Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Ю
1. Механизмы функционирования аденилатциклазы и фосфодиэстеразы
а) Аденилатциклаза, структура и регуляция активности.....
б) Фосфодиэстераза циклических нуклеотидов, структура и регуляция активности 20
2. Физиологическая роль внутриклеточного кальция 25
а) Регуляция содержания свободного внутри клеточного Са 25
б) Регуляция ионами Са активности аденилатциклазы и фосфодиэстеразы 31
3. Молекулярные механизмы развития синдрома диареи при холере 35
а) Роль циклического АМФ в патогенезе холеры 35
б) Молекулярные механизмы действия холерного энтеротоксина на аденилатциклазу 40
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ 46
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 56
1. Влияние двухвалентных катионов на активность аденилатциклазы слизистой тонкой кишки кролика 56
2. Роль фосфодиэстеразы и ионов Са2+ в регуляции содержания внутриклеточного цАМФ в слизистой тонкой кишки кролика 70
3. Влияние Са на содержание цАМФ в слизистой тонкой кишки кролика и на секрецию жидкости 79
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 88
ВЫВОДЫ 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114
СПИСОК ПУБЛИКУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 138
- Механизмы функционирования аденилатциклазы и фосфодиэстеразы
- Физиологическая роль внутриклеточного кальция
- Влияние двухвалентных катионов на активность аденилатциклазы слизистой тонкой кишки кролика
Механизмы функционирования аденилатциклазы и фосфодиэстеразы
В присутствии Ма + или Мп одна молекула АТФ превращается в цАМФ и пирофосфат. Открыт фермент и впервые описана эта реакция была Сазерлендом и его сотрудниками (158, 186). В присутствии Jla1 константа равновесия этой реакции равна 0,065 М (146) В клетках млекопитающих, где концентрация цАМФ составляет 0,5-1,5 мкМ (97), а концентрация АТФ - более 10 М (142), реакция синтеза цАМФ практически необратимо направлена в сторону синтеза цАМФ. Аденилатциклаза обнаружена почти во всех исследованных тканях животных (146), за исключением эритроцитов человека (83) и клеток некоторых линий опухолей (37). Этот фермент найден также у грибов и бактерий (146).
Физиологическое значение данного фермента очень велико. Продукт аденилатциклазной реакции - цАМФ является универсальным регулятором метаболизма клеток про- и эукариот. В тканях животных он играет роль "вторичного мессенжера" в передаче сигнала через цитоплазматическую мембрану клеток. Этот циклический нукле-отид принимает участие в регуляции обмена белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот, влияет на проницаемость цитоплаз-матической мембраны, процессы секреции, дифференцировку и пролиферацию клеток (8, II, 146). Найдена связь между содержанием цАМФ и характером протекания многих патологических процессов у животных и человека. В частности, обширная литература посвящена - II роли цАМФ в патогенезе диареи при ряде кишечных инфекций (5, 14, 15, 57, 58). Описано участие цАМФ в проявлении действия многих лекарственных препаратов на организм (II).
Экспериментально доказано, что аденилатциклаза локализована в плазматических мембранах клеток (146, 86). Активность адени-латциклазы обнаруживается и в мембранах саркоплазматического ретикулума (60), в аппарате Гольджи (59, 60), в ядрах клеток (179). Однако, во всех случаях основная активность этого фермента обнаруживается во фракции цитоплазматических мембран. В энтероцитах слизистой тонкой кишки животных аденилатциклаза локализована на базолатеральной мембране, в щеточной каемке выявить ее не удалось (123). Очистка мембранного препарата аденилатциклазы обычно сопровождается параллельным повышением активностей Afa. /1С " АТШазы, 5 - нуклеотидазы и других маркерных ферментов плазматических мембран (122, 123). Молекулярный вес аденилатциклазы, выделенной из разных тканей животных, составляет приблизительно 214-230 тысяч дальтон (171, 193). Различия в молекулярном весе зависят от условий выделения фермента (139).
