Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 . Способы выживания бактерий в макроорганизме (обзор литературы) 13
1.1. Эффекторные механизмы антибактериального иммунитета 13
1.2. Выживание бактерий при взаимодействии с эффекторными механизмами иммунитета 29
1.3. Взаимодействие бактерий с эффекторными механизмами защиты хозяина как поверхностное явление 54
1.4. Общий взгляд на классификацию бактериальных механизмов выживания в макроорганизме 62
Глава 2. Материал и методы исследования 65
2.1. Характеристика культур микроорганизмов 65
2.2. Определение антилизоцимной активности бактерий 67
2.3. Определение антиинтерцидной активности бактерий 67
2.4. Методы исследования взаимодействий бактерий с системой комплемента 68
2.5. Методы исследования антиоксидантных свойств бактерий 73
2.6. Методы исследования фагоцитоза 81
2.7. Методы исследования поверхностных свойств бактерий 85
2.8. Моделирование инфекционных процессов бактериальной этиологии в организме лабораторных животных 88
2.9. Статистическая обработка результатов 90
Глава 3. Выживание бактерий при взаимодействии с гуморальным эффекторным механизмом иммунитета 92
3.1. Протективные эффекты внеклеточных продуктов бактерий в отношении эритроцитов и чувствительных бактерий 92
3.2. Роль способности к инактивации факторов естественной резистентности в серорезистентности энтеробактерий 96
3.3. Роль способности к инактивации факторов естественной резистентности в серорезистентности Neisseria gonorrhoeae 109
3.4. Специфичность ингибирования активности комплемента внеклеточными продуктами бактерий 115
3.5. Резюме к главе 3 121
Глава 4 . Антиопсонические эффекты внеклеточных продуктов бактерий 123
4.1. Антиопсоническое действие внеклеточных продуктов стафилококков 124
4.2. Антиопсоническое действие внеклеточных продуктов нейссерий 127
4.3. Особенности антиопсонического действия внеклеточных продуктов S.aureus и N.gonorrhoeae 131
4.4. Способность бактерий к инактивации факторов естественной резистентности как фактор их устойчивости к бактерицидному действию крови 136
4.5. Резюме к главе 4 139
Глава 5 . Взаимодействие бактерий с эффекторными механизмами иммунитета как поверхностный феномен 142
5.1. Вариабельность гидрофобности бактериальной поверхности 143
5.2. Гидрофобные свойства бактерий как отражение процесса опсонизации сывороточными компонентами 148
5.3. Опсоническая конверсия гидрофобности бактерий и активация нейтрофильных лейкоцитов 155
5.4. Гидрофобные свойства как отражение антиопсонического действия внеклеточных продуктов бактерий 158
5.5. Резюме к главе 5 164
Глава 6. Выживание бактерий при взаимодействии с фагоцитарным эффекторным механизмом иммунитета 166
6.1. Каталаза и супероксиддисмутаза в популяциях бактерий 167
6.2. Резистентность бактерий к активным кислородным радикалам как фактор устойчивости к фагоцитарному киллингу 173
6.3. Бактериальные факторы выживания при фагоцитозе -сравнительный анализ 178
6.4. Резюме к главе 6 208
Глава 7. Экспериментальное и клинико-микробиологическое изучение выживания бактерий в макроорганизме 211
7.1. Каталаза и супероксиддисмутаза золотистых стафилококков
при моделировании их персистенции в макроорганизме 212
7.2. Выживание энтеробактерий при экспериментальной транслокации из кишечника во внутренние органы 217
7.3. Факторы устойчивости бактерий к эффекторам иммунитета в развитии пиелонефрита 227
7.4. Роль факторов выживания бактерий при гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей 247
7.5. Резюме к главе 7 257
Глава 8. Патогенетическое значение факторов устойчивости бактерий к эффекторным механизмам защиты хозяина (Обсуждение ) 260
Заключение 291
Выводы 295
Список литературы 297
Приложения 361
- Эффекторные механизмы антибактериального иммунитета
- Протективные эффекты внеклеточных продуктов бактерий в отношении эритроцитов и чувствительных бактерий
- Антиопсоническое действие внеклеточных продуктов стафилококков
- Вариабельность гидрофобности бактериальной поверхности
Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема выживания бактерий в макроорганизме определяется на пересечении проблем вирулентности и персистенции микроорганизмов, интерес к которым в последние два десятилетия заметно усилился [570, 701, 702].
