Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Почвенные азотфиксирующие бактерии вида Paenibacillus polymyxa 11
1.1.1 Морфологические и физиологические особенности бактерий 11
1.1.2 Практическое использование бактерий P. polymyxa 12
1.1.3 Механизмы стимулирующего воздействия на растения 14
1.2 Основные этапы растительно-бактериального взаимодействия 17
1.2.1 Прикрепление бактерий P. polymyxa к корням растений 17
1.2.2 Образование биопленок 21
1.2.3 Деформации корневых волосков 23
1.3 Экзополисахариды ризобактерий P. polymyxa 26
1.3.1 Физико-химическая характеристика и свойства экзогликанов бактерий P. polymyxa 26
1.3.2 Практическое использование микробных полисахаридов 31
1.3.3 Иммунотропные свойства ЭПС 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1 Объекты исследования 37
2.2 Приборы и материалы 39
2.3 Методы выделения и исследования химического состава экзополисахаридов 40
2.3.1 Выделение экзополисахаридов P. polymyxa 40
2.3.2 Определение кинематической вязкости 42
2.3.3 Хроматографические методы 42
2.3.4 Колориметрическое определение состава углеводсодержащих полимеров 44
2.3.5 Электрофорез в полиакриламидном геле 44
2.3.6 ИК-спектроскопический анализ 44
2.3.7 Распад по Смиту 44
2.4 Методы исследования деформаций корневых волосков и способности P. polymyxa к колонизации корней и формированию биопленок 45
2.5 Иммунохимические методы исследования 46
2.5.1 Иммунизация животных и получение поликлональных кроличьих антител 46
2.5.2 Реакция агглютинации 47
2.5.3 Встречная двойная иммунодиффузия 47
2.5.4 Иммуноферментный анализ (ELISA) 47
2.6 Методы исследования иммуномодулирующего действия экзополисахаридов 48
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 51
3.1 Сравнительное исследование продукции внеклеточных полисахаридов штаммами P. polymyxa 51
3.2 Выделение, очистка и исследование химического состава экзополисахаридов бактерий P. polymyxa 60
3.3 Иммунохимическое исследование экзополисахаридов P. polymyxa 70
3.4 Оценка способности бактерий P. polymyxa к колонизации корней проростков пшеницы 73
3.4.1 Наблюдение колонизации корней пшеницы посредством световой микроскопии 75
3.4.2 Различия бактерий P. polymyxa в способности к адсорбции на корнях и индукции деформаций корневых волосков 75
3.4.3 Количественная оценка колонизации P. polymyxa 1465 корней пшеницы методом иммуноферментного анализа (ELISA) 82
3.5 Оценка способности к формированию биопленок ряда штаммов P. polymyxa, отличающихся по выходу и реологическим свойствам ЭПС 87
3.6 Исследование активности экзополисахаридов P. polymyxa в отношении индукции факторов неспецифической резистентности макроорганизма 91
Заключение 104
Выводы 109
Список использованной литературы 111
Благодарности 131
- Механизмы стимулирующего воздействия на растения
- Иммунотропные свойства ЭПС
- Выделение, очистка и исследование химического состава экзополисахаридов бактерий P. polymyxa
- Исследование активности экзополисахаридов P. polymyxa в отношении индукции факторов неспецифической резистентности макроорганизма
Введение к работе
Актуальность темы. Почвенные азотфиксирующие ризобактерии
Paenibacillus polymyxa, по старой классификации Bacillus polymyxa (Ash et al., 1993), стимулируют рост и развитие широкого круга растений благодаря формированию эффективных ассоциативных отношений. Это связано со способностью этих микроорганизмов к азотфиксации, фосфатмобилизации, продукции фитогормонов, антибиотиков (Mannanov and Sattarova, 2001), широкого спектра литических ферментов, высокой адаптивностью к условиям существования, а также частым обнаружением их в ризосфере злаков (Lebuhn et al, 1997, da Mota et al, 2002; Lai and Tabacchioni, 2009). Опытным путем доказано, что P. polymyxa, находясь в ассоциации с растениями, могут увеличивать сопротивляемость растительного организма биотическим и абиотическим стрессам (McSpadden, 2004; Selim et al, 2005; Timmusk et al, 2005). Ряд исследователей выдвигает на первый план в данных процессах способность P. polymyxa к эффективной колонизации и формированию биопленок (Haggag and Timmusk 2008; Timmusk et al, 2009). Показано, что некоторые штаммы не только колонизируют корневую поверхность (Bent et al., 2002), но и проникают внутрь корневых тканей (Shishido etal, 1999).
Бактерии P. polymyxa известны как активные продуценты кислых и нейтральных экзополисахаридов (ЭПС) (Пирог с соавт., 1985; Матора с соавт., 1992; Hebbar et al., 1992; Lee et al., 1997; Jung et al., 2007), обладающих рядом уникальных свойств, что объясняет разнообразие сфер возможного применения данных полимеров. Наряду с этим, экзогликанам P. polymyxa отводится важная роль в формировании растительно-микробных ассоциаций (Hebbar et al., 1992; Bezzate et al, 2000; Timmusk et al, 2005; Haggag, 2007). P. polymyxa широко используются как основные компоненты комплексных бактериальных удобрений, что приводит к обогащению окружающей среды выделяемыми полисахаридами, эффект действия которых на организм человека и животных до сих пор не вполне ясен.
Поверхностная локализация внеклеточных полисахаридов (ВПС) придает им свойства посредников во взаимодействии P. polymyxa с другими микро- и макроорганизмами. Кроме того, образуя на поверхности бактерий плотный слой, ЭПС могут экранировать расположенные под ними другие клеточные структуры и определять иммунологические свойства бактерий (Васильев с соавт., 1984). Исследованиями ряда ученых (Ермольева и Вайсберг, 1976; Розе с соавт., 1990; Jung et al, 2007; Chang et al, 2009; 2010) показано, что ЭПС P. polymyxa представляют собой биологически активные вещества (БАВ), обладающие иммунотропным действием.
