Введение к работе
Актуальность проблемы. В ряде исследований было показано, что фактор некроза опухоли-а (ФНО-а) стимулирует генерирование активных форм кислорода (АФК) и индуцирует апоптоз различных типов клеток (Скулачев В.П., 2001; Droge W., 2002; David J., 1992; Role...2000). Полагают, что ФНО-а-опосредованный апоптоз лежит в основе развития болезней печени (Nietsch Н.Н., 1999; David J., 1992; Mechanisms of hepatotoxicity.., 2002). Необходимо подчеркнуть, что индукция ФНО-зависимого апоптоза в клетках печени требует сенситизации гепатоцитов, например, такими ингибиторами транскрипции как галактозамин-N (Гал-N) или актиномицин-D (Akt-D) (Effect of hepatocyte.., 2000; Hepatocytes Sensitized.., 2000). Так, было показано, что совместное воздействие Акт-D и ФНО-а вызывает активацию каспаз-3; -8; -9, выход цитохрома С из митохондрий, снижает уровень НАДФН и повышает концентрацию АФК в гепатоцитах (Disruption of redox.., 2000).
Подавлению интенсивности свободнорадикального окисления (СО) биомолекул может способствовать изменение функционирования ферментов цикла трикарбоновых кислот (НТК) (Tretter L., 2000, СкулачевВ.П., 2001;). В этой связи вызывает интерес изучение каталитического действия НАД-изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.41; НАД-ИДГ), одного из ключевых ферментов ЦТК. Актуальность изучения регуляции активности НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ, К.Ф. 1.1.1.42.) обусловлена генерированием в ходе ферментативной реакции НАДФН, необходимого для функционирования глутатионредуктазной/ глутатионпероксидазной (ГР/ГП) антиоксидантной системы (AOC) (Lee S.M., 2002; Structures of human.., 2004). Показано, что митохондриальная НАДФ-ИДГ может вносить определенный вклад в снижение степени развития апоптоза (Control of mitochondrial...2001; Lee JH., 2007). При индукции апоптоза и оксидативного стресса (ОС) происходит истощение АОС (Саприн А.Н., 1999; Шульпекова Ю.О., 2004). Интересно отметить, что продукт ИДГ-реакции, 2-оксоглутарат (2-ОГ) , способен оказывать антиоксидантный эффет при развитии ОС (Tulsawani R., 2006; Alpha-ketoglutarate.., 2009; Acute toxicity.., 2009; Oxidative stress.., 2009).
В настоящее время убедительно доказано, что тиоктовая кислота (ТК) и мелатонин (М) не только обладают самостоятельным антиоксидантным потенциалом, но и обеспечивают мощную поддержку работы других звеньев АОС в организме (Protective effect.., 2005; Melatonin protects.., 2007). Ряд данных свидетельствует, что эти вещества являются эффективными гепатопротекторами (Козачок Н.Н., 2003; Макеева А.В., 2007; Попов С.С, 2008).
В связи с этим вызывает интерес изучение регуляции активности НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ, выделенных из печени крыс в норме, при развитии апоптоза и действии ТК и М на фоне апоптоза.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы -исследование регуляции активности НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ из печени крыс при индукции апоптоза, вызванном
введением Акт-D и ФНО-а, а также при действии ТК и М на фоне развития патологического состояния. В связи с целью были поставлены следующие задачи: 1) оценка антиоксидантного статуса в крови и печени крыс при индукции апоптоза и действии ТК и М на фоне развития патологии; 2) исследование степени фрагментации ДНК печени крыс в условиях развития апоптоза и при введении ТК и М; 3) исследование субклеточной локализации и активности НАД- и НАДФ -зависимых изоцитратдегидрогеназ в гепатоцитах крыс при введении Акт-D и ФНО-а и действии гепатопротекторов; 4) получение высокоочищенных ферментных препаратов НАД- и НАДФ-ИДГ из печени крысы при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов на фоне развития апоптоза; 5) определение кинетических свойств НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ из печени крысы при индукции апоптоза и действии ТК и М на фоне развития апоптоза; 6) исследование регуляции активности ИДГ из печени крыс некоторыми метаболитами цикла Кребса и глутаматом, при апоптозе и действии гепатопротекторов на фоне развития апоптоза; 7) исследование регуляции активности ИДГ, выделенной из печени крыс при введении Акт-D и ФНО-а и действии протекторов на фоне развития апоптоза компонентами ГП/ ГР системы; 8) исследование регуляции активности ИДГ из печени крыс компонентами реакции Фентона и ионами некоторых металлов, при индукции апоптоза, а также при действии гепатопротекторов на фоне развития апоптоза; 9) исследование влияния адениннуклеотидов на активность НАД- и НАДФ-ИДГ из печени крыс экспериментальных групп животных; 10) создание гипотетической модели участия НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ в регуляции процессов СО в гепатоцитах с учётом особенностей функционирования данных ферментов при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов на фоне развития патологии.
