероксидное окисление липидов при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном 75
3.1.3.2. Окислительная модификация белков плазмы крови крыс при токсическом повреждении печени 79*
3.1.3.3. Влияние токсического повреждения печени на некоторые показатели системы антиоксидантной защиты организма 82
3.1.3.4. Пероксидное окисления липидов, состояние антиоксидантной системы печени при её токсическом повреждении тетрахлорметаном 86
3.2. Влияние токсического повреждения печени на систему NO*- L-аргинин 92
3.2.1. Разработка спектрофотометрического метода определения 93
стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови 93
3.2.2. Продукция NO* при токсическом повреждении печени 104
3.2.3. Влияние токсического повреждения печени на уровень S-нитрозо-тиолов в плазме крови 106
3.3. Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность перокси-дации липидов и белков, состояние АОС, образование NO* и S-нитрозотиолов 108
3.3.1. Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС, образование N0" и S-нитрозотиолов у здоровых животных 109
3.3.2. Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидного окисления липидов и белков, состояние АОС и образование NO* и S-нитрозотиолов при токсическом повреждении печени 114
3.4. Изучение гепатопротекторных свойств амарантового масла и его влияния на интенсивность процессов пероксидации липидов и белков, состояние АОС, образование оксида азота и S-нитрозотиолов 123
4. Обсуждение полученных результатов 131
Выводы 152
Практические предложения 155
Список использованной литературы 156
- Роль перекисного окисления липидов и системы антиоксидантнои защиты в патогенезе токсического повреждения печени
- Определение субклеточной локализации генерации супероксиданиона в печени
- Пероксидное окисление липидов при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном
- Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС, образование N0" и S-нитрозотиолов у здоровых животных
Введение к работе
Актуальность проблемы. Процессы свободнорадикального окисления (СРО), лежащие в основе метаболизма всех клеток и определяющие адаптивную состоятельность организма к действию повреждающих факторов, являются не только необходимым звеном жизнедеятельности клетки, но и выступают как универсальное неспецифическое звено механизмов развития многих патологических состояний (Зенков Н.К. с соавт., 2001). Одним из вариантов, СРО является перекисное окисление липидов (ПОЛ). Перекисное окисление идет со значительной скоростью, но стационарная концентрация перекисей довольно мала вследствие наличия мощной многокомпонентной антиоксидантной системы. Срыв физиологической антиоксидантной защиты (АОЗ) организма ведет" к чрезмерному увеличению продукции активных форм кислорода (АФК), инициирующих лавинообразное разветвление процессов СРО в тканях. Образование свободных радикалов и реактивных метаболитов является одним из основных механизмом, ведущих к гибели гепато-цитов при токсическом повреждении.печени. В.развитии некротического повреждения гепатоцитов при окислительном стрессе, принимают участие такие высокоактивные молекулы, как супероксидный радикал, перекись водорода, гидроксильный радикал, ионы гипохлорита, синглетный кислород, пероксиради-калы. Образование активных форм кислорода наблюдается при стимуляции клеток Купфера и секвестрации полиморфноядерных нейтрофилов (Laskin J.D. etal.,2001).
Нарушение нормального течения окислительных процессов в результате несоответствия прооксидантных и антиоксидантных ресурсов клетки, приводит к формированию оксидативного стресса (Осипов А.Н. с соавт., 1990;; Naziroglu М. et al., 2000; Rhoden Е. L. et al., 2000). Это является основным метаболическим синдромом, который способствует развитию многочисленных морфофункциональных нарушений в организме (Меньшикова Е.Б. с соавт., 1994; De Quiroga G.B., 1992; Bertin-Maghit М. et al., 2000). Исследование состояния и возможных механизмов нарушения регуляции кислородзависимых
7 процессов предоставляет возможность выяснения общих закономерностей и уточнения патогенеза токсического повреждения печени. Решение этих вопросов тесно связано с фундаментальными общебиологическими проблемами, такими как образование свободнорадикальных форм кислорода и азота, пероксидной модификацией липидов и белков, функционированием биомембран, компартментализацией биохимических реакций и может быть весьма полезным для выяснения сложных многоуровневых взаимоотношений различных метаболических звеньев при токсическом повреждении печени.
