Введение к работе
Актуальность проблемы. Работа посвящена характеристике биохимических и биоаналитических аспектов взаимодействия вирусов растений с антителами и их конъюгатами с наночастицами коллоидного золота. Большинство вирусов растений состоит из нуклеиновой кислоты, полностью покрытой упорядоченными копиями белка оболочки. Такая морфология позволяет отнести вирусы растений к поливалентным антигенам с регулярным расположением детерминант. При взаимодействии вирусов со специфическими антителами происходит образование сложных иммунных комплексов, состав которых определяется соотношением реагентов и константами иммунохимической реакции. Возможность поливалентных взаимодействий обусловлена близким расположением идентичных антигенных детерминант на поверхности вирусной частицы и подвижностью Fab-фрагментов иммуноглобулинов.
Определение количественных характеристик реакции поливалентных антигенов с антителами является необходимой основой для описания процессов формирования ими иммунных комплексов разного состава. Вирусы растений - информативный природный материал для изучения поливалентных взаимодействий. В то же время иммунохимическая характеристика вирусов растений создает научную основу для создания высокочувствительных биоаналитических систем их детекции, что имеет большое практическое значение. Для этой цели также необходимо выявление корреляций между свойствами иммунореагентов и физико-химическими характеристиками процессов образования иммунных комплексов вирус-антитело. Эффективным инструментом для такого исследования являются конъюгаты антител и наноразмерных носителей, в первую очередь коллоидного золота, которое благодаря своим уникальным свойствам широко используется в биоаналитических системах.
Используемые сокращения: АСМ - атомно-силовая микроскопия, AT - антитела, БСА -бычий сывороточный альбумин, ВКГ - вирус крапчатости гвоздики, ВТМ - вирус табачной мозаики, ВШС - вирус шарки сливы, ИФА - иммуноферментный анализ, ИХА -иммунохроматографический анализ, МАт - моноклональные антитела, НКЗ -наночастицы коллоидного золота, о.е. - относительная единица, ПАт - поликлонвльные антитела, ПВП - поливинилпирролидон, ППР - поверхностный плазмонный резонанс, ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия, ФБС - 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCI, ФБС-Т - ФБС с добавлением 0,05% Тритона Х-100, IgG -иммуноглобулины класса G, ХВК-Х-вирус картофеля.
Одним из активно развивающихся направлений биоанализа являются иммунохроматографические тест-системы. Экспрессное определение растительных вирусов методом иммунохроматографии на основе коллоидного золота - эффективный подход для выявления различных фитопатологии, что обусловливает актуальность разработки и производства этих тест-систем в России.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение количественных закономерностей взаимодействия вирусов растений с антителами и их конъюгатами с наночастицами коллоидного золота и применение полученных результатов для разработки экспрессных методов иммунохроматографического анализа вирусов растений.
Достижение этой цели включало решение следующих задач:
Исследовать процессы иммобилизации антител на поверхности наночастиц коллоидного золота разного размера.
Изучить количественные закономерности взаимодействия вирусов растений с нативными антителами.
Сравнить количественные характеристики взаимодействия между вирусами и конъюгатами антител с наночастицами коллоидного золота, различающимися по составу.
Изучить влияние состава и свойств иммунореагентов на аналитические характеристики иммунохроматографических тест-систем.
Разработать иммунохроматографические тест-системы для детекции вирусов растений.
Научная новизна. Разработаны экспериментальные подходы для анализа поливалентных иммунохимических взаимодействий с использованием методов иммуноферментного анализа (ИФА), атомно-силовой микроскопии (АСМ), просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), поверхностного плазмонного резонанса (ППР), проточной цитофлуориметрии и динамического светорассеяния. Получены физико-химические характеристики взаимодействия четырех вирусов растений (вирус крапчатости гвоздики (ВКГ), вирус табачной мозаики (ВТМ), Х-вирус картофеля (ХВК), вирус шарки сливы (ВШС)) с поли- и моноклональными антителами и их конъюгатами с коллоидным золотом. Количественно охарактеризованы силы единичного взаимодействия бивалентного антитела с поливалентным вирусным антигеном методом атомно-силовой микроскопии. Получены количественные характеристики взаимодействия между вирусами растений и конъюгатами антител с наночастицами коллоидного золота (НКЗ) разного состава. Экспериментально установлено, что при варьировании размера наночастиц изменение валентности
конъюгата влечет за собой изменение его аффинности. С ростом диаметра НКЗ, входящих в состав конъюгатов, кинетическая константа ассоциации увеличивается, а кинетическая константа диссоциации уменьшается. На основе полученных данных предложены подходы для направленной оптимизации экспрессных систем детекции вирусов растений с применением НКЗ.
Практическая значимость работы. Разработаны способы получения конъюгатов антител и НКЗ с контролируемыми свойствами. Определены оптимальные свойства иммунореагентов для применения в иммунохроматографическом анализе вирусов растений. Разработаны и изготовлены экспериментальные образцы иммунохроматографических тест-систем для экспрессного (10 минут) выявления ВКГ, ВТМ, ХВК и ВШС в листьях растений. Показано, что тест-системы, изготовленные в соответствии с обоснованными в работе требованиями к иммунореагентам, по эффективности выявления зараженных вирусами растений не уступают иммуноферментному анализу, но позволяют значительно сократить время определения.
Связь работы с государственными программами. Работа была поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (государственный контракт № П975 от 20 августа 2009 г.).
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих научных мероприятиях: Первая международная конференция "Современные достижения бионаноскопии" (Москва, 2007), Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008), конференция «Химический анализ» в рамках 32-ой Годичной сессии Научного совета по аналитической химии РАН (Московская обл., 2008), Четвертый съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), Четвертая международная конференция "Современные достижения бионаноскопии" (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 6 тезисов в материалах конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (3 главы) и списка литературы (282 наименования). Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 80 рисунков и 17 таблиц.
