Введение к работе
Актуальность проблемы. Голубые медьсодержащие оксидазы (МСО), к которым относятся лакказа (Lc), билирубиноксидаза (ВОх) и аскорбатоксидаза (АОх), а также церулоплазмин (Ср), занимают особое место среди окислительно-восстановительных ферментов. Они обладают высокой удельной активностью и способностью к прямому восстановлению Ог до НгО без образования промежуточных высоко реакционно-способных токсичных интермедиатов кислорода. Большой интерес, как в фундаментальном, так и прикладном плане, представляет субстратная специфичность этих ферментов, способных окислять широкий круг органических и неорганических соединений. Окисление органических соединений протекает по свободно-радикальному механизму, который в настоящее время до конца не изучен. Таким образом, МСО представляют большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований их структуры и механизма катализа. Это обусловлено строением активного центра медьсодержащих оксидаз, в который входят ионы меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых в процессе каталитического акта одноэлектронного окисления субстратов доноров электронов или атома водорода, позволяет осуществлять восстановление Ог непосредственно до НгО. Помимо этого, каталитические свойства МСО делают возможным их широкое использование в целлюлозно-бумажной, текстильной, пищевой и косметической промышленностях, а таже медицине. МСО используются для детоксикации и обесцвечивания сточных вод, биодеградации ксенобиотиков, создания антимикробных композиций, получения древесноволокнистых плит, древесных блоков и картона без применения токсичных связующих, при производстве моющих средств и в клиническом анализе.
Интерес к практическому использованию МСО еще более возрос в середине 90-х годов XX века, после открытия возможности усиления действия этих ферментов с использованием различных редокс-медиаторов, что позволило существенно расширить область их практического применения. Медиаторы МСО представляют собой субстраты этих ферментов, в процессе окисления которых образуются высоко редокс-потенциальные и химически активные продукты. Последние могут вступать в реакцию с соединениями, которые не подвергаются окислению одними лишь оксидазами, или участвовать в переносе электронов в электрохимических реакциях, ускоряя электрохимические процессы с участием данных ферментов. Кроме того, в процессе окисления органических субстратов образуются свободные радикалы, которые могут модифицировать другие соединения. Значительный интерес представляет собой использование МСО в органическом синтезе. Показана возможность использования МСО для окисления первичных гидроксильных групп производных Сахаров, для синтеза винбластина и бензальдегидов.
Важным направлением практического использования данных ферментов является их применение в биоэлектронике - новой области биотехнологии, сформировавшейся на стыке биологии и электроники и имеющей большое прикладное значение для медицины, высокотехнологичных производств и биокомпьютерных технологий. Основой для создания биосенсоров и биотопливных элементов может быть субстратная специфичность МСО, их высокая активность и стабильность, а также возможность протекания реакции прямого биоэлектрокатализа.
Однако, до сих пор остается неясным детальный механизм функционирования и принципы регуляции активности данного класса ферментов.
Цель работы - установление механизма функционирования и регуляции активности МСО в гомогенных и гетерогенных биокаталитических системах с целью их обоснованного и рационального использования в биокаталитическом синтезе и системах биодеградации ксенобиотиков, для разработки устройств трансформации химической энергии в электрическую, а также для оптимизации электроаналитических сенсоров. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:
-
Детально изучить биохимические и каталитические характеристики грибных, древесной и бактериальной Lc с целью выбора наиболее перспективных ферментов для использования в различных биотехнологических процессах и биоэлектронных устройствах.
-
Разработать метод экологически чистого синтеза электропроводящего полианилина с участием высоко редокс-потенциальных Lc.
-
Предложить стратегию отбора и исследования потенциальных редокс-медиаторов Lc и провести апробацию лакказа-медиаторных систем (LMS) на практически значимых объектах.
-
Провести комплексное сравнительное спектральное и электрохимическое изучение МСО, включающее, в том числе, и разработку методов и подходов редокс-титрования микроколичеств белков с целью определения редокс-потенциалов их активных центров.
-
Предложить подходы для практического использования МСО в биосенсорах и биотопливных элементах.
6. Выяснить закономерности регуляции активности МСО на молекулярном уровне с
использованием электрохимических методов. Экспериментально показать "диод-" и "триод-
подобные" свойства биоэлектрохимических устройств.