Начало 90-х годов ознаменовано пристальным вниманием к проблеме биологической роли оксида азота (N0*) и становлением новой области биологии - биологии NO*. Эти исследования способствуют как решению многих фундаментальных проблем биологии, так и могут иметь в дальнейшем большое практическое значение для медицины, в частности для гепатологии.
Имеющиеся к настоящему времени данные позволяют считать, что, как в реакциях окислительного стресса, так и в механизмах антиоксидантной защиты принимает участие оксид азота, образование которого доказано для ге-патоцитов, клеток Купфера и эндотелиальных клеток печени.
Физиологический эффект взаимодействия АФК и NO" остается предметом активных дебатов. В ряде работ in vitro было продемонстрировано, что NO* может фактически замедлять пероксидное окисление липидов, действуя как скавенджер кислородных радикалов. Этот своеобразный "антиоксидант-ный" эффект N0* позволил некоторым исследователям предположить, что взаимодействие между супероксиданионом и NO* может быть биологически важным путем детоксикации потенциально опасных активных форм кислорода (Laskin J.D. et al., 2001; Серая И.П., Нарциссов Я.Р., 2002). В тоже время, есть и противоположные данные, свидетельствующие о том, что оксид азота способен усиливать эффекты супероксидного радикала и других активных форм кислорода (Huie R.E., Padmaja S., 1993; Penghai Wang P., Zweier J.L., 1996; Groves J.T., 1999), роль которых в патогенезе токсического повреждения печени и развитии эндотоксемии может считаться доказанной.
8 Несмотря на достигнутые успехи в изучении патогенетических механизмов токсического повреждения печени (Блюгер А.Ф., Майоре А.Я., 1978; Ambrosio G. et al., 1987; Vengerovskii АЛ. et al., 1996; Kim K.Y. et al., 2000), остается актуальным проведение дальнейших исследований, для более точного и полного представления роли процессов пероксидного окисления, антиоксидантного статуса организма, функционирования системы L-аргинин-NO" и их взаимосвязи при токсическом повреждении печени.
В последнее время появился ряд работ (Ohta Y. et al., 1997; Cabre M. et al., 2000; Gonzalez-Reimers E. et al., 2003; Lee K.J. et al., 2004), в которых приводятся отдельные результаты изучения состояния процессов пероксидного окисления липидов, антиоксидантнои системы и интенсивности образования в организме оксида азота при токсическом повреждении печени. Однако полученные данные носят зачастую противоречивый характер, и у авторов нет единого мнения о роли и взаимосвязи антиоксидантного статуса как совокупности про- и антиоксидантных процессов и системы оксида азота в патогенезе токсического поражения печени. Механизмы и эффекты взаимодействия систем антиоксидантнои защиты и продукции оксида азота, имеющие важное значение для понимания роли этих систем в патогенезе токсического повреждения печени остаются практически неизученными. Решение этого вопроса может стать основой для разработки и использования методов, направленных на регуляцию этих взаимодействий в организме, что может оказаться весьма эффективным способом предупреждения и лечения многих заболеваний, связанных с изменением продукции NO* и нарушением антиоксидантного статуса организма.
Все вышеизложенное и определило общую направленность работы, выбор методических подходов и экспериментальных моделей.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей явилось изучение процессов свободнорадикального окисления липидов и белков, состояния системы антиоксидантнои защиты в условиях модуляции продукции оксида
9 азота при токсическом повреждении печени и роли этих процессов в гепато-протекторном действии амарантового масла.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
изучить интенсивность процессов пероксидного окисления липидов и состояние антиоксидантнои системы при токсическом повреждении печени;
разработать метод определения преимущественной субклеточной генерации супероксиданионрадикала в печени с использованием НСТ и оценить степень его специфичности;
определить преимущественную субклеточную локализацию продукции супероксиданионрадикала в печени у интактных животных и крыс с экспериментальным ССЦ-индуцированным повреждением печени;
оценить степень окислительной модификации белков плазмы крови при токсическом повреждении печени;
разработать модификацию спектрофотометрического метода определения стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови и оценить степень его специфичности;
изучить интенсивность образования оксида азота у интактных животных и крыс с экспериментальным ССЦ-индуцированным повреждением печени;
провести изучение влияния модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидного окисления липидов, состояние антиоксидантнои системы, образование оксида азота у интактных животных и у животных при токсическом повреждении печени;
определить влияние амарантового масла на процессы пероксидного окисления липидов и белков, состояние антиоксидантнои системы, продукцию оксида азота при токсическом повреждении печени.