Возросший интерес к феномену выживания как части феномена вирулентности микроорганизмов обеспечивается по меньшей мере двумя важными аспектами. Во-первых, способность к выживанию, росту и размножению в макроорганизме, так же как и противодействие патогенов иммунным механизмам всегда считались обязательными атрибутами вирулентности [4, 159, 187, 251, 435, 483, 537]. Во-вторых, в рамках бурно развивающейся в последние десять лет новой идеологии изучения вирулентности микроорганизмов -изучения in vivo - выживанию и росту микроорганизмов в организме хозяина отводится основополагающая роль [701].
Феномен выживания бактерий в макроорганизме - неотъемлемая часть проблемы персистенции патогенов, актуальность которой в последнее время неоднократно подчеркивалась ввиду роста числа и удельного веса хронических и маломанифестных форм инфекций, новых сведений о значении бактерионосительства, сложностей диагностики и лечения персисти-рующих инфекций [13, 20]. Эта проблема, считавшаяся одной из наименее изученных еще десять лет назад [702], в последние годы претерпела существенное обновление благодаря интенсивному накоплению фактов, свидетельствующих о вкладе различных бактериальных свойств и субстанций в формирование длительного выживания патогенов в макроорганизме [20, 152, 163, 286, 341, 537, 538, 561, 701]. Исследования в этой области базируются на различных концепциях, из которых наиболее предпочтительной, на наш взгляд, является позиция, рассматривающая феномен персистенции как «ре-
зультат симбиотических взаимоотношений» в системе «паразит-хозяин» [13]. Такой концепции в той или иной мере придерживаются многие исследователи [89, 115, 124, 181, 187, 198, 291, 701, 777], оценивающие феномен персистенции возбудителя с точки зрения баланса противодействующих механизмов в системе, а персистентныи и вирулентный потенциал паразита - с позиций соответствия занимаемой им экологической ниши.
Последнее обстоятельство предполагает, что персистирование патогенов в макроорганизме, в особенности в его внутренних средах, есть следствие в том числе их способности интерферировать иммунные механизмы. Не случайно, устойчивость к эффекторным механизмам иммунитета рассматривается в качестве необходимой предпосылки к выживанию в макроорганизме [152, 208, 656, 670], а способность к инактивации лизоцима, комплемента и других факторов защиты хозяина занимает важное место в современной классификации факторов бактериальной персистенции [13, 20].
Однако в отношении этих свойств существует множество неизученных вопросов. По меньшей мере три из них стали предметом исследования, результаты которого представлены в этой работе: 1) в какой мере способность бактерий к инактивации компонентов эффекторных механизмов иммунитета является фактором их устойчивости к этим механизмам; 2) какова специфика участия бактериальных свойств в реализации такой устойчивости; 3) каковы патогенетические последствия выживания патогена при взаимодействии с эффекторными механизмами иммунитета.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось установление биологической и патогенетической значимости фенотипических свойств бактерий, связанных с их устойчивостью к эффекторным механизмам антибактериального иммунитета.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
Выявление и сравнительная характеристика протективного действия, обусловленного секретируемыми факторами бактерий, при их взаимодействии с гуморальным эффекторным механизмом иммунитета.
Изучение антиопсонических эффектов, обусловленных секретируе-
мыми факторами бактерий.
Определение значимости гидрофобных свойств бактерий во взаимодействии с эффекторными механизмами иммунитета.
Выявление вклада опсонизации, секретируемых факторов бактерий и их устойчивости к активным метаболитам кислорода в выживание при фагоцитозе.
Экспериментальное и клинико-микробиологическое исследование роли факторов устойчивости бактерий к эффекторам иммунитета в патогенезе инфекционно-воспалительных процессов.
Положения, выносимые на защиту:
Способность бактерий инактивировать комплемент, лизоцим, ин-терцид, их антиоксидантные и поверхностные свойства, определяя ведущий вклад в устойчивость патогенов к эффекторным механизмам иммунитета, являются универсальными патогенетически поливалентными фенотипически-ми маркерами бактериальных возбудителей.
Патогенетическая роль бактериальных факторов устойчивости к эффекторным механизмам иммунитета проявляется в обеспечении патогенов селективными преимуществами при взаимодействии с бактерицидными системами макроорганизма и в антиопсоническом действии, что усиливает способность возбудителя к персистированию и транслокации, а также повышает вероятность возникновения и неблагоприятного развития заболеваний.
Вклад отдельных бактериальных свойств в устойчивость к эффекторным механизмам иммунитета зависит от роли компонентов эффекторных механизмов в бактерицидности биологических сред макроорганизма, условий взаимодействия, а также видовой и эковариантной принадлежности патогена, определяя специфику участия этих свойств в развитии инфекционных процессов.