Несмотря на интенсивные исследования данных бактериальных полисахаридов (ПС) и значительные успехи в выяснении их физиологической роли, остаются до конца не выясненными свойства и химическая структура большого спектра ЭПС. Всестороннее изучение данных биополимеров позволит выявить функциональные связи между строением экзогликанов и их биологической ролью, что может способствовать более полному и глубокому
пониманию молекулярных основ межклеточных, межвидовых и межорганизменных взаимодействий. Это свидетельствует о несомненной актуальности работ, направленных на изучение внеклеточных полисахаридов бактерий вида P. polymyxa.
В этой связи, цель данной работы состояла в выявлении особенностей состава и свойств экзогликанов ряда штаммов P. polymyxa и оценке их роли во взаимодействии с корнями пшеницы.
Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
Провести сравнительное исследование продукции внеклеточных полисахаридов рядом штаммов P. polymyxa.
Выделить суммарные препараты ЭПС бактерий P. polymyxa и провести анализ их химического состава.
Провести качественную и количественную оценку способности бактерий P. polymyxa к колонизации корней проростков пшеницы.
Оценить способность к формированию биопленок ряда штаммов Р. polymyxa, отличающихся по выходу и реологическим свойствам ЭПС.
Исследовать активность препаратов ЭПС P. polymyxa в отношении эукариотических клеток: растительных, иммунной системы животных и цельной крови человека.
Научная новизна работы. Установлено, что штамм P. polymyxa 1465, характеризующийся наибольшим выходом ЭПС, более высокими значениями кинематической вязкости культуральной жидкости и водных растворов ЭПС, оказался более активным в процессах колонизации корней проростков пшеницы, индукции деформации корневых волосков, а также при формировании биопленок на абиотических поверхностях.
Впервые обнаружена способность ЭПС P. polymyxa вызывать различные морфологические изменения корневых волосков проростков пшеницы, являющиеся одним из наиболее ранних откликов растения на присутствие в окружающей среде бактерий.
Впервые показана перспективность применения твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антител (Ат) на ЭПС для количественной оценки колонизации ризобактериями P. polymyxa корней пшеницы, что может найти применение при тестировании природных изолятов бактерий.
Установлено, что ЭПС P. polymyxa 1465 способны к активации иммунных клеток. Показано, что данные экзогликаны in vitro стимулируют фагоцитоз бактериальных клеток и метаболические процессы в лейкоцитах мышей и человека. Показано умеренное стимулирующее влияние исследуемых ЭПС на продукцию ведущих провоспалительных цитокинов ИЛ-ір и ФНО-а фагоцитирующими мононуклеарами человека.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют представления о составе и свойствах экзогликанов бактерий P. polymyxa, способствуют пониманию роли ЭПС в формировании растительно-бактериальных взаимодействий.
Препараты ЭПС штаммов P. polymyxa, полученные в ходе исследований, применяются в экспериментальной деятельности сотрудниками лаборатории биохимии, иммунохимии ИБФРМ РАН, а также кафедры биохимии и биофизики СГУ.
Выявленная биологическая активность ЭПС P. polymyxa 1465 в отношении иммунных клеток позволяет прогнозировать возможность использования культур P. polymyxa с целью получения гликополимеров, обладающих иммунотропным действием.
Полученные антитела на ЭПС P. polymyxa могут быть использованы в экологических исследованиях при тестировании природных изолятов бактерий данного вида.
Результаты диссертационной работы использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами биологического факультета СГУ и в преподавании студентам биологического и химического факультетов СГУ курсов: «Основы гликологии» и «Химия и биохимия углеводов».
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Экзополисахариды P. polymyxa 1460, 1465, 92 являются гетерополисахаридами, содержащими глюкозу, маннозу, галактозу, уроновые кислоты и аминосахариды. ЭПС P. polymyxa 1465 - нерегулярный по структуре, разветвленный гликополимер, основная цепь которого образована (1—>4)- и (1—>6)- связанными остатками гексоз в пиранозной форме.
Внеклеточные полисахариды P. polymyxa играют существенную роль в процессах колонизации корней, деформации корневых волосков и при формировании биопленок на абиотических поверхностях.
Твердофазный ИФА с использованием антител, полученных на ЭПС Р. polymyxa, может применяться для количественной оценки колонизации данными ризобактериями корней пшеницы.
Экзогликаны ризобактерий P. polymyxa 1465 in vitro стимулируют фагоцитоз бактериальных клеток макрофагами, активируют метаболические процессы в лейкоцитах человека и животных и умеренно воздействуют на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарами человека.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на следующих научных форумах: 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2006 г.); 3-ей и 4-ой Межрегиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2006, 2008 гг.); Международной школе-конференции молодых ученых «Applied and fundamental aspects of responses, signaling and developmental process in the root-microbe systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2007 г.); Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Modern problems of Microbiology and biotechnology» (Одеса, Украина, 2007 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем», (Саратов, Россия, 2007 г.); Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, Беларусь, 2008 г.);
отчетной конференции ИБФРМ РАН (Саратов, Россия, 2008 г.); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, Россия, 2009 г); Научно-практической конференции «Biologically active substances: Fundamental and Applied Problems» (Новый Свет, Крым, Украина, 2009 г.); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2009» (Саратов, Россия, 2009 г.); П-ом Международном конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, Россия, 2009 г.).
Работа выполнена в лаборатории биохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов (ИБФРМ) РАН в соответствии с плановыми темами: «Структуры гликополимеров и их функции в растительно-микробных взаимодействиях» (№ гос. per. 0120.0403358, научный руководитель - зав. лаб. засл. деятель науки РФ, д.б.н. проф. Игнатов В.В.) и «Структурно-функциональные особенности поверхностных гликополимеров ризобактерий» (№ гос. per. 1200712165, научный руководитель - зав. лаб. засл. деятель науки РФ, д.б.н. проф. Игнатов В.В.).