Научная новизна. Впервые комплексно изучены интенсивность процессов пероксидного окисления липидов и белков, состояние ферментативного звена антиоксидантнои системы и образование оксида азота при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном. Оценено влияние индукции синтеза оксида азота L-аргинином и ингибирования образования NO* амино-
10 гуанндином и метиловым эфиром нитро-Ь-аргинина на динамику образования супероксиданиона в митохондриальной и микросомальной ЭТЦ клеток печени, интенсивность пероксидного окисления липидов в крови и окислительной модификации плазменных белков, а также характер реакции антиоксидантной системы при токсическом повреждение печени ССЦ. Впервые установлено наличие гепатопротекторной активности у жирного масла из семян амаранта, полученного по оригинальной технологии и изучено его влияние на интенсивность генерации супероксиданиона, пероксидного окисления липидов-и белков, состояние антиоксидантной* системы, систему L-аргинин - NO* как в норме; так и при токсическом гепатите, вызванном введение тетрахлорметана.
Разработан и оценена специфичность спектрофотометрического метода определения интенсивности образования супероксиданиона в различных субклеточных фракциях с использованием нитросинего тетразолия (НСТ), позволяющий оценить преимущественный вклад определенных клеточных органелл в генерацию Ог*" в клетках печени.
Разработана модификация спектрофотометрического метода определения стабильных метаболитов оксида азота, сочетающая восстановление нитрата хлоридом> ванадия (III) и последующее определение* образовавшегося нитрита с помощью реактива Грисса.
Практическая' значимость. Изучение характера течения процессов свободнорадикального окисления липидов и белков, функционирования антиоксидантной системы позволяют углубить и систематизировать современные представления о значении оксидативного стресса и оксида азота в токсическом повреждении организма. Результаты исследования особенностей этих процессов в условиях модуляции образования оксида азота в организме, как в норме, так и патологии следует учитывать при разработке способов и методов прогнозирования исхода, лечения и реабилитации больных с токсическим поражением печени.
Результаты экспериментального исследования влияния жирного масла из семян амаранта на процессы пероксидного окисления липидов и белков,
системы антиоксидантной защиты и L-аргинин - N0* могут быть использованы при создании и разработке средств фармакологической коррекции метаболических сдвигов при заболеваниях, связанных с токсическим поражением печени.
Разработанные методы спектрофотометрического определения суммы стабильных метаболитов оксида азота и оценки интенсивности образования супероксиданиона в митохондриальной и микросомальной ЭТЦ клеток печени могут быть использованы при проведении научно-исследовательских работ в НИУ и ВАЗах.
Апробация работы. Основные результаты исследований, выполненных в период 2001-2004 г.г. были представлены на научных сессиях Воронежского госуниверситета (2002-2004 г.г.); Международной конференции «Свободные радикалы, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003); Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж 2004); III съезде биофизиков*России (Воронеж 2004), XIX съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004).
Публикации. Результаты работы изложены в 11 публикациях - 8 статьях, 3 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Токсическое повреждение печени сопровождается интенсификацией
образования в организме супероксиданиона, процессов пероксидной
модификации липидов и белков, оксида азота и консолидированной
адаптивной реакцией антиоксидантной системы.
Модуляция интенсивности образования в организме оксида азота изменяет характер течения процессов пероксидного окисления липидов и состояние антиоксидантной системы, как в норме, так и при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном.
Парентеральное применение амарантового масла оказывает гепато-протекторное действие и нормализует образование активных форм кислоро-
12 да, течение процессов свободнорадикального окисления при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 194 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список использованной литературы содержит 371 источника, из них 124 отечественных и 247 иностранных. Иллюстративный материал включает 19 рисунков и 23 таблицы.