Способность к инактивации компонентов эффекторных механизмов иммунитета является комплексом маркеров, информативных при диагностике патогенной микрофлоры и инфекционно-воспалительных заболеваний, а также при прогнозировании развития заболеваний.
Научная новизна. В рамках изучения феномена персистенции бакте-
рий в организме хозяина проведено комплексное исследование биологической и патогенетической роли способности бактерий к инактивации эффек-торных механизмов иммунитета (антилизоцимная, антикомплементарная, ан-тиинтерцидная, каталазная, супероксиддисмутазная активности, резистентность к бактерицидности сыворотки, устойчивость к активным метаболитам кислорода), а также физико-химических свойств бактериальной поверхности (гидрофобность и заряд). По результатам исследования сделано заключение об этих свойствах бактерий как об универсальных фенотипических маркерах таких биологических явлений как серорезистентность, антиопсоническое действие, устойчивость к фагоцитарному киллингу, способность к персисти-рованию и транслокации.
Новыми являются полученные сведения об антилизоцимной и антикомплементарной активностях как факторах устойчивости грамотрицательных бактерий к гуморальному эффекторному механизму иммунитета. Показана функциональная специфичность антикомплементарного действия внеклеточных продуктов бактерий, проявляющаяся в преимущественной инактивации отдельных компонентов комплемента внеклеточными продуктами E.coli, S.aureus и N.gonorrhoeae.
Впервые в сравнительном аспекте охарактеризованы антиопсониче-ские эффекты внеклеточных продуктов S.aureus и N.gonorrhoeae, обусловленные их антикомплементарной активностью, показана специфика антиоп-сонического действия.
Установлено, что гидрофобные свойства бактерий, находясь в соответствии с эпитопом обитания патогенов, при взаимодействии с гуморальным эффекторным механизмом иммунитета определяют направление и степень опсонической конверсии гидрофильно-липофильного баланса патогена. Такая опсоническая конверсия поверхности бактерий является физико-химическим маркером опсонизации сывороточными компонентами и анти-опсонического действия бактериальных внеклеточных продуктов. Впервые выявлена способность внеклеточных продуктов бактерий нивелировать оп-сонические сдвиги гидрофобности, которая существенно отличает грампо-ложительные бактерии (стафилококки, энтерококки) от грамотрицательных
(энтеробактерии, нейссерии): первые преимущественно ингибируют опсони-ческие эффекты при взаимодействии с уже опсонизированной поверхностью бактерий; вторые - оказывают преимущественно превентивное действие. Сделан вывод о различиях в антиопсоническом действии внеклеточных продуктов грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Впервые на широком круге бактериальных культур, выделенных из организма больных и здоровых людей показано, что активность супероксид-дисмутазы и каталазы бактерий связана с эпитопом обитания, проявляя пато-вариантные отличия по уровню и частоте встречаемости в популяциях патогенных бактерий.
Разработаны методические подходы к оценке устойчивости бактерий к ключевым активным формам кислорода, образующимся в ходе респираторного взрыва при фагоцитозе: супероксиданиону, оксиду азота и перокси-нитриту. Установлено, что активность ферментов-антиоксидантов обеспечивает положительный вклад в их устойчивость к бактерицидности кислородных метаболитов.
Идентифицирован комплекс ключевых механизмов, обеспечивающих устойчивость к фагоцитарному киллингу, включающий в себя способность к инактивации комплемента и лизоцима, ферментные антиоксиданты, устойчивость к пероксинитриту и супероксиданиону. Определены комбинации бактериальных свойств, обеспечивающие потенцирование устойчивости бактерий к фагоцитарному киллингу. На примере фагоцитоза бактерий при оп-сонизации различными сывороточными компонентами показана зависимость феномена выживания бактерий при фагоцитозе от условий взаимодействия в системе «фагоцит-бактерия».
Сформулировано положение о патогенетической поливалентности комплекса свойств бактерий, включающего их способность инактивировать комплемент, лизоцим, интерцид, а также антиоксидантные и поверхностные свойства. Показано, что данный комплекс свойств патогенов определяет различные патогенетические последствия устойчивости к эффекторам иммунитета: персистирование в макроорганизме и транслокацию из кишечника во внутренние органы.
В клинико-микробиологическом исследовании инфекций мочевых путей, постинъекционных абсцессов и ожоговой раневой инфекции показана связь секретируемых факторов бактерий, ответственных за устойчивость к эффекторам иммунитета, с возникновением внекишечных форм эшерихиозов (пиелонефрита) и затяжным характером течения гнойно-воспалительных заболеваний.
Практическая ценность работы. Полученные результаты явились основой для разработки новых технических решений, связанных с определением способности к инактивации комплемента, устойчивости к метаболитам кислорода, а также с диагностикой инфекционно-воспалительных процессов.