Научная новизна. Впервые изучены особенности функционирования НАД- и НАДФ- ИДГ при развитии апоптоза, индуцированного Акт-D и ФНО-а, и при действии гепатопротекторов на фоне патологического процесса. Показана адаптивная роль ИДГ в условиях индукции апоптоза, проявляющаяся в изменении их активности и регуляторных свойств по отношению к ряду метаболитов. Выявлены механизмы, обеспечивающие модификацию активности НАД- и НАДФ-ИДГ в условиях развития апоптоза. Исследована роль различных метаболитов в изменении активности исследуемых ферментов.
На основе анализа особенностей регуляции активности НАД- и НАДФ-ИДГ при апоптозе и действии гепатопротекторов на фоне развития патологии, впервые разработана гипотетическая схема участия ИДГ в снижении темпов апоптотических и свободнорадикальных процессов при патологических изменениях в печени экспериментальных животных.
Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о функционировании НАД- и НАДФ-ИДГ в условиях индукции апоптоза и действия гепатопротекторов. Особенности регуляции активности данных ферментов при развитии апоптоза способствуют пониманию развития патологических изменений в печени и
поиску путей их коррекции в медицинской практике. Разработанные способы получения высокоочищенных ферментных препаратов изоцитратдегидрогеназ могут применяться в научно-исследовательской практике.
Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении курсов «Биохимия человека», «Медицинская биохимия», а также спецкурсов по аналитической биохимии и энзимологии. Кроме того, материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых, дипломных работ и магистерских диссертаций студентами.
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 5-й научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» ( Воронеж, 2007), международной научной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, 2008), международном симпозиуме «Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины» (Москва, 2008), VIII съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, 2008), на Всероссийской заочной электронной научной конференции «Медицинские технологии» (Москва, 2008), на общероссийской научной конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2009), III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов-на -Дону, 2009), III Всероссийской научно-практической конференции «Биологические системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования» (Нижний Тагил, 2010), на 14-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» (Пущино, 2010).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 16 публикациях - 7 статьях и 9 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения:
При развитии апоптоза, вызванного введением крысам Акт-D и ФНО-а, происходит интенсификация свободнорадикальных процесссов и активация АОС, что сопровождается повышением уровня диеновых конъюгатов, параметров биохемилюминесценции, возрастанием активности аминотрансфераз, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, НАД- и НАДФ-изоцитратдегидрогеназ в печени и сыворотке крови, а также фрагментацией ДНК в гепатоцитах крыс. При действии ТК и М на фоне развития апоптоза наблюдается сдвиг ряда исследуемых параметров в сторону контрольных значений.
Субклеточная локализация, молекулярная масса и электрофоретическая подвижность НАД- и НАДФ-ИДГ не изменяются при увеличении активности ферментов в условиях индукции апоптоза, а также при снижении ферментативной активности при введении гепатопротекторов.
Исследования, проведённые с использованием гомогенных ферментных препаратов НАД- и НАДФ-ИДГ, выделенных из печени крыс
контрольной группы и животных с индуцированным апоптозом, а также крыс, которым вводили ТК и М, свидетельствуют о существенных модификациях механизмов метаболитной регуляции активности и ряда кинетических параметров каталитического действия различно локализованных форм ИДГ при развитии апоптоза и действии веществ-протекторов.
4. На основе анализа функционирования НАД- и НАДФ-ИДГ при индукции апоптоза и действии гепатопротекторов предложена гипотетическая схема, отражающая участие данных ферментов в печени крыс в ограничении темпов свободнорадикальных процессов и особенностей регуляции их активности.
Структура и объем работы. Диссертация представлена на 175 страницах основного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (7 глав), заключения, выводов, списка литературы (407 источника) и на 52 страницах приложения. Иллюстративный материал включает 33 рисунка и 14 таблиц. В приложении содержатся 57 рисунков и 3 таблицы.