Роль перекисного окисления липидов и системы антиоксидантнои защиты в патогенезе токсического повреждения печени
В основе морфологических изменений, развивающихся в печени при токсическом повреждении, лежит цитолиз гепатоцитов, инициирующий процесс прогрессирующего некробиоза печеночных клеток (Блюгер А.Ф. с соавт., 1981). Одним из универсальных механизмов повреждения и даже гибели клеток любых органов, тем более печени, является чрезмерная пероксидация мембранных структур, обусловленная усиленной выработкой активных форм кислорода (Владимиров Ю.Л., Поглазов А.Ф., 1973; Барабой В.А. с соавт., 1992; Kim K.Y. et. al., 2000). Одним из главных индикаторов цитолиза клеток печени является возрастающая активность аланинаминотрансферазы (ЛлЛТ) в сыворотке крови. ЛлЛт является цитозольным ферментом гепатоцитов, и возрастание активности этого фермента в сыворотке отражает увеличение проницаемости плазматической мембраны, которая в свою очередь, связана с некротическими изменениями в клетке.
Хотя механизм повреждающего воздействия токсинов различной природы на гепатоциты продолжает изучаться, начало поражения клеток связывают с развитием тканевой гипоксии (Владимиров Ю.А. с соавт., 1975; Ambrosio G. et al., 1987) и нарушениями окислительного фосфорилирования в митохондриях (Блюгер Л.Ф., Майоре А.Я., 1978). Снижение или прекращение синтеза: ЛТФ в гепатоцитах ведет к усиленной выработке гипоксантина с последующей активацией ксантиноксидазы, приводящей к усилению продукции супероксидных радикалов ИН2О2, повышенному расходу тканевых антиоксидантов и стимуляции пероксидации мембранных структур, что было показано в эксперименте на модели ишемии печени крыс (Rhoden E.L. et al., 2000):
Гепатотропные агенты действуют не только на биомембраны гепатоцитов, но изменяют также морфофункциональное состояние внутриклеточных образований. Повреждение мембран, ответственных за жизнедеятельность и поддержание химического гомеостаза клеток, является существенным звеном различных патологических процессов. Под действием повреждающих факторов фосфолипидная основа мембран, на которой размещены ферменты и происходит перенос электронов, является слабым звеном в авторегуляционном аппарате энергетического цикла клетки (Vengerovskii АЛ. et al., 1996). Их высокая уязвимость обусловлена наличием в составе молекул фосфатидило-вых кислот, составляющих основную массу мембранных структур, ненасыщенных жирных кислот (Артюхов В.Г., Наквасина М.А., 2000).
Дивинилметановая структура, имеющаяся во всех полиненасыщенных жирных кислотах, легко вступает в реакцию отрыва атома водорода, что при 27 водит к образованию свободных радикалов, а в присутствии кислорода — к инициированию радикальных цепей, т. е. к протеканию типичных реакций аутоокисления (Артюхов В.Г., Наквасина М.А., 2000).
Оценка активности процессов ПОЛ, протекающих в мембранах в условиях in vivo, представляет определенные трудности. Индикатором усиления процессов ПОЛ является увеличение содержания хотя бы одного из его продуктов. Лабораторные данные о содержании продуктов ПОЛ в биологических объектах могут нести в себе информацию о глубине и степени выраженности патологического процесса (Меерсон Ф.З., 1986). Удобной и доступной моделью для оценки механизма функционирования биомембран являются эритроциты. Установлена прямая корреляция между изменениями свойств мембран эритроцитов и цитоплазматических мембран клеток внутренних органов, в том числе печени. Применение комплексного подхода позволяет использовать красные кровяные клетки как тест-объект в изучении структурно-функциональных характеристик биологических мембран при токсическом повреждении печени (Тихомолова Е.Г. с соавт., 1994; Slater T.F. et al., 1985). Усиление интенсивности свободнорадикальных процессов, сопровождается разрушением аденозинтрифосфорной кислоты, значительным сокращением содержания полиненасыщенных жирных кислот в биологических мембранах, явлениями гиперферментемии в сыворотке крови и понижением уровня витамина А, а также наряду с этим повышением концентрации малонового диальдегида (МДА) - одного из основных продуктов перекисно-го окисления липидов (Kumar R. et al., 1997). Большинство исследователей оценивают уровень МДА в эритроцитах при токсическом повреждении печени как весьма информативный показатель процессов деградации липидов, СРО полиненасыщенных жирных кислот биомембран гепатоцитов (Блюгер А.Ф., Майоре А.Я., 1982).