Сведения о сходстве протективных эффектов внеклеточных продуктов E.coli и S.aureus в отношении чувствительных к комплементу бактерий и сенсибилизированных эритроцитов, отражающие универсальность мембра-нолитического действия комплемента и общие принципы организации наружной мембраны грамнегативных бактерий и ЦПМ эритроцитов, позволили предложить способ определения антикомплементарной активности бактерий, основанный на использовании в качестве клеток-мишеней бактериальные клетки специально отобранного высокочувствительного штамма кишечной палочки [E.coli 212, ГИСК им. Л.А.Тарасевича; патент РФ №2010860].
Разработаны методические подходы к определению устойчивости бактерий к активным метаболитам кислорода, идентичным образующимся при фагоцитозе - супероксиданиону, оксиду азота и пероксинитриту. Основой предложенных методик явилось использование систем генерации активных форм кислорода в специально подобранных условиях. На выборках клинических и музейных культур E.coli и S.aureus проведена апробация разработанных методик, показавшая их пригодность для определения спектра устойчивости бактерий к супероксиданиону, оксиду азота и пероксинитриту.
На основе результатов, полученных при изучении роли дисбиоза кишечника в развитии пиелонефрита, уточнены механизмы инфицирования почек кишечными бактериями, что позволило сформулировать микробиологические критерии риска развития пиелонефрита и разработать новые подходы к его бактериологической диагностике (Методические рекомендации МЗ РФ
№ 95/31 «Ранняя диагностика инфекции мочевой системы у детей: клинико-лабораторные и микробиологические подходы», Оренбург, 1997; Методическое письмо ГУЗ Оренбургской области «Антиоксидантные свойства бактерий в диагностике инфекционно-воспалительных процессов», Оренбург, 2001).
Рекомендованные методы клинико-лабораторной диагностики пиелонефрита у детей внедрены в лечебно-профилактических учреждениях г.Оренбурга. Новые сведения о патогенезе пиелонефрита и роли бактериальных свойств в развитии этого заболевания использованы при проведении Международной школы-семинара по детской нефрологии (Оренбург, 1997).
Данные об информативности маркеров устойчивости S.aureus к эффекторам иммунитета для прогнозирования неблагоприятного течения постинъекционных абсцессов и раневой ожоговой инфекции послужили основой для разработки «Способа прогнозирования неблагоприятного течения гнойно-воспалительных заболеваний микробной этиологии» (Патент РФ 2111493; Бюлл. №14 от 20.05.1998), практических рекомендаций (Методическое письмо ГУЗ Оренбургской области «Антиоксидантные свойства бактерий в диагностике инфекционно-воспалительных процессов», Оренбург, 2001) и алгоритмов прогнозирования неблагоприятного течения постинъекционных абсцессов и раневой ожоговой инфекции. Рекомендованные алгоритмы внедрены в практику хирургических отделений больниц г. Оренбурга.
Апробация работы. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на всероссийских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 1994, 1997, 2000, 2003), VII Всероссийском съезде дерматовенерологов (Казань, 1996), Международном семинаре по детской нефрологии «Актуальные проблемы детской нефрологии» (Оренбург, 1997), Международном конгрессе «The 12th International Congress of Sexually Transmitted Diseases» (Испания, Севилья, 1997), научно-практической конференции «Новое в диагностике и лечении заболеваний, передающихся половым путём и болезней кожи» (Москва, 1997), 2-ой Российской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998), конференции под эгидой РАН и РАМН «Репродуктивное здоровье населения: микробиологи-
ческие и иммунологические аспекты» (Оренбург, 1999), совместном заседании Ученого совета ИКиВС УрО РАН и сотрудников ОГМА (Оренбург, 2001). Фрагменты работы экспонировались во Всероссийском выставочном центре в рамках выставки «Экология - 92», где были отмечены медалью ВВЦ РФ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 работ, из которых 18 - в центральных изданиях, получено 2 патента РФ.
Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской Академии наук в рамках программы НИР «Выживание бактерий при взаимодействии с эффекторами антибактериального иммунитета» (№ гос. регистрации 01.9.80 001821). Фрагменты работы выполнены в рамках комплексной программы НИР «Факторы бактериальной персистенции: экспериментальное изучение и обоснование использования в клинико-лабораторной и экологической практике» (№ гос. регистрации 01.9.40 000355) по плану сотрудничества между ИКиВС и ОГМА, а также по федерально-региональной программе НИР Минпромнауки РФ «Разработка методов ранней диагностики, лечения и профилактики заболеваний органов мочевой системы у детей Оренбургского региона» (№ гос. регистрации 01.9.50 007135).
