Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. Экспериментальное изучение смешанных бактериально-вирусных инфекций 9
1. Начальные этапы взаимодействия в системе вирус-бактерия клетка 13
2. Исход, динамика и типы процессов взаимодействия вирусов, бактерий и эукариотических клеток 18
3. Смешанные инфекции с участием онковирусов 26
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные культуры, использованные в работе 30
2. Вирусы 32
3. Клеточные культуры 32
4. Культивирование перевиваемых клеток 33
5. Среды, используемые для выращивания бактерий 33
6. Модели смешанных инфекций 33
7. Инфицирование клеточного монослоя бактериями и вирусами и изучение кинетики адсорбции 34
8. Электронно-микроскопические методы 35
9. Объемная реконструкция изображений, получение стереопар 37
10. Световая микроскопия 38
11. Методы количественного анализа результатов 38
ГЛАВА 2. АДСОРБЦИЯ БАКТЕРИЙ НА МОНОСЛОЕ КЛЕТОК, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ.
I. Поверхностные структуры бактерий, участвующих в адсорбции
2. Адсорбция вирионов онковирусов на поверхности бактерий 56
3. Влияние репликации вируса на адсорбцию бактерий на эукариотических клетках 61
ГЛАВА Ш. ПРОНИКНОВЕНИЕ, КОЛОНИЗАЦИЯ И ИСХОДЫ, ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИЙ С КЛЕТКАМИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ИНФИЦИРОВАННЫМИ ВИРУСОМ 1. Проникновение бактерий в эукариотическую клетку... 65
2. Изменения эукариотических клеток под влиянием бактерий 83
3. Динамика размножения и изменение морфологии бактерий в системе бактерия клетки перевиваемых линий 92
ГЛАВА ІУ. МОРФОЛОГИЯ И МОРФОГЕНЕЗ ОНКОВИРУСОВ В УСЛОВИЯХ ИНФЕКЦИИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С БАКТЕРИЯМИ.
1. Морфология онковирусов, реплицирующихся в клетках изученных перевиваемых линий 105
2. Морфогенез онковирусов типа С в условиях ассоциированной с бактериями инфекции 107
2.1. Модель онковирус типа С-перевиваемые клетки
L929 M,tuberculosis штамм БЦЖ 109
2.2. Модель: онковирус типа Д-клетки перевиваемой линии НЕр-2-микобактерия туберкулеза
штамм 3821 112
2.3. Модель: онковирус типа Д-клетки перевиваемой линии HEp-2-S. pneumoniae бес капсульный вариант) 112
2.4. Модель: онковирус типа С-клетки перевиваемой линии Л-41-вирус живой коревой вакцины 114
3. Аномальные формы онковирусов в условиях инфекции ассоциированной с бактериями 118
3.1. Аномальные величины и внутренней организации внеклеточных вирионов 118
3.2. Аномальные формы онковирусов, образующихся в результате дифференцировки незрелых вирионов 119
3.3. Аномальные формы зрелых вирионов типа С 122
3.4. Включение компонентов эукариотической клетки в состав вирионов онковирус 124
3.5. Аномалии внутрицитоплазматических частиц типа А.. 124
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 127
ВЫВОДЫ 137
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
В настоящее время смешанные инфекции представляют собой важную проблему инфекционной патологии человека и животных (Бароян, Портер, 1975).
Клиническое течение бактериально-вирусных смешанных инфекций отличается большей тяжестью по сравнению с заболеваниями, вызванными только вирусами или только бактериями ( Finland et al., 1942; Шкребко и др., 1967; Ацерова и др., 1967). Картина заболевания в условиях смешанной инфекции резко меняется, создавая диагностические трудности (Бондаренко, 1969). Наиболее часто случаи смешанной бактериально-вирусной инфекции регистрируются при заболеваниях респираторного и желудочно-кишечного трактов (Ритова, 1967; Goodwin, 1967; Young, La Forse , 1972).
Инфекционный процесс, вызываемый ассоциацией бактерий с вирусами широко изучают на различных моделях как in vivo; так и in vitro. Однако в имеющихся работах можно чаще всего найти описание результата взаимодействия, реже - рассмотрение механизмов, вскрывающих сущность происходящих изменений. На наш взгляд, существенный вклад в понимание механизмов реализации смешанной инфекции может внести морфологическое исследование взаимодействия ассоциантов системы, выполненное на ультраструктурном уровне. Это касается, в первую очередь, изучения начального этапа взаимодействия возбудителей с эукариотическими клетками, который является пусковым и определяющим в развитии почти всех инфекционных процессов (Петровская, 1984). Имеющиеся в настоящее время данные не отражают полной картины начальных этапов взаимодействия в системе бактерия - вирус - эукариотическая клетка ( Pan et al., 1979; Selinger, 1981j Sanford et al., 1982).