Аденилатциклаза - сложный олигомерный белковый комплекс, состоящий, по крайней мере, из трех компонентов: гормонального рецептора, регуляторного белка и каталитической субъединицы (19). Важное значение в регуляции активности аденилатциклазы играет фосфолипидное окружение фермента (122).
Влияние гормонов, простагландинов и биологически активных веществ на аденилатциклазу опосредуется их связыванием со специфическими мембранными рецепторами. Один и тот же гормон, действуя через изменение содержания цАМФ в клетках, вызывает в разных тканях организма различные метаболические ответы. Тип ответа зависит от генетически обусловленных особенностей данной ткани (4). Наличие рецепторов для активации аденилатциклазы было экспе - 12 -риментально доказано. Используя технику гибридизации клеток с помощью вируса Сендай, Орли и Шрамм (144) и другие исследователи (160) показали, что рецепторы гормонов, простагландинов и аденилатциклаза являются дискретными белковыми молекулами, способными к диффузии и взаимодействию в липидном бислое мембран. # -адренэргические рецепторы были отделены от аденилатциклазы и охарактеризованы по физическим свойствам (117). Помимо fr-адренэргических рецепторов довольно полно охарактеризованы были и другие рецепторы (74).
Физиологическая роль внутриклеточного кальция
Вторым после циклических нуклеотидов внутриклеточным посредником действия гормонов и биологически активных веществ на клетку и регулятором активности многих внутриклеточных ферментов являются ионы Ga . Известно большое количество внутриклеточных процессов, скорость которых определяется величиной содержания Ga + в цитозоле клетки: метаболизм липидов, гликогена, белков, дифференцировка и деление клеток, биоэлектрические процессы и мышечное сокращение, процессы секреции и другие (6, 63). Количество биологических функций, обнаруживаемых у - 26 -Ca +, велико и знания о них продолжают расширяться и углубляться по мере изучения роли этого катиона в клеточном обмене веществ.
В плазме крови концентрация Са около 2 мМ, а содержание Са в клетке порядка 10 М. Однако, не более 1% всего внутриклеточного Са находится в свободном состоянии (9, 159). В ин-тактных клетках эукариот в свободном состоянии в цитозоле содержится 10 - 10 М Са , а при возбуждении клетки концентрация Са увеличивается до 10-. Источниками Са + в цитозоле клетки могут быть внеклеточное пространство, саркоплазматический и эндо-плазматический ретикулумы клетки, митохондрии и плазматические мембраны (159). Км для Са + у транспортных систем плазматических мембран равно 5 Ю""Ч!А, эндоплазматического ретикулума 10 М, мембран митохондрий 10 М. Наибольшее количество внутриклеточного Cafc+ приходится на митохондрии. Внеклеточное пространство и митохондрии являются основными источниками свободного Са в цитозоле многих типов клеток (159).
Проникновение Са в клетку из внеклеточного пространства может быть как независимым, так и зависимым от мембранного потенциала. Нейромедиаторы деполяризуют плазматические мембраны, в результате чего они становятся проницаемыми для Са . Этот процесс осуществляется через каналы, которые выеокоспецифичные для Са . Кроме того, некоторое количество Са может проникать в клетку после деполяризации мембран через No. -каналы (6). Пассивное поступление Са + в клетку из внеклеточного пространства регулируется гормонами и биологически активными веществами, взаимодействие которых с плазматической мембраной клетки не приводит к ее деполяризации (6). Так, например, катехоламины и их агонисты, взаимодействуя с L-адренорецепторами клетки, увеличивают содержание ионов Са в цитозоле клетки, стимулируя
- 27 -вход Gar+ в клетку из внеклеточного пространства (159, 182). Увеличение содержания внутриклеточного цАМФ также вызывает увеличение содержания ионов Са + в цитозоле за счет увеличения поступления данного катиона в клетку из внеклеточного пространства (81) и за счет высвобождения Са + из митохондрий, и других внутриклеточных структур (87, НО).