Эффекторные механизмы антибактериального иммунитета
Реакции макроорганизма, которые непосредственно вызывают разрушение патогенных микроорганизмов (так же как и опухолевых клеток), в совокупности составляют эффекторные механизмы иммунной системы. Принципиально эффекторные иммунные реакции связаны с тремя основными способами (механизмами) защиты от инфекций. Первый из них -гуморальный механизм - связан главным образом с активацией системы комплемента, приводящий как к прямому лизису клеток-мишеней, так и к высвобождению ряда медиаторов, активирующих комплекс воспалительных и клеточных защитных реакций макроорганизма [9, 215]. Ко второй группе эффекторных механизмов иммунитета можно отнести защитные реакции фагоцитирующих клеток крови и тканей (макрофагов и гранулоцитов), привлекаемых в очаги воспаления многочисленными медиаторами [49]. Наконец, третьей важной составляющей эффекторной защиты макроорганизма является клеточная цитотоксичность, свойственная лимфоидной популяции и реализуемая цитотоксическими Т-клетками, в том числе специфическими для конкретного антигена, антителозависимыми и антителонезависимыми К-клетками [64, 88, 133, 493, 717, 765].
На сегодняшний день очевидным является участие в защите макроорганизма от патогенных бактерий всех трех эффекторных механизмов, два из которых - гуморальный и фагоцитарный - следует признать универсальными, так как их действие качественно не зависит от наличия специфической составляющей иммунного ответа в отношении всех без исключения бактериальных возбудителей [172, 761, 771]. Роль лимфоидных цитотоксических клеток в антибактериальном иммунитете остается недостаточно выясненной, хотя значение этого эффекторного механизма установлено в отношении ряда внутриклеточно паразитирующих бактерий [88, 103, 302, 439, 440, 441, 493, 673], и продолжается активное накопление фактов участия цитотоксических клеток в антибактериальной защите [145, 151, 200, 311, 328, 420, 477, 635, 681, 762].
Ключевая же роль клеточной эффекторной (осуществляющей непосредственный киллинг патогенов) защиты от патогенных бактерий отводится фагоцитирующим клеткам крови и тканей, из которых наиболее мощным бактерицидным потенциалом обладают нейтрофилы [172]. Эти клетки крови обладают полным набором кислородзависимых механизмов бактерицидности и литических ферментов, достаточным для лизиса и деградации едва ли не всех липидов, полисахаридов и белков мишеней [64].
Основное внимание в предлагаемом кратком обзоре эффекторных механизмов иммунитета отводится ключевым компонентам эффекторной защиты макроорганизма: системе комплемента, кислородзависимым бактерицидным механизмам фагоцитов, антимикробным катионным белкам.
Гуморальный эффекторный механизм антибактериального иммунитета, обычно проявляющийся и тестируемый в виде феномена бактерицидности сыворотки крови, является одним из важнейших факторов антибактериальной защиты макроорганизма и реализуется, главным образом, за счет функционирования системы комплемента [9, 732, 733; 700, 702]. Немаловажными компонентами данного механизмами являются также лизоцим, бета-лизин, некоторые катионные белки (например, тромбоцитарные катионные протеины), реализующие свои антимикробные свойства при взаимодействии с определенными субстратами и способные существенно усиливать бактерицидные реакции, сопровождающие воспаление и активацию комплемента [245, 394, 405, 474, 475, 494]. Ключевым звеном гуморального эффекторного механизма иммунитета является система комплемента, эффекторная функция которой заключается в непосредственном лизисе биологических мембран за счет своего мембраноатакующего комплекса (МАК), собираемого на поверхности мембраны-мишени в результате каскадной активации [9]. Универсальность МАК по отношению к самым различным билипидным мембранам обуславливает однотипность вызываемых комплементом повреждений, которые в случае достаточной эффективности активации комплемента обычно приводят клетку-мишень к гибели [733].
Система комплемента представляет собой сложный комплекс протео-литических ферментов, регуляторных белков и белков, способных лизиро-вать клетки. Ее формируют более 20 протеинов, составляющих 3-4% от всех сывороточных белков и циркулирующих в организме главным образом в неактивном состоянии (таблица 1). Основу системы комплемента составляют три набора протеинов крови, первые два из которых обеспечивают различные пути ее активации до третьего компонента (СЗ), играющего ключевую роль в функционировании всей системы. Больший фрагмент СЗ, СЗЬ, фиксированный на поверхности мембраны-мишени, активирует третий набор белков системы, предназначенный для сборки мембраноатакующего комплекса комплемента и его интернализации в мембрану-мишень, что вызывает осмотический лизис клетки [9, 100, 142, 572, 773].