Личный вклад соискателя. Представленные экспериментальные результаты получены лично автором и в совместной работе с сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии и биофизики ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского». Моносахаридный состав ЭПС исследован совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (г. Москва) и лаборатории физико-химических методов исследования ИБФРМ РАН. Иммунохимические исследования ЭПС выполнены совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН. Исследования активности экзополисахаридов Р. роїутуха в отношении индукции факторов неспецифической резистентности макроорганизма проведены совместно с сотрудниками кафедры биохимии и биофизики СГУ. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 работ в отечественных и зарубежных изданиях, из них 2 статьи в журналах из перечня, рекомендованного Высшей аттестационной комиссией Российской Федерации, и восемь статей в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 262 источника, в том числе 169 зарубежных. Работа изложена на 131 странице, содержит 24 рисунка и 9 таблиц.
Механизмы стимулирующего воздействия на растения
Р. роїутуха широко распространены в различных климатических зонах, они встречаются в черноземных, каштановых, сероземных, красноземных, дерново-подзолистых почвах. В большом количестве эти бактерии найдены в ризосфере пшеницы и ячменя, сорго и кукурузы, сахарной свеклы, белого клевера, многолетнего райграса, сосны, ели, зеленых бобов и чеснока (Мальцева с соавт., 1992; Holl et al, 1988; Mavingui et al, 1992; Timmusk et al, 2005). В зоне корня пшеницы данные бактерии могут преобладать в количественном соотношении над другими азотфиксирующими анаэробами, им принадлежит одна из ведущих ролей в накоплении азота в почвах (Dobereiner, 1977).
Р. роїутуха относят к группе ростстимулирующих ризобактерий (PGPR) (Timmusk and Wagner, 1999; Haggag, 2007). Достаточно широко представлены результаты многочисленных экспериментов, связанных с изучением влияния инокуляции бактерий P. polymyxa на урожай основных зерновых культур: пшеницы, ячменя, риса, сорго, проса, кукурузы (Chanway, 1995; Maes and Baeyen, 2003; Скворцова с соавт., 1998). В камерах роста изучался урожай и ассимиляция азота озимой пшеницы, инокулированной различными ризобактериями. Показано, что инокуляция бактериями P. polymyxa способствовала повышению урожая зерна (Renato de Freitas, 2000). Существенное влияние на рост и урожай пшеницы и маиса было обнаружено при определенной комбинации растение-бактерии и отсутствовало при другой, демонстрируя взаимосвязь между генотипом растения и бактериальным штаммом (Renni and Thomas, 1987; Chanway et al, 1988; da Mota et al, 2002). Наибольшее накопление азота отмечалось в варианте с инокуляцией пшеницы P. polymyxa, изолированными из ризосферы данного культивара пшеницы (Renni and Thomas, 1987). В экспериментах ряда авторов замечен значительный положительный эффект при добавлении в ризосферу растений штаммов P. polymyxa, рассматривались такие параметры как его жизнеспособность, вес, концентрация хлорофилла в мезофилле листа, состояние корня, формирование корневых волосков. В случае обработки семян, отмечена лучшая прорастаемость, более быстрый рост рассады (Maes and Baeyen, 2003).
Несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению взаимодействия растений с ассоциированными азотфиксирующими и ростстимулирующими бактериями, до сих пор не удается надежно прогнозировать реакцию растений на инокуляцию, которая может варьировать от положительной или нейтральной до отрицательной (Kloepper et al, 1989; Майорова с соавт., 1996). Сообщалось, что в ряде модельных экспериментов инокуляция Arabidopsis thaliana бактериями P. polymyxa приводила даже к 30 % снижению роста растения и корневой системы по сравнению с неинокулированными растениями (Timmusk and Wagner, 1999; Timmusk et al, 2003). Таким образом, отмечался умеренный патогенный эффект, и, по мнению авторов, при этих условиях P. polymyxa можно было рассматривать как вредные бактерии.
Проблема непоследовательности результатов инокуляции P. polymyxa послужила толчком для появления новых исследований, связанных с использованием совместной инокуляции бацилл с другими микроорганизмами. Комбинированная инокуляция растений ассоциативными бактериями разных родов - одна из наиболее передовых технологий в сельском хозяйстве. На примере злаковых трав изучали влияние инокуляции смешанными (двухкомпонентными) культурами, состоящими из В. polymyxa и различных штаммов бактерий рода Pseudomonas, на азотфиксацию, денитрификацию и гетеротрофную нитрификацию. Показано, что инокуляции смешанными культурами не только существенно повышала урожай, но и достоверно увеличивала содержание азота в нем. Так, прибавка урожая составила до 25-77 % (Скворцова с соавт., 1998). Отмечалось позитивное влияние комбинированной инокуляции (Azospirillum brasilense, Azotobacter chroococcum, Bacillus polymyxa, Enterobacter cloacae) на урожай, сухой вес и общий азот озимой пшеницы (Renato de Freitas, 2000), а инокуляция P. polymyxa индивидуально или совместно с Rhizobiwn увеличивала рост чечевицы и защищала растение от нематод Meloidogyne javanica (Siddiquie/tf/.,2007).
Долгое время полезное действие ассоциативных ризосферных бактерий в основном связывали с фиксацией молекулярного азота, проводя параллель с симбиотической азотфиксацией. Однако у этих бактерий азотфиксация вносит лишь частичный вклад в стимуляцию роста растений (Chanway and Holl, 1991). Кроме улучшения азотного питания, эти бактерии обладают и другими механизмами положительного воздействия на растение (Costacurta and Vanderleyden, 1995). Некоторые ассоциативные азотфиксирующие микроорганизмы синтезируют ауксины, гиббереллины, цитокинины (Budi et ah, 2000). По данным некоторых авторов, у Р. polymyxa была отмечена продукция гормонов цитокининовой группы (Timmusk et al, 1999). Цитокинины играют ключевую роль в росте и развитии - они стимулируют прорастание семян, формирование почек, развитие листьев и репродуктивную активность, задерживают старение (Мок, 1994). В растениях и растительно-микробных ассоциациях содержится около тридцати ростстимулирующих соединений группы цитокининов в очень низких концентрациях. Было показано, что ризобактерии P. polymyxa способны продуцировать и ауксины, в частности, индолилуксусную кислоту (ИУК) (Lebuhn et al, 1997; Bent et al., 2001). Обработка ауксинами приводила к ускорению процесса колонизации корней бактериями и стимуляции образования паранодул (Narula et al., 2006).