Наличие процессов ПОЛ в гепатоцитах и интенсификация их при гипоксии печени доказано рядом экспериментальных и клинических исследований (Владимиров Ю.А. с соавт., 1975; Дудник Л.Б. с соавт., 1981; Ven-gerovskii АЛ. et al., 1996). Повышение уровня продуктов липопероксидации в органах и тканях при токсическом повреждении печени оказывает неблаго 28 приятное влияние на структурно-функциональное состояние клеток, в том числе самих гепатоцитов, вызывая в них процессы аутолиза и самоокисления (Майоре А.Я. с соавт., 1983). У больных гепатитом А и гепатитом В обнаружена прямая зависимость между содержанием продуктов липоиероксидации в сыворотке крови и тяжестью течения болезни. Тем не менее, прямая корреляция между показателями ПОЛ, активностью АлАТ и уровнем билирубине-мии у большинства больных отсутствовала (Дудник Л.Б. с соавт., 1988). Вместе с тем, у пациентов со злокачественным течением болезни и при печеночной коме не отмечено усиления процессов ПОЛ в связи с истощением основного его субстрата- НЖК, входящих в состав фосфолипидов мембран гепатоцитов (Скакун Н.П., 1987).
Пероксидации мембранных структур способствует также наличие в ге-патоцитах значительного количества ферментов, продуцирующих активные формы кислорода. Источниками супероксидных радикалов и Н2О2 могут быть ксантиноксидаза цитозоля (Kellog E.W., Fridovich I., 1975), альдегидок-сидаза, L-гулонолактоноксидаза пероксисом (Masters С, Holmes R., 1977), дегидрооротатдегидрогеназа (Forman H.J., Kennedy Y., 1976), пиридоксами-ноксидаза митохондрий, диаминооксидаза, НАДФН-цитохром С редуктаза, НАДН-цитохром С редуктаза эндоплазматического- ретикулума (Fang J., Beattie D.S., 2002). Перекись водорода способна продуцироваться перокси-сомальными уратоксидазой, гликолатоксидазой, L-a -гидрокислой оксидазой, D-оксидазой аминокислот. Важным источником активных форм кислорода являются НАДН-убихинонредуктаза и убихинон-цитохром С редуктаза (Лукьянова Л.Д. с соавт., 1982). Генерация супероксидных радикалов усиливается в очагах воспаления при контакте макрофагов с антигеном (Laskin J.D., Pendino K.J., 1995).
Несмотря на то, что при токсическом повреждении печени возрастает количество высокореакционных продуктов пероксидного окисления лиии-дов, способных вызывать повреждение тканей, в организме постоянно функционирует физиологическая антиоксидантная система защиты, которая ограничивает процесс свободнорадикального окисления практически во всех его звеньях и осуществляет контроль за содержанием активных форм кислорода, свободными радикалами и молекулярными продуктами пероксидного окисления лииидов. При дисбалансе между интенсивностью свободнорадикаль-ных реакций и антиоксидантной защитой наблюдается свободнорадикальная патология, которая, в конечном счете, является составной частью патогенеза токсического повреждения печени.
Определение субклеточной локализации генерации супероксиданиона в печени
Потенциальную преимущественную генерации супероксиданиона в субклеточных фракциях определяли разработанным нами модифицированным методом с использованием нитросинего тетразолия (НСТ). Нитросиний тетразолий, вступая в реакцию с супероксиданионом, превращается в фор-мазан, имеющий максимум поглощения в смеси хлороформ-диметилсульф-оксид в пределах 515-565 нм (Metcalf J.A. et al., 1986).
В качестве селективного индуктора генерации супероксиданиона в мито-хондриальной ЭТЦ использовался НАДН, а в микросомальной ЭТЦ — НАДФН (МецлерД., 1980). Предлагаемый нами метод позволяет оценить спонтанную продукцию супероксиданион радикала, преимущественный уровень его генерации в мито-хондриальной ЭТЦ, и микросомальной ЭТЦ.