Выделяют три пути активации комплемента, два из которых известны давно и хорошо изучены. Это классический, включающий Cl(q, г, s), С4, С2 и СЗ компоненты, и альтернативный, реализуемый с участием факторов В, D, Р и СЗ компонента, пути активации. Оба пути образуют самостоятельные С5-конвертазы и на этапе активации поздних компонентов (С5-С9) смыкаются, образуя, как уже говорилось, МАК. Последний представляет собой огромный комплекс компонентов, (С5Ь-8)-С9п, в котором полимеризованный С9 образует торообразную структуру, гидрофобную снаружи и гидрофильную изнутри, способную погружаться в липидные слои мембраны-мишени [100, 142, 773]. Инициаторами классической активации комплемента служат иммунные комплексы, в состав которых могут входить иммуноглобулины классов М, Gj, G2, G3, а также фактор гемостаза Xllf, липополисахариды некоторых микроорганизмов. Альтернативный путь активации находится в постоянно работающем состоянии, однако скорость его в обычных условиях чрезвычайно низка. Ускорение альтернативного пути наблюдается в вычайно низка. Ускорение альтернативного пути наблюдается в присутствии многих чужеродных агентов: вирусов, бактерий, грибов, простейших, аггре-гированных иммуноглобулинов, различных полисахаридов [484].
Протективные эффекты внеклеточных продуктов бактерий в отношении эритроцитов и чувствительных бактерий
Понимание универсальности мембранолитического действия системы комплемента, так же как и понимание того, что это действие является основным фактором, приводящим чувствительные бактерии к гибели [732, 733], является важным условием для поиска бактериальных механизмов устойчивости к гуморальному эффекторному механизму иммунитета.
Универсальность мембранолитических эффектов комплемента можно проиллюстрировать, например, фактом корреляции между степенью иммунного гемолиза эритроцитов и уровнем бактерициди ости одних и тех же образцов сыворотки крови (рисунок 5).
Соответствие гемолитической способности сывороточного комплемента и бактерициди ости в отношении E.coli 212. Обозначения: По оси абсцисс - ранг образца сыворотки крови, определенный по лизису эритроцитов. По оси ординат — ранг образца сыворотки крови, определенный по бактерицидное в отношении E.coli 212.
Представленный пример - результат сопоставления чувствительности к БАС бактерий штамма E.coli 212 (ГИСК им.Л.А.Тарасевича) и степени лизиса сенсибилизированных эритроцитов барана, полученный при использовании в качестве источников комплемента 78 проб сыворотки крови человека. Эта серия экспериментов была проведена нами при разработке методики определения антикомплементарной активности бактерий и выявила высокий уровень корреляции между бактерицидностью и гемолитической активностью сывороток (р=+0,786, h2=61,7%; Р 0,01).
С одной стороны такой результат позволил в свое время предложить способ определения антикомплементарной активности бактерий, основанный на использовании в качестве клеток-мишеней бактериальные клетки высокочувствительного штамма кишечной палочки (отобранный клон E.coli К12, Е.соН 212). С другой стороны, будучи интегральным показателем способности внеклеточных продуктов бактерий ингибировать комплементзависимый лизис сенсибилизированных эритроцитов, антикомплементарная активность бактерий может рассматриваться в качестве признака, косвенно соответствующего протективному эффекту в отношении бактериальных клеток.
Очевидно, что различия во взаимодействии наружных мембран бактерий и цитоплазматической мембраны эритроцитов с комплементом существуют. Они объясняются как различиями в строении этих мембран, так и в способе активации системы комплемента, а также возможным присутствием в бактериальных мембранах компонентов, специфически реагирующих с системой комплемента. Поэтому говорить о полном соответствии «антигемолитических» и «антибактерицидных» эффектов в данном контексте было бы некорректно. Однако наличие общих принципов организации таких мембран и универсальность мембранолитического действия МАК комплемента, позволяет предположить, что такое соответствие должно иметь существенный уровень.
Тезис о соответствии антикомплементарной активности супернатан-тов бактериальных культур протективному эффекту в отношении самих бактериальных клеток, несмотря на свою очевидность, потребовал проверки. Такая проверка проведена нами на 52 культурах Е.соН и 35 культурах S.aureus, выделенных из различных эпитопов и проявлявших различные уровни антикомплементарной активности. В качестве тест-штамма с высокой чувствительностью к БАС использовали Е.соН 212 (ГИСК им.Л.А.Тарасевича). Серо-резистентность этого штамма находилась на уровне 5-6%, при этом штамм не проявлял собственной антикомплементарной активности. Испытуемые культуры Е.соН обладали антикомплементарной, антилизоцимной и антиинтер-цидной активностью, средние уровни которых составили соответственно 7,5±0,9 анти-СН5о, 2,0±0,2 мкг и 1,4±0,2 ед. Аналогичные показатели для S.aureus составили 6,9±0,9 анти-СН50, 0,5+0,1 мкг, 0,8±0,1 ед.