Механизм стимулирующего влияния бактерий P. polymyxa на растения до сих пор не вполне ясен. Считают, что эффективность ассоциаций с растениями определяется такими характеристиками бактерий, как способность к азотфиксации (Grau and Wilson, 1962;Lindberge/or/., 1985), продукция фитогормонов (Holl et al, 1988; Lebuhn et al, 1997; Timmusk et al, 1999; Архипова, 1999) и антибиотиков (Rosado et al, 1993), гидролитических ферментов (Nielsen and Sorensen, 1997), экзополисахаридов (Hebbar et al, 1992; Bezzate et al., 2000; Timmuck et al, 2005; Haggag, 2007), а также улучшение минерального питания и водного баланса инокулированных растений за счет фосфатмобилизации (Singh and Sing, 1993) и улучшения структуры почвы (Bezzate et al, 2000; Czames et al, 2000). Опытным путем доказано, что P. polymyxa может увеличить сопротивляемость растительного организма против биотических и абиотических стрессов (Timmusk and Wagner, 1999; Khan and Kim, 2003; McSpadden, 2004; Timmusk et al., 2005).
Значимость вышеназванных механизмов воздействия P. polymyxa на растения неодинакова в различных условиях, причем, помимо климатических, большое значение имеют такие факторы, как видовая и штаммовая характеристики используемых бактерий, а также видовые и сортовые особенности растений. Полагают, что ростстимулирующие факторы необходимо рассматривать в совокупности, поскольку попытка выделения какого-либо одного может привести к существенному занижению практической оценки действия каждого из них (Bashan andHolguin, 1997).
Иммунотропные свойства ЭПС
Интерес к иммуностимулирующей терапии, имеющей длительную историю, резко возрос в последние годы и связан с проблемами инфекционной патологии и онкологии. Течение инфекционного процесса осложняется, а трудности терапии существенно усугубляются при поражении иммунной системы и механизмов неспецифической защиты. Эти нарушения могут быть генетически обусловлены или же возникают вторично под влиянием разнообразных факторов. Поэтому в настоящее время актуален поиск нетоксичных и доступных биополимеров, обладающих иммунотропным действием.
Бактериальные экзополисахариды представляют группу очень перспективных стимуляторов защитных сил организма, повышающих его устойчивость ко многим бактериальным и вирусным инфекциям, а также к лучевым воздействиям (Ермольева и Вайсберг, 1976). Большинство биологически активных ПС являются линейными или разветвленными р-1,3-Б-глюканами, гетероглюканами или комплексами 0-D-глюкана с белками (Щерба и Бабицкая, 2008). 1— 3; 1— 6- P-D-глюканы являются полифункциональными веществами. Они присутствуют в клеточных стенках многих растений (Lee et al, 2006), водорослей и грибов (Ross et al, 1999; Игнатенко, 1994; Щерба и Бабицкая, 2008), продуцируются рядом бактерий в виде экзополисахаридов (Nakanishi et al, 1976; Sandula et al, 1999; Arena et al, 2006). В основе биологической активности pVD-глюканов лежат, прежде всего, их иммуностимулирующие свойства, хотя радиопротекторное действие может быть обусловлено способностью ПС связывать свободные радикалы, противоопухолевое - появлением регрессирующего опухоль фактора в ответ на введение глюкана, противовоспалительное действие -появлением в сыворотке крови фактора, стимулирующего продукцию транспортных белков острой фазы (Беседнова с соавт., 2000). Свойства P-D-глюканов, полученных из дрожжей, представлены в работах (Аркадьева, 1974; Кашкина, 1974; Блинов, 1982). Именно школе Н.П. Блинова принадлежат приоритетные исследования иммуномодулирующих, противоопухолевых и радиозащитных свойств р-маннанов и Р-глюканов из дрожжей. Большое число работ посвящено изучению зимозана — сложного полимера полисахаридной природы, выделенного из оболочки дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Басс-Шадхан, 1970). В 1969 г. зимозан был рекомендован Фармакологическим комитетом МЗ СССР для широкого клинического применения в качестве неспецифического стимулятора реактивности организма. Действующим началом зимозана является 1— 3; 1— 6-Р-0-глюкан. Установлено, что зимозан и его активные компоненты - глюканы Р и F повышают резистентность экспериментальных животных к индуцированным бактериальным, вирусным и паразитарным инфекциям. Установлено благоприятное влияние глюкана Р на течение пневмококкового сепсиса, который обеспечивал защиту 91 % животных против 19 % выживших в контроле (Беседнова с соавт., 2000). Из бактериальных полисахаридов в медицине в настоящее время широко применяются сальмозан, пирогенал и продигиозан.
Активация иммунной системы Р-1,3-0-глюканами неспецифическая, что позволяет использовать их как в профилактических целях, так и в качестве вспомогательных лекарственных средств при различных заболеваниях, сопровождающихся общим снижением иммунитета (Щерба и Бабицкая, 2008). Степень активации иммунной системы, специфическое воздействие на те или иные ее элементы зависят от состава и структуры вводимого в организм глюкана. Определяющую роль во взаимодействии таких полисахаридов с элементами иммунной системы играет конформация молекулы в момент воздействия. Биологическая активность глюканов зависит и от многих других факторов: типа и конфигурации связей между составляющими остатками Сахаров, степени разветвленности боковых цепей биополимеров, молекулярной массы полисахаридов, растворимости в воде и т.д. (Блинов, 1982; Беседнова с соавт., 2000; Williams et al, 1982; Cleary et al, 1999; Falch et al., 2000; Leung et al, 2006).