Используемые объемные соотношения реагентов, их концентрации и ход определения описаны в п. 3.1.2.
Для определения стабильных метаболитов оксида азота использовался, разработанный нами спектрофотометрический метод, сочетающий восстановление нитрата и последующее определение образовавшегося нитрита с помощью реактива Грисса. Восстановление нитрата до нитрита достигается использованием хлорида ванадия (III).
Используемые объемные соотношения реагентов, их концентрации и ход определения описаны в п. 3.2.1.
Метод основан на спектрофотометрическом измерении нитрита, присутствующего в образце до и после добавления Hg24", которая, действуя как специфический разрушитель S-N связи, катализирует высвобождение из S-нитрозированных тиолов оксида азота, который, окисляясь до NO2 определяется с помощью реактива Грисса при 540 нм (Kubes P. et al., 1999; Moore К.Р., Mani A.R., 2002).
К 0,5 мл исследуемого образца добавляют 0,5 мл 0,2% HgC B 1% растворе сульфаниламида (опыт). К 0,5 мл плазмы добавляют 0,5 мл 1% раствора сульфаниламида в 0,5 М НС1 (контроль). Обе пробы инкубируются в темноте при 37С 10 мин. Затем в обе пробы добавляют по 0,5 мл 0,2% раствора N-( 1-нафтил)-этилендиамин. После этого пробы инкубируют в течение 10 минут при 37С в темноте. После этого образцы центрифугируют при 10.000g 10 минут для удаления осадка (при необходимости). Далее определяют оптическую плотность обоих образцов при 540 нм. Расчет проводят по формуле: C= (Eo - Ек) I 50.000, где С- концентрация S-нитрозотиолов, мМ/л Eo — экстинкция опытной пробы Ек - экстинкция контрольной пробы 50.000 - коэффициент пересчета
Для работы с тканью печени использовали 0,25 М раствор сахарозы, содержащий 1мМ/л ЭДТА; 50 мМ/л фосфатный буфер (рН 7,4). На первом этапе дифференциального центрифугирования для удаления неполностью разрушенных клеток и ядер гомогенат центрифугировали 10 мин при 1000g. Надосадочную жидкость переносили в центрифужные пробирки. Рыхлый осадок, содержащий ядра и неразрешенные клетки, в дальнейшей работе не использовался. Для получения цитозольной фракции супернатант центрифугировали 15 минут при 14000g. Осадок суспендировали вручную в среде выделения и подвергали повторному центрифугированию при 14000g в течение 15 минут для осаждения митохондрий. При анализе активности ЛДГ и СДГ для разрушения митохондрий применяли неионный детергент тритон Х-100. Для этого к осадку митохондрий, выделенных из 5 г ткани, добавляли 3 мл 0,1 % раствора тритона Х-100 в составе среды ресуспендирования: 50 мМ/л фосфатный буфер (рН 7,4); 1 мМ/л ЭДТА; 2 мМ/л ДТТ. Осадок суспендировали вручную и пробы оставляли на 25-30 минут во льду (Досон Р. с соавт., 1991).
Активность лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27.) - индикаторного фермента цитоплазматической фракции определяли при длине волны 340 нм в среде инкубирования следующего состава: 50 мМ/л трис - HCl-буфер с рН-7,5; 2 мМ/л пируват; 0,15 мМ/л НАДН (Землянухин А.А., Землянухин Л.А., 1996). За ферментативную единицу активности принимали количество фер 64 мента, которое вызывало окисление одного мкМ НЛДН за 1 минуту Количество ферментативных единиц рассчитывали по формуле:
ФЕ = Dx V,xe / V2xt, где с - коэффициент молярной экстинкции ;
D - прирост оптической плотности за время t; V] - общий объем ферментного раствора, мл; V2 - объем внесенной для измерения пробы, мл; t - время, мин. Активность сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.99.1) - индикаторного фермента митохондриальной фракции определяли с использованием феназинме-тасульфата. При этом использовали инкубационную среду следующего состава: 50 мМ/л трис-HCI буфер с рН 7,5; 1 мМ/л сукцинат; 0,002% ДХФИФ; 0,03% ФМС; 2 мМ/л азид Na. Для определения активности фермента использовали искусственные акцепторы электронов с оптимальными окислительно-восстановительным (Red/Ox) потенциалом и спектральными свойствами (ДХФИФ и ФМС). Об активности фермента судили по снижению оптической плотности при 600 нм (максимум поглощения для ДХФИФ), обусловленному обесцвечиванием акцептора в ходе его восстановления (Землянухин А.А., Землянухин Л.А., 1996). За единицу активности фермента принимали количество фермента превращающего один микромоль сукцината в минуту при 25С. Определение общего количества белка проводили биуретовым методом. Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 550 нм.