Содержание свободного Са в цитозоле клетки определяется соотношением скоростей его поступления в цитозоль, с одной стороны, и выхода его из клетки, а также связывания данного катиона внутриклеточными структурами, с другой стороны. Связывание Са + с некоторыми внутриклеточными структурами и выброс его из клетки - это энергозависимый процесс. В энергозависимом процессе связывания Са + принимают участие митохондрии, эндоплазматичес-кий и саркоплазматический ретикулумы и другие мембранные струк-туры клетки (159). Выход Ga через плазматические мембраны во внеклеточное пространство реализуется о&/ Са + обменом за счет энергии натриевого градиента, а также специфической Са +-АТФазой, т.е. кальциевым насосом (100, 115, 161).
Влияние двухвалентных катионов на активность аденилатциклазы слизистой тонкой кишки кролика
На первом этапе данной работы было исследовано регуляторное влияние Са + на аденилатциклазу слизистой тонкой кишки кроликов. Из рис.8 видно, что аденилатциклаза слизистой тощей кишки кролика ингибируется ионами Са+ в широком диапазоне исследо 7 З 2.А. ванных концентраций (от 10 до 10 М). При концентрации Са ,равной 10 М, достигается 50%-ый эффект ингибирования, а при концентрации 10 М (максимальная концентрация данного катиона, которая может быть достигнута в цитозоле клетки при физиологических условиях) активность аденилатциклазы ингибируется на 30%. В присутствии ЭГТА аденилатциклаза проявляет наибольшую активность. С целью исследования механизма ингибирования аденилатциклазы ионами Са+ в данной работе было изучено влияние этого катиона на фермент в присутствии различных эффекторов, известных как активаторы аденилатциклазы в других тканях. Оказалось, что гистамин, серотонин и изопротеренол не влияют на активность аденилатциклазы слизистой тонкой кишки кролика в присутствии ЭГТА. Отсутствует активация фермента этими веществами и при различных концентрациях ионов Са .
Негидролизуемый ГТФазой Л/ -белка аценилатциклазы аналог ГТШ - Gpp(Nhi)? в концентрации 10 % активирует аденилатциклазу слизистой тонкой кишки кролика в 2 раза (рис.Ш). Ионы Са + ин-гибируют аденилатциклазу, активированную данным гуаниловым нуклеотидом, так же, как и базальную активность этого фермента. Аденилатциклаза, преинкубированная с &рр(/і/и)р , и отмытая от несвязавшегося с /V -белком избытка гуанилового нуклеотида, ингибируется ионами Са + так же, как ив присутствии &рр(А/Н)р .
Подобный эффект ингибирования аденилатциклазы ионами Са + наблюдается и в присутствии другого активатора фермента - rfci.F t который так же, как и Gpp(tfH)p , осуществляет свое активирующее действие на аденилатциклазу через регуляторний //-белок (19). Небольшое различие в активности аденилатциклазы в присутствии &рр(А/и)р и после преинкубации фермента с &рр(//н)р объясняется, по-видимому, частичной потерей активности этого фермента во время отмывки мембранного препарата от избытка &рр(л/н)р . Степень активации аденилатциклазы &рр(л/н)р в данном эксперименте ниже, чем степень активации фермента фторидом. По-видимому, это объясняется недостаточным временем инкубации фермента с этим гуаниловым нуклеотидом, так как известно, что Ьрр(іїн)р быстро переводит аденилатциклазу в высокоактивное состояние только в присутствии гормона. В отсутствие же гормонов наблюдается латентный период (лаг-фаза) в активации фермента этим гуаниловым нуклеотидом (2). Поскольку между эффектами Са на базальную активность аденилатциклазы, на преинкубированную с &рр (А/и) р , а также активность, измеренную в присутствии (грр(мн)р или A/aF , принципиальных различий нет (рис.8), можно было заключить, что ингибиругощее влияние ионов Са + проявляется на сам каталитический процесс - реакцию превращения АТФ в цАШБ, независимо от функционального состояния активности аденилатциклазы.