Так, линейные I— 3-Р-Б-глюканы (например, курдлан) являются эффективными в отношении стимуляции цитотоксичности полиморфноядерных лейкоцитов in vitro. В то же время такие I—З-р-О-глюканы, как лентинан, шизофиллан, имеющие помимо Р-1— 3 связей р-1— 6 связанные остатки глюкозы в виде боковых цепей, не обладают такой активностью; то же относится и к дрожжевым глюканам. В других случаях наибольшее проявление биологической активности p-D-глюканов связано с оптимальным содержанием (чаще всего 20-30 %) р-1— 6-связанных остатков глюкозы в молекулах p-D-глюканов (Звягинцева, 1996). Присутствие и содержание Р-1— 6 35 связей определяет пространственную структуру p-D-глюканов, которая напрямую связана с проявлением биологического действия этих полисахаридов (Звягинцева, 1996, Беседнова с соавт., 2000).
Неспецифическая резистентность организма включает ряд тканевых и гуморальных реакций, определяющих степень сопротивляемости к разнообразным повреждающим воздействиям. Установлено что некоторые бактериальные полисахариды отличаются выраженной способностью влиять на иммунобиологическую реактивность организма. Они вызывают многокомпонентную защитную реакцию организма, обусловливая изменение уровня сопротивляемости (Ермольева и Вайсберг, 1976).
В целом можно отметить, что активация иммунной системы Р-1,3-В-глюканами проявляется следующими феноменами:
Гуморальные факторы: возрастает уровень иммуноглобулинов (IgM и IgG), интерлейкинов 1 и 2, интерферона, активатора плазминогена, Н202, опсонинов, колониестимулирующего фактора, фактора некроза опухоли, белков плазмы, в том числе белков острой фазы (комплемента СЗ, церулоплазмина, гомопексина и т.д.); возрастает включение глюкозамина (до 10 раз), потребление глюкозы клетками; происходит ингибирование иммуносупрессивных веществ, простагландинов.
Клеточные факторы: усиление фагоцитоза; увеличение цитотоксичности макрофагов, ингибирование миграции макрофагов, пролиферация (спонтанная, в присутствии митогенов); активация нормальных киллеров (NK), Т-киллеров, Т-хелперов; РГЗТ (реакция гиперчувствительности замедленного типа); РТПХ (реакция "трансплантант против хозяина"); митостатическое действие (лимфотоксический эффект); образование лимфоцитами розеток с эритроцитами барана; увеличение числа антителообразующих клеток; стимуляция эндо- или экзогенного колониеобразования в костном мозге или в селезенке; эффект кооперации Т- и В-лимфоцитов; увеличение лимфоузлов и других кроветворных органов; увеличение числа выживших животных (выживаемость - интегральный показатель, обусловленный сочетанием всех факторов) (Беседнова с соавт., 2000).
Сообщалось о продукции ЭПС с характерными иммуномодулирующими свойствами штаммами: Bacillus spp. (Gummadi and Kumar 2005), Bacillus licheniformis (Arena et al., 2006), Paenibacillus jamilae CP-7 (Ruiz-Bravo et al, 2001). При внутрибрюшинном введении мышам ЭПС P. jamilae СР-7 продемонстрировал низкий уровень острой токсичности. Данный ПС индуцировал синтез цитокинов и пролиферацию спленоцитов in vitro, а при его воздействии на Т- и В-клетки, стимулированные классическими митогенами, цитокиновые и пролиферативные ответы подавлялись (Ruiz-Bravo et al, 2001). Исследованиями ряда ученых показано, что ЭПС, синтезируемые бактериями Р. polymyxa, обладают антивирусными и противоопухолевыми свойствами, оказывают профилактическое действие при экспериментальной стафилококковой инфекции и пролонгируют действие лекарственных веществ, повышая неспецифическую реактивность организма (Афонская и Колесова, 1980; Пирог с соавт., 1985; Розе с соавт., 1990). К примеру, линейный глюкан, имеющий Р-(1— 3)- и р-(1— 6)-структуру, продуцируемый почвенными бактериями P. polymyxa JB115, предлагают использовать как пищевую добавку для животных с целью повышения иммунитета (Jung et al, 2007). Были проведены исследования влияния активации мышиных спленоцитов данным ЭПС на продукцию NO (Chang et al., 2009). Известно, что эндогенная окись азота — важнейший фактор неспецифической резистентности макроорганизма при внутриклеточных инфекциях. Установлено, что индукция синтеза NO под действием Р-глюкана носила концентрационно-зависимый характер. Кроме того, отмечено сходное стимулирующее влияние данного ПС на продукцию интерлейкина-6 (ИЛ-6) и индуцибельной NO-синтазы (iNOS), которая может играть ключевую роль в синтезе NO (Chang et al, 2009). Авторы указывают, что P-glucan P. polymyxa JB115 активизирует макрофаги через МАПК и NF-kB сигнальный путь (Chang et al, 2010). Авторы предлагают использовать Р-глюкан P. polymyxa JB115 как иммуностимулятор или как адъювант некоторых вакцин для животных (Chang et al, 2009). По литературным данным, микробные полисахариды являются активными стимуляторами антителогенеза. Механизм их адыовантного действия обусловливается общим комплексом реакций, возникающих в организме при парентеральном введении ПС: усиленной пролиферацией иммунокомпетентных клеток, стимуляцией синтеза иммуноглобулинов, изменениями проницаемости сосудов и т.д. (Ермольева и Вайсберг, 1976).
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что, несмотря на значительный прогресс в изучении экзополисахаридов ризобактерий P. polymyxa и выяснении их физиологической роли, остается много вопросов, касающихся химической структуры и свойств ЭПС, а также степени участия данных экзогликанов в формировании растительно-микробных ассоциаций и межорганизменных взаимодействий, что и определяет актуальность исследований в данном направлении.
Выделение, очистка и исследование химического состава экзополисахаридов бактерий P. polymyxa
Выделение ЭПС проводили в соответствии с общей схемой, представленной на рис. 1. Для получения суммарных препаратов ЭПС КЖ после выращивания бактерий на средах с 3 % глюкозы или сахарозы разбавляли в 2-3 раза дистиллированной водой (для снижения вязкости). Клетки отделяли центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 мин, супернатант концентрировали в вакууме (40 С) до первоначального объема, используя роторный испаритель, после чего ЭПС осаждали тремя объемами ацетона. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, многократно промывали ацетоном, лиофильно высушивали и анализировали.