Статистическая обработка данных Аналитические определения для каждой пробы проводили в трех пов-торностях. Обсчет экспериментальных данных проводили с использованием прикладной статистической программы «Statistica 5.0» на PC «Pentium III». Достоверность отличий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стъюдента (Лакин Г.Ф., 1990).
Пероксидное окисление липидов при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном
Механизм повреждающего воздействия токсинов различной природы на гепатоциты продолжает изучаться, однако практически все исследователи отмечают, что начало поражения клеток печени при интоксикациях различной- этиологии связано с усилением интенсивности свободнорадикальных процессов, в частности пероксидного окисления липидов (Владимиров Ю.А. ссоавт., 1975; Ambrosio et.al., 1987).
Первая серия опытов проведена на двух группах крыс. Первая группа была контрольной (п=10). У животных второй группы (п=25) вызывали токсическое повреждение печени введением ССЦ. После второго введения CCL4 у 5 животных через 1, 2, 3, 5 и 7 суток проводили исследование в крови показателей, характеризующих интенсивность течения процессов пероксидного окисления липидов и белков.
Установлено что, развитие токсического повреждения печени вследствие введения животным тетрахлорметана приводило к повышению содержания продуктов ПОЛ в крови (табл. 6).
Уровень конъюгированных диенов через сутки после второй инъекции тетрахлорметана возрастал на 149,2 %, кетодиенов - на 121,2 %, а малоново ) го диальдегида в значительно меньшей степени - на 51,4 %. Через двое суток содержание в крови ДК было выше, чем у контрольных животных в 2,15 раза, но по сравнению с уровнем через сутки после второй инъекции тетра-хлорметана происходило даже некоторое снижение их концентрации в крови.
Начиная с 3 суток после введения ССЦ, уровень первичных продуктов ПОЛ в крови начинал снижаться и через неделю уже практически не отличался от уровня, характерного для контрольных животных.
Интенсивность накопления в крови более поздних продуктов ПОЛ отличалась от динамики накопления первичных продуктов пероксидации липидов (диеновых конъюгатов). Если наиболее выраженное увеличение концентрации диеновых конъюгатов происходило через 1 сутки, то максимальное увеличение содержания КД в крови было установлено на 2-е сутки после второго введения ССЦ, при этом концентрация КД возрастала в 2,5 раза по сравнению с уровнем, зафиксированным на 1 -е сутки. Аналогичная динамика зарегистрирована и для малонового диальдегида. Наиболее значительное увеличение уровня МДА при некотором снижении уровня ДК установлено на 2-е сутки после повторной инъекции ССЦ (рис. 2). В дальнейшем динамика снижения содержания в крови более поздних продуктов пероксидации (МДА) была идентичной снижению уровня начальных продуктов ПОЛ, и к 7-м суткам после введения тетрахлорметана их уровень понижался до контрольных значений.
По мнению ряда авторов (Меерсон Ф.З., 1984; Медведева Л.В., 2002) по величине соотношения ДК/МДА либо МДА/ДК в определенной степени можно судить об обшей направленности и интенсивности процессов свобод-норадикального окисления и характеризовать функциональное состояние ан-тиоксидантной системы. У интактных животных величина соотношения МДА/ДК в крови составляет 11,4±0,28. В первые двое суток после второй инъекции CCU происходило снижение величины соотношения МДА/ДК. Максимальное падение (в 1,65 раза) величины данного соотношения установлено через 24 часа. Через 48 часов отношение МДА/ДК достоверно снижалось в 1,32 раза, что свидетельствовало о возрастании интенсивности перехода первичных продуктов ПОЛ в промежуточные (рис. 3).
Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние АОС, образование N0" и S-нитрозотиолов у здоровых животных
Исследования проведены на 4-х группах животных. Первая группа была контрольная (п=10). Крысам второй группы (п=15) в течение 6 дней внут-рибрюшинно вводили водный раствор L-аргинин в дозе 400 мг/кг. Животным третей (п=15) и четвертой (п=15) групп вводили метиловый эфир нитро-L-аргинина (L-NAME) и аминогуанидин в дозах 50 мг/кг. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в том же объеме (1 мл).
Установлено, что введение животным L-агринина приводило к увеличению уровня суммарного содержания нитрата и нитрита на 44,2%, а применение ингибиторов NO-синтазы - к примерно одинаковому снижению более чем в 2 раза суммы NOx в плазме крови животных (табл. 12).
Параллельно с изменением продукции оксида азота установлено изменения в содержании в плазме крови S-нитрозотиолов (табл. 12).
Как было показано в предыдущем разделе и по литературным данным (Feelisch М. et al., 2002) существует выраженная корреляция между содержанием N0 и уровнем S-нитрозотиолов. Этот факт также подтвердился при экзогенном введении L-Arg, которое приводило к увеличению уровня S-нитрозотиолов - на 52,0 % (Р 0,05) в плазме крови животных контрольной группы.
В тоже время введение животным L-NAME и аминогуанидина - ингибиторов NO-синтаз, приводящее к снижению продукции NO более чем в 2 раза, не вызвало существенного изменения содержания нитрозотиолов по сравнению с животными контрольной группы (табл. 12). Вполне возможно, что в плазме крови существует некий базовый уровень нитрозотиолов, выступающий в качестве резервного фонда оксида азота, и который даже в условиях ингибирования продукции оксида азота используется незначительно.
Помимо этого, установлено, что модуляция синтеза NO не вызывает статистически достоверного изменения активности АлАт (рис. 14), что связано, вероятно, с возможностью депонирования избыточного N0" в форме нитрозотиолов (при активации NO-синтаз) и ресинтеза NO при восстановлении экзогенных нитритов (при ингибировании NO-синтаз).
В печени контрольных животных интенсивность НАДН-стимулирован-ной генерации (преимущественно митохондриальной) и НАДФН-стимулиро-ванной продукции (преимущественно микросомальной) супероксиданиона находятся прихмерно на одинаковом уровне (табл. 13).
Генерация супероксиданиона в разных компартментах клетки при введении L-аргинина статистически не отличалась от интенсивности его образования у контрольных животных. В тоже время применение блокаторов синтеза
NO приводило к увеличению как спонтанной, так и стимулированной (от ми-тохондриальной и микросомальной ЭТЦ) продукции супероксиданиона.
Введение L-аргинина, аминогуанидина и L-NAME здоровым животным не влияет на интенсивность процессов пероксидации липидов (табл. 14) и белков (рис. 15), так как статистически достоверных изменений в содержа 112 ний диеновых конъюгатах, кетодиенов, малонового альдегида и карбонильных групп не было установлено.
Полученные данные, подтверждают концепцию о циклических превращениях для N0 в организме млекопитающих, благодаря которым обеспечивается не только его эффективная наработка, но и достаточно быстрое выведение путем превращения в менее активные вещества, например ионы NO2 и NO3 , чем и может быть объяснено отсутствие биологического ответа при применении как активаторов, так и ингибиторов NO-синтаз. Помимо этого большинство биохимических изменений, происходящих в организме, обусловленных образованием оксида азота de novo, связывают с активацией индуцибельной NO-синтазы, экспрессируемой цитокинами, в то время как увеличение продукции оксида азота при использовании L-аргинина (табл.12), видимо, происходило за счет активации конститутивных изоферментов. Так же нами была показана выше возможность депонирования избыточного количества N0" при образовании S-нитрозотиолов.
При изучении влияния модуляции оксида азота на состояние антиокси-дантной системы организма, установлено, что введение L-аргинина вызвало повышение активности основных ферментов АОЗ.
Из данных, представленных в таблице 15 видно, что при введении животным эндогенного предшественника оксида азота L-аргинина повышается на 13,6 % активность СОД и на 22,1% - каталазы.