При моделировании бактериально-вирусных смешанных инфекций на перевиваеглых клеточных линиях наиболее часто использовали следующие модели: вирус гриппа + стафилококк или стрептококк, вирус Коксаки + шигеллы или энтеропатогенные Е.СОІІ (Токарь и др., 1971; Шендорович и др., 1973; Эссель, 1978). Однако авторы опубликованных работ не учитывали, что в геном клеток позвоночных интегрирована генетическая информация онковирусов, которая в клетках перевиваемых линий нередко экспрессируется до морфологически выраженных вирионов. Поэтому онковирусы естественным образом принимают участие во взаимодействии возбудителей, моделируемом на перевиваемых клетках.
Создание моделей смешанной бактериально-вирусной инфекции с участием различных по своим биологическим свойствам патогенных и условно-патогенных бактерий и онковирусов и изучение на этих моделях супрамолекулярных основ взаимодействия инфекционных агентов может способствовать выяснению механизмов вирусного канцерогенеза и коканцерогенеза. Именно такого рода экспериментальные разработки составили предмет настоящего исследования, выполненного на перевиваемых клеточных линиях, инфицированных рядом патогенных и условно-патогенных бактерий.
Целью настоящего исследования явилось изучение ультраструктурных особенностей взаимодействия различных таксономических групп бактерий с клетками млекопитающих в условиях смешанной инфекции с онковирусами типов Д и С. При проведении исследования перед нами стояли следующие конкретные задачи:
1. Изучить ультраструктурные особенности адсорбции и проникновения бактерий в эукариотические клетки в условиях смешанной бактериально-вирусной инфекции.
2. Разработать метод количественной оценки начальных этапов взаимодействия бактерий и аукариотических клеток в условиях смешанной бактериально-вирусной инфекции.
S. Изучить варианты исходов бактериально-клеточных взаимодействий на ультраструктурном уровне в условиях смешанной бактериально-вирусной инфекции перевиваемых клеточных линий.
4. Выявить влияние бактериальной инфекции на морфогенез онковирусов в условиях смешанной инфекции перевиваемых клеточных линий.
Основные результаты проведенных исследований сводятся к следующему:
Ds.coli НЮ407 CFAJ и уропатогенные штаммы, несущие Р фим-брии (Е.СОІІ ISI2 и Е.СОІІ 1356), прикрепляются к гликокаликсу эукариотических клеток посредством капсулоподобного покрова, выявляемого электронно-микроскопически с использованием рутениевого красного. При этом фимбрии бактерий подгибаются и распластываются по поверхности эукариотической клетки.
2) Вирус саркомы Кирстена не влияет на адсорбционную способность клеток Е5 по отношению к Е ООІІ Н0407 CPAt . В то же время прединфицирование монослоя клеток вирусом живой коревой вакцины существенно увеличивает адсорбцию той же бактерии.
3) Вирионы онковирусов адсорбируются на фимбриях и капсулоподобном покрове Е.СОІІ, капсулоподобном покрове s.typhi, на остаточных структурах капсулы бескапсульного вариантаs.pneumoniae, а также на микрокапсуле м.tuberculosis.
4) Поглощение (фагоцитоз) бактерий с адсорбированными на их поверхностях: вирионами онковирусов, а также захват вирионов, находящихся в зоне образования клеткой отростков, подобных псевдоподиям макрофагов, приводит к образованию фагосом, содержащих как бактерии, так и вирусы. Это явление обнаружено на моделях S.typhi - онковирус типа С - клетки перевиваемой линии L929 и s.pneumoniae - онковирус типа Д - клетки перевиваемой линии НЕр-2.
5) Образование фагосом, содержащих наряду с бактерией онковирусы, может происходить и путем почкования вирионов онковирусов в фагосомы, содержащие бактерии (модель м.tuberculosis шт.БДЖ -онковирус типа С - клетки перевиваемой линии L929) 6) длительное сохранение интактных клеток м.tuberculosis в фагосомах клеток L приводит к увеличению продукции онковирусов этими клетками. Внеклеточная популяция онковирусов, продуцируемая клетками в условиях бактериального инфицирования, содержит до 6,4$ аномальных форм.