Гель-хроматографию образцов проводили на колонке (47x1.0 см) с Sepharose CL-4В, в качестве элюента применяли раствор бикарбоната аммония (0.025М, рН 8.3). Исследовали препараты ЭПС (ЭПСГл), полученные при культивировании штаммов Р. polymyxa в течение 4 суток на жидкой питательной среде с 3 % глюкозы. Посредством гель-хроматографии на колонке, калиброванной по декстранам, установлено, что исследуемые препараты представлены смесью ПС с Ммот7 104 до 2хЮ6 Да, а для штаммов 1465 и 92 установлено значительное доминирование в ЭПС высокомолекулярных фракций (Мм 5х105-2х106 Да) (рис. 8А). На хроматограмме присутствовали небольшие пики, соответствующие фракциям с Мм 100-200 кД (пик 2) и 20-70 кД (пик 3). Профили элюции имели сходный вид для ЭПС штаммов 1465 и 92. ЭПС штамма P. polymyxa 1460, напротив, характеризовался преобладанием низкомолекулярных фракций (рис. 8Б).
Ионообменная хроматография суммарных препаратов ЭПС на колонке с DEAEoyopearl 650М (35x1.5 см) выявила их гетерогенность по заряду. При помощи ионообменной хроматографии полисахарид-содержащие полимеры были разделены на фракции, различающиеся по плотности отрицательного заряда и обозначенные как нейтральная и кислая. Нейтральные и слабокислые компоненты элюировали буфером Трис-НС1 (0.01 М, рН 7.2), кислые компоненты - раствором NaCl в том же буфере при непрерывном градиенте концентрации 0.01 М -1.0 М. Как следует из представленных на рисунке 9А, Б данных (темная кривая), для штаммов 1465 и 92 суммарные препараты ЭПСрл состояли из минорной (нейтральной) и основной (кислой) фракций. При замене источника углерода на сахарозу синтезируемый ЭПС (ЭПССАХ) характеризовался значительным преобладанием нейтральной фракции (светлая кривая), а 0.1 % водные растворы ЭПС, как было показано ранее, при этом имели более низкую вязкость в сравнении с образцами, полученными при выращивании бактерий на среде с глюкозой. Возрастанием в суммарных препаратах ЭПС доли нейтральной фракции, характеризующейся меньшей молекулярной массой и вязкостью, и объяснялось столь существенное снижение кинематической вязкости растворов ЭПС исследуемых бактерий. Как видно на рисунке 9В, в препаратах ЭПС штамма 1460 практически отсутствовала кислая фракция при культивировании бактерий на среде с глюкозой (темная кривая), что отличало данный штамм от других, протестированных нами. И как было показано ранее, штамм 1460 характеризовался низким выходом ЭПС и низкой (на уровне контроля) кинематической вязкостью растворов ЭПС.
Данные, полученные в результате электрофоретического разделения исследуемых ЭПС методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия, подтвердили их гетерогенную природу (рис. 10). Препараты ЭПС, синтезируемые бактериями при выращивании как на сахарозе (трек 1), так и на глюкозе (трек 2), представлены весьма широким диапазоном молекул различных размеров. Препараты ЭПС при выращивании штамма 1465 на разных источниках углерода имели сходный электрофоретический профиль, характерный для ПС-содержащих полимеров. Однако обнаруживались и отличия, которые, очевидно, являлись следствием разного соотношения в тестируемых ЭПС молекул с определенным размером и электрофоретической подвижностью. Так, в верхней части фореграммы ЭПССАх присутствовали две четко выраженные полосы, что говорит о доминировании в препарате наименее подвижных молекул. ЭПСрл характеризовался преобладанием молекул с большей подвижностью в электрическом поле, которые представлены интенсивной полосой в средней части электрофореграммы. Таким образом, ЭПС исследуемых штаммов P. polymyxa представляют комплекс нескольких полисахаридов, что хорошо согласуется с имеющимися литературными данными по другим штаммам P. polymyxa (Пирог с соавт., 1985; Глухова с соавт., 1986; Ткаченко и Севрюгина, 1989; Матора с соавт., 1992).
Колориметрическими методами установлено, что на долю углеводов в ЭПС исследуемых штаммов P. polymyxa приходилось 72-75 %, белков - 1.6-2.2 % от массы препарата.
Исследование моносахаридного состава лиофилизованных суммарных препаратов ЭПС P. polymyxa проводили методами тонкослойной и газо-жидкостной хроматографии. Методом ГЖХ ацетатов полиолов после полного кислотного гидролиза ЗПСі4б5 показано преобладание в них Man, Glc, Gal в соотношении приблизительно 2:2.5:1 (рис. ПА). Методами тонкослойной хроматографии и колориметрического определения уроновых кислот по Дише установлено наличие в образцах уроновых кислот в количестве 10-12 % от массы препарата. По данным, полученным с использованием тонкослойной хроматографии и аминокислотного анализатора, в состав исследуемых комплексов входит также галактозамин. Анализ литературных данных, касающихся моносахаридного состава ЭПС P. polymyxa, демонстрирует существенную его зависимость не только от индивидуальных особенностей культур, но и от условий культивирования (например, состава питательных сред). Подтверждением этого является отмеченное нами изменение соотношения моносахаридов в ЗПСі4б5 синтезируемых на среде с сахарозой, которые также как и ЭПСГЛ содержали в своем составе в качестве основных компонентов остатки Man, Glc, Gal, но в соотношении 10:16:1, и незначительное количество уроновых кислот.
В ЭПС92 преобладали Man, Glc, Gal в соотношении 2.5:4:1 (рис. 11Б), были выявлены также галактозамин, следовые количества Fuc и уроновые кислоты. В ЭПС14бо идентифицированы остатки углеводов Man, Glc, Gal в соотношении 9:13:1, а также следовые количества Fuc и ксилозы (рис. 11В). В целом полученные результаты анализа химического состава ЭПС хорошо согласуются с литературными данными по другим штаммам P. polymyxa (Ninomiya et al. 1968; Mitsuda et al, 1981; Hebbar et al., 1992; Глухова с соавт., 1986a).