Связь антикомплементарной активности и протективного эффекта супернатантов культур Е.соИ и S.aureus в отношении роста тест-штамма Б.соїі 212. Обозначения: По оси абсцисс — антикомплементарная активность, анти-СН5о; по оси ординат - сдвиг серорезистентности тест-штамма Е.соИ 212 (%) под действием супернатантов испытуемых культур.
Для выявления протективного эффекта внеклеточных продуктов бактерий на рост E.coli 212 использовали пул сывороток от здоровых доноров, образцы которого предварительно инкубировали в смеси с равным объемом супернатантов испытуемых культур. Результаты этой серии экспериментов (рисунок 6) показали, что супернатанты Е.соИ и S.aureus проявляли выраженный протективный эффект в отношении роста E.coli 212. В целом, БАС-резистентность тест-штамма повысилась с 5,6±0,6% до 23,3+1,6% (в 4,16 раза; Р 0,05) в случае с культурами E.coli и с 6,0±0,3% до 22,7+1,5% (в 3,78 раза; Р 0,05) в случае с S.aureus. Соответствующие величины протективного эффекта составили 18±2% и 17±2%. Увеличение резистентности к БАС тест-штамма под влиянием внеклеточных продуктов E.coli и S.aureus сопровождалось выраженной корреляционной связью между величиной протективного эффекта и антикомплементарной активностью испытуемых культур.
Указанная корреляционная связь характеризовалась достоверностью на высоком уровне значимости (Р 0,01) и составила для E.coli - +0,623, а для S.aureus - +0,574. Соответствующие силы влияния - 38,8% и 32,9%. Связь антилизоцимной и антиинтерцидной активностей E.coli и S.aureus с протек-тивным эффектом супернатантов их культур в отношении клеток штамма E.coli 212 на статистически значимом уровне не обнаружена. Коэффициенты корреляции составили для антилизоцимной активности +0,305 (Р 0,05) у E.coli и +0,200 (Р 0,05) у S.aureus, для антиинтерцидной активности — +0,232 (Р 0,05)и+0,128(Р 0,05).
Таким образом, протективные эффекты внеклеточных продуктов E.coli и S.aureus в отношении чувствительных к БАС бактерий в значительной мере соотносятся с их антикомплементарной активностью (т.е. с протек-тивными эффектами в отношении сенсибилизированных эритроцитов). Это обстоятельство определило одно из направлений нашего исследования, позволив предположить изначально положительный вклад антикомплементарной активности (внеклеточных продуктов) бактерий в формирование их устойчивости к БАС (гуморальному эффекторному механизму иммунитета). Проверке этого предположения в целом посвящено исследование, результаты которого приведены ниже.
Роль способности к инактивации факторов естественной резистентности в серорезистентности энтеробактерий. Интерес к энтеробактериям и в частности к кишечной палочке при изучении взаимодействия бактерий с иммунной системой макроорганизма не является случайным и обусловлен экологической пластичностью [26] данных микроорганизмов, выражающейся в повсеместной распространенности, по-лигостальности и постоянно поддерживаемой гетерогенности популяций. Гетерогенность популяций энтеробактерий (кишечных палочек) проявляется в обнаружении их в качестве возбудителей при целом ряде инфекционно-воспалительных процессов, отличающихся как по локализации, так и по характеру течения. Способность паразитировать и выживать в различных органах и тканях макроорганизма, переселяясь из одного эпитопа в другой, несомненно, предъявляет особые требования к адаптационным потенциям этих бактерий, в том числе к «умению» быть устойчивыми к бактерицидным системам хозяина. В этом смысле универсализм энтеробактерий в целом и кишечной палочки в частности делает их незаменимым объектом исследования при изучении феномена выживания бактерий в условиях взаимодействия с эффекторными механизмами иммунитета.