Научная новизна работы. На основании комплексного исследования основных биохимических и физико-химических свойств, субстратной специфичности и каталитических параметров грибных, бактериальной и древесной Lc выявлены основные критерии отбора Lc из различных таксономических групп для использования в биотехнологии. Детально изучены и систематизированы биоэлектрохимические свойства Lc, ВОх и Ср. Предложены новые экспериментальные подходы для исследования активных центров МСО, в том числе разработаны уникальные макро и микро спектроэлектрохимические ячейки. С их использованием были определены значения редокс-потенциалов Т1 центров МСО, а также впервые установлены возможные значения потенциалов некоторых интермедиатов трехъядерного медного кластера ферментов. Сформулированы и экспериментально исследованы пути сопряжения ферментативных реакций МСО и электрохимических процессов с их участием. Комплексные физико-химические и биохимические исследования показали, что механизм и эффективность электронного переноса (ЭП) зависит от ориентации молекул фермента на поверхности электрода. Результаты исследования биохимических, физико-химических, спектральных и электрохимических свойств МСО, субстратной специфичности и механизма действия этих ферментов вносят свой вклад в понимание механизма гомогенного и гетерогенного катализа многоядерными медьсодержащими оксидазами. Теоретически обоснованы и экспериментально доказаны "диод-" и "триод-подобные" свойства высоко редокс-потенциальной грибной Trametes hirsuta Lc. Высказано предположение о регуляторном значении открытых и исследованых "полупроводниковых" свойств МСО при функционировании данных ферментов в природе. Обнаружен новый класс редокс-медиаторов Lc (усилителей действия фермента) с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5 (РР). Подобраны и экпериментально подтверждены научно-обоснованные критерии отбора редокс-медиаторов Lc для создания эффективных систем для обесчвечивания лигноцеллюлозы.
Впервые с участием высоко редокс-потенциальной грибной Lc осуществлен синтез электропроводящего полианилина и изучены его физико-химические свойства. Практическая значимость. Решение поставленных задач позволило выяснить возможности, ограничения и перспективы использования голубых МСО в различных областях биотехнологии. На основе различных Lc разработаны амперометрические биосенсоры для определения соединений фенольной структуры и водорастворимого лигнина. Сконструированы и охарактеризованы модели безмедиаторных, безмембранных биотопливных элементов, использующих в качестве топлива глюкозу, а в качестве окислителя - растворенный кислород. Предложена схема отбора потенциальных редокс-медиаторов Lc и экспериментальные методы их тестирования, что значительно облегчает поиск новых медиаторов фермента. Ряд соединений класса РР отвечают многим требованиям, предъявляемым к усилителям действия ферментов, а именно высокая эффективность, низкая стоимость и экологическая чистота. Показана возможность использования этих соединений для отбеливания лигноцеллюлозы. В частности,
проведены лабораторные испытания LMS для делигнификации бумажной пульпы. Разработаны методы ферментативного синтеза электропроводного полианилина с различными свойствами, отвечающие требованиям «зеленой» химии. Положения, выдвигаемые на защиту:
особенности механизмов гомогенного и гетерогенного катализа с участием высоко и низко редокс-потенциальных голубых МСО;
биоэлектрохимические свойства голубых МСО, адсорбированных на электродах из различных материалов;
обоснование "диод-" и "триод-подобных" свойств Lc;
амперометрические биосенсоры на основе голубых МСО для определения соединений фенольной структуры и лигнина;
модели безмедиаторных, безмембранных биотопливных элементов, использующих углеводы в качестве топлива и растворенный кислород в качестве окислителя;
схема отбора потенциальных редокс-медиаторов Lc и методы их тестирования;
разработка методов синтеза электропроводящего псевдоводорастворимого, а также оптически активного полианилина.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 41 научная статья, получено 4 российских патента. Данные диссертации суммированы в 4 обзорных статьях, а также включены в книгу "Электрохимия белков и нуклеиновых кислот", выпущенную издательством «Elsevier». Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на 17 российских и международных конференциях, конгрессах, симпозиумах, в том числе: на Международной конференции "Биокатализ-2002" (Москва, Россия, 2002), на Международной конференции "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2002), на XVII и XVIII Международных симпозиумах "Биоэлектрохимия и биоэнергетика" (Флоренция, Италия, 2003 и Коимбра, Португалия, 2005), на 8-ой Международной Пущинской Школе-Конференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, Россия, 2004), на VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа (Уфа, Россия, 2004), на Международных конгрессах электрохимического общества (Квебек, Канада, 2005, Бусан, Корея, 2005, Денвер, США, 2006), на IV Балтийской электрохимической конференции (Грейфсвальд, Германия, 2005), на II Международном Симпозиуме "Модификация поверхности для химического и биохимического распознавания" (Казимеш Долны, Польша, 2005), на Международной конференции "Электроанализ" (Бордо, Франция, 2006).
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 334 страницах. Список цитируемой литературы включает 478 наименований. Иллюстративный материал содержит 108 рисунков и 23 таблицы.
Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, в развитии и проверке экспериментальных подходов, предложенных в работе, а также в обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов. Экспериментальная работа выполнена самим автором, а также сотрудниками, аспирантами и студентами под руководством автора. В исследованиях, проведенных в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, непосредственном участии в экспериментальной работе, в обсуждении полученных результатов и в оформлении их в виде публикаций.