При расшифровке структуры ЭПС, синтезируемых бактериями P. polymyxa, мы использовали инфракрасную (ИК) спектроскопию. ИК спектроскопия широко применяется для определения структуры молекул ПС, она позволяет выявить определенные функциональные группы, их взаимное расположение, определить типы связей, установить идентичность соединений. И хотя полисахариды являются одним из самых трудных объектов изучения, были достигнуты определенные успехи в изучении этой группы углеводов методом РІК спектроскопии (Гвоздяк с соавт., 1989; Усов, 2001).
Спектры ЗПСі4б5, ЭПС92 и ЭПСнбо обнаружили большое сходство между собой. В качестве примера на рис. 12 представлены ИК-спектры препаратов ЭПС1465, синтезируемых на средах с глюкозой и сахарозой, снятые в таблетках с КВг. На ИК-спектрах обоих препаратов присутствуют полосы поглощения, характерные для полисахаридов - это широкие полосы гликозидной связи v(C-O-C) в областях частот 1060-1080 см"1; отмечено наличие полос поглощения, вызванных колебаниями шестичленного кислородсодержащего пиранозного кольца. В области 3700-3100 см"1 в ИК-спектрах наблюдали довольно интенсивные полосы поглощения с большой широтой и недостаточной четкостью, что характерно для валентных колебаний групп -ОН. Максимумы поглощения на ИК-спектрах свидетельствуют также о наличии в молекулах ЭПС аминогрупп, групп СН, СНг. Полоса поглощения в области 1740 см"1, соответствующая колебаниям С=0-групп в составе кислот, сложных эфиров, по-видимому, может свидетельствовать о присутствии в препаратах уроновых кислот, наличие которых в ЭПС подтверждено и другими методами.
ИК-спектры поглощения препаратов ЭПС, синтезируемых на средах с глюкозой и сахарозой, несмотря на большое сходство по общему профилю и положению основных характеристических полос, имели и некоторые различия, что свидетельствует о специфических особенностях в структуре их ЭПС (рис. 12 А, Б). Область спектра 700-1000 см"1 характеризуется наличием полос поглощения слабой и средней интенсивности. В этом интервале лежат полосы поглощения Сахаров, связанные с их стереохимическими особенностями (Щербухин, 1968). Именно в ней наиболее четко видны структурные различия полисахаридов (Щерба и Бабицкая, 2008).
Так, в спектрах ЭПССдх- бактерий P. polymyxa 1465, 1460, 92 присутствуют полосы поглощения в области 920 см"1, что, согласно литературным источникам (Щербухин, 1968; Щерба и Бабицкая, 2008), характерно для а- гликозидной связи (рис. 12Б). Полосы поглощения в области 885-890 см 1 выражены интенсивнее в спектрах ЭПСгл» что может свидетельствовать о присутствии р-гликозидных связей (рис. 12А).
Исследование активности экзополисахаридов P. polymyxa в отношении индукции факторов неспецифической резистентности макроорганизма
Бактериальные экзополисахариды представляют группу очень перспективных стимуляторов защитных сил организма, повышающих его устойчивость ко многим бактериальным и вирусным инфекциям, а также к лучевым воздействиям. Они разнообразны по структуре и физико-химическим свойствам и в большинстве своем малотоксичны или нетоксичны. К примеру, ЭПС P. jamilae СР-7 показал низкий уровень острой токсичности при внутрибрюшинном введении мышам (Ruiz-Bravo et al, 2001). Для ЭПС штамма P. polymyxa 88А приведены данные, свидетельствующие о низкой токсичности данного препарата (Бухарова, 2004). Исследованиями ряда ученых показано, что ЭПС, синтезируемые бактериями P. polymyxa, обладают антивирусными и противоопухолевыми свойствами, оказывают профилактическое действие при экспериментальной стафилококковой инфекции и пролонгируют действие лекарственных веществ, повышая неспецифическую реактивность организма (Афонская и Колесова, 1980; Пирог с соавт., 1985; Розе с соавт., 1990).
В данном разделе работы мы исследовали активность гликополимеров ризобактерий P. polymyxa 1465 по отношению к клеткам иммунной системы, обеспечивающей адаптацию организма к внешним воздействиям. Влияние экзогликанов Р. роїутуха на активность и завершенность процесса фагоцитоза.
Активность ЭПС в отношении иммунной системы исследовали на модели фагоцитоза бактерий, одного из главных и ранних механизмов естественного иммунитета. Фагоцитоз является первоочередной функцией макрофагов, по способности к реализации данной функции судят об их активности (Апринян с соавт., 2001). В ходе фагоцитоза реализуется сложный комплекс защитно-приспособительных механизмов, которые включают не только цитотоксическое или бактерицидное действие, но и продукцию и секрецию медиаторов воспаления, активацию энергетического метаболизма фагоцитов, процессинг антигенов и их представление лимфоцитам (Рудик и Тихомирова, 2006). Экспериментально показана определенная корреляция данных о стимуляции фагоцитоза с данными о повышении устойчивости организма к ряду патогенных воздействий (Ермольева и Вайсберг, 1976). Отмечалось, что введение 1— 3; 1— 6- p-D-глюкана транслама вызывало значительное усиление поглотительной и переваривающей активности макрофагов интактных и облученных животных по отношению как к грамотрицательным, так и грамположительным микроорганизмам (Беседнова с соавт., 2000).
Перитонеальные макрофаги выделяли из организма мышей по общепринятой методике и использовали для моделирования процесса фагоцитоза в течение 1, 2, 4, 6 и 24 ч. Для моделирования процесса фагоцитоза в качестве объекта фагоцитоза использовали суточную культуру клинического штамма бактерий Е. coli Са53.
Установлено, что внесение ЭПСнбб в концентрации 1 мкг/мл в культуру ПМФ перед началом фагоцитоза приводило к увеличению количества активированных макрофагов по сравнению с контролем (табл. 3).
ФИ на всех этапах фагоцитоза Е. coli были выше по сравнению с контролем на 17-30 %. До 4 ч процесса фагоцитоза ЭПССАХ показал максимальный активирующий эффект, который был выше, чем у ЭПСгл и продигиозана, использованного в качестве положительного контроля. Иммуномодулирующие свойства продигиозана связывают именно с воздействием на фагоцитарную активность макрофагов (Ермольева и Вайсберг, 1976). Отмечено сильное стимулирующее действие ЭПСГЛ на фагоцитоз эшерихий к 6 ч процесса, однако индексы завершенности фагоцитоза имели отрицательные значения при добавлении к макрофагам ЭПСиб5 в отличие от контроля и продигиозана. ИЗФ для ЭПСнб5гл и ЗПСі4б5сах составили: -0.14 и -0.04 соответственно. Полученные данные характеризуют процесс фагоцитоза Е. coli Са53 как незавершенный, что свидетельствует о том, что ЭПС]465 не влияют на механизмы киллинга бактерий.
Функционально-метаболическое состояние лейкоцитов человека и животных под воздействием биогликанов in vitro.
Киллинг микроорганизмов, поглощенных как нейтрофилами, так и моноцитами макрофагами, осуществляется посредством кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов. В первом случае происходит окисление кислорода НАДФН-оксидазной системой, в результате чего образуются активные формы кислорода, обладающие сильным микробоцидным действием («респираторный [кислородный] взрыв») (Ярилин, 2000). Во втором случае гибель и разрушение микроба происходит под влиянием кислой реакции среды фаголизосомы, гидролитических ферментов и большого числа микробоцидных белков и пептидов.
Среди последних в настоящее время особое значение придается дефензинам аргининбогатым белкам, которые обладают способностью встраиваться в липидный слой клетки, нарушать ее проницаемость и тем самым убивать широкий спектр бактерий, грибов и даже вирусов (Ройт с соавт. 2000).
Влияние гликополимеров на синтез в лейкоцитах активных форм кислорода.
Оценка уровня продукции АФК является важным показателем при исследовании действия веществ различной природы на макроорганизм. Изучение функциональной активности клеток в продукции АФК проводили на моделях периферической крови человека и макрофагов лабораторных белых мышей, наиболее часто использующихся в подобных экспериментах (Долгушин и Бухарин, 2001). В первой серии экспериментов оценивали влияние ПС-содержащих биополимеров в интервале концентраций 1-1000 мкг/мл на образование АФК клетками цельной периферической крови методом хемилюминесценции. В результате было установлено, что ЭПС Р. polymyxa 1465 не оказывали достоверного влияния на ХЛ-активность клеток периферической крови человека (табл. 4).
Во второй серии экспериментов для оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма мышиных макрофагов использовали спектрофотометрический вариант теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), который дает возможность судить о метаболической активности макрофагов по образованию в цитоплазме нерастворимых синих гранул формазана. Анализ полученных данных показал, что ЗПСі4б5гл и ЗПСі4б5сах не оказывали стимулирующего влияния на продукцию АФК перитонеальными макрофагами (табл. 5).
Напротив, было отмечено ингибирующее действие ЭПС]4б5сах на образование АФК при всех дозах примерно на 15-24 %, что может свидетельствовать об антиоксидантных свойствах исследуемых полисахаридов, причем ингибирующсе действие не носило концентрационно-зависимого характера. Препарат сравнения продигиозан усиливал образование АФК при всех исследуемых концентрациях в 1.2-1.3 раза по сравнению с контролем.
Влияние гликополимеров на активность миелопероксидазы в перитонеальных макрофагах мышей. Миелопероксидаза относится к семейству гемосодержащих пероксидаз млекопитающих, содержится в азурофильных гранулах нейтрофилов, моноцитов и некоторых видах тканевых макрофагов, и секретируется при фагоцитозе внутрь фагосомы. Генерированные этим ферментом активные формы кислорода и свободные радикалы вовлечены в антимикробную активность нейтрофилов, которая обеспечивает врожденный неспецифический иммунитет. Основной функцией МПО в организме является защита от внешней инфекции, однако при ряде условий она может вызывать повреждение собственных тканей организма в очагах воспаления. Как показатель активности нейтрофилов, МПО может служить маркером интенсивности воспалительных процессов (Рулева с соавт., 2007).
Данные по влиянию ЗПСі4б5гл и ЗПСі4б5сах на активность МПО в ПМФ представлены в табл. 6.
Показано, что только ЗПСі4б5гл в максимальной дозе 10 мкг/мл достоверно активировал миелопероксидазу, обеспечивающую альтернативный механизм кислородзависимого киллинга. Продукция оксида азота спленоцитами под воздействием гликополимеров.
Известно, что эндогенная окись азота — важнейший фактор неспецифической резистентности макроорганизма при внутриклеточных инфекциях. Оксид азота индуцируется активированными макрофагами и контролирует репликацию или нейтрализацию внутриклеточных микробных болезнетворных микроорганизмов (Lowenstein et al, 1994). Различными исследованиями показано, что NO - важнейший мессенджер в разнообразных биологических функциях, включая нейронную передачу, регуляцию тонуса кровеносных сосудов, иммуномодулирующее действие и цитотоксичность против опухолевых клеток (Moncada et al, 1991.; Граник, 2002).
Одновременно в очаге воспаления накапливается супероксид, который вызывает повреждение белков и липидов клеточных мембран, что и объясняет его цитотоксическое действие на клетку-мишень. При взаимодействии NO с супероксидом возникает высокоактивный пероксинитрит (Кулинский, 2007). Следовательно, N0, избыточно накапливаясь в клетке, может действовать двояко: с одной стороны вызывать повреждение ДНК и с другой - давать провоспалительный эффект.
Продукцию NO макрофагами селезенки мышей (спленоцитами) определяли методом Грисса по накоплению в инкубационной среде ионов N02 . При исследовании влияния ЗПСІ465ГЛ и ЗПСі4б5сах на образование NO спленоцитами показано, что только препараты ЗПС]465сах в дозе 0,01 мкг/мл достоверно увеличивали синтез данного метаболита (табл. 7), что может свидетельствовать об активации ЭПС микробоцидных процессов внутри клеток.