Антиопсоническое действие внеклеточных продуктов стафилококков
Опсонические эффекты фагоцитов, вызванные комплементопосредо-ванной опсонизацией, изучали по величине индуцированной хемилюминес-ценции при фагоцитозе СЗЬ-опсонизированного (нативного - в контроле) зи-мозана [68]. Опсонический эффект иммуноглобулинов оценивали, индуцируя хемилюминесценцию термоинактивированными клетками S.aureus 209Р [5] -интактными в контроле и обработанными коммерческим препаратом человеческого антистафилококкового иммуноглобулина в опыте. Влияние внеклеточных продуктов стафилококков на эффективность опсонизации определяли после инкубации индукторов хемилюминесценции с супернатантами бульонных культур S.aureus, проявляющих антикомплементарную активность и экспрессирующих протеин А при различных сочетаниях наличия и уровней выраженности данных свойств. Относительную интенсивность хемилюминесценции (ОИХЛ) рассчитывали по формуле: ОИХЛ=(А-С)/(В-С), где С и В - уровни хемилюминесценции при фагоцитозе соответственно интактных и опсонизированных частиц; А - уровни хемилюминесценции при фагоцитозе опсонизированных частиц, инкубированных в контакте с супернатантами испытуемых культур S.aureus. Изученная группа стафилококков (54 штамма) была представлена как вариантами, альтернативными по наличию антикомплементарной активности и белка А, так и культурами, проявляющими оба свойства при различных сочетаниях уровней их выраженности. Полученные результаты показали, что взаимодействие макрофагов с фагоцитируемыми частицами сопровождалось развитием люминолзависимой хемилюминесценции с двумя максимумами. Первый из них регистрировался на 178±34 секунде и обуславливался взаимодействием между поверхностью фагоцитируемого объекта и мембраной макрофага. Второй, определяемый выделением активных форм кислорода, формировался к 456+21 секунде наблюдения. Опсонизация фагоцитируемых частиц повышала интенсивность «окислительного взрыва», при этом наиболее выраженным данное увеличение было в отношении первого максимума хемилюминесценции. Абсолютные значения первого пика хемилюминесценции при взаимодействии с СЗЬ-опсонизированным зимозаном в 2,73 раза превышали таковые в контроле. При фагоцитозе Ig-опсонизированного стафилококка 209Р — в 4,69 раза.
Предварительная инкубация СЗЬ-опсонизированного зимозана с су-пернатантами культур S.aureus вела к снижению суммарных значений хемилюминесценции (таблица 15). При этом интенсивность ее подавления в случаях тестирования супернатантов отдельных испытуемых штаммов стафилококков была прямо пропорциональна (r=0,667; Р 0,05; h2 = 44,5%) уровню их антикомплементарной активности и не зависела от количества внесенного очищенного препарата белка А. Кроме того, подавление хемилюминесценции не воспроизводилась при инкубации с супернатантами культур S.aureus, не проявляющих антикомплементарной активности.
В большей степени угнетение хемилюминесценции коснулось ее первого максимума (ОИХЛ=:0,397±0,179; Р 0,001), что свидетельствует в пользу преимущественной реализации роли антикомплементарного фактора в нарушении лиганд-рецепторного взаимодействия между макрофагом и фагоцитируемым объектом.
Использование в качестве объектов фагоцитоза Ig-опсонизированных клеток S.aureus 209Р, предварительно обработанных супернатантами испытуемых культур S.aureus, вело к еще более выраженному угнетению первого пика люминолзависимой хемилюминесценции (таблица 15). При этом типичными значениями первого пика были отрицательные значения относительного индекса (-0,879±0,452; Р 0,001), что свидетельствует не только об альтернативной Fc-рецепции белком А, но и о менее выраженной стимуляции фагоцитоза Ig-опсонизированными частицами, обработанными суперна тантами культур стафилококков, по сравнению с необработанными. В изученной выборке S.aureus влияние на интенсивность хемилюминесценции коррелировало с уровнем Fc-рецепторной способности их супернатантов (г=0,941; Р 0,05). При этом сам антиопсонический эффект был специфичен, так как не воспроизводился при использовании культур, проявляющих антикомплементарные свойства, но дефектных по наличию белка А. С другой стороны, предварительная инкубация фагоцитируемых частиц с коммерческим препаратом протеина А также вела к дозозависимой депрессии хеми-люминесцентного ответа макрофагов.
Изучение сочетанного влияния АКА и протеина A S.aureus на интенсивность хемилюминесценции проводили на модели фагоцитоза термоинак-тивированных клеток S.aureus 209Р, опсонизированных пулом нормальной сыворотки крови человека от 20 здоровых доноров. Полученные результаты свидетельствовали о сохранении в целом зависимостей, описанных выше и зарегистрированных отдельно для антикомплементарной активности и протеина А стафилококков. Однако примерно в одной трети случаев были отмечены отрицательные значения суммарного индекса хемилюминесценции, соответствующие супернатантам с высокими уровнями антикомплементарной активности и продукции протеина А (рисунок 20). Двухфакторный дисперсионный анализ подтвердил независимость и достоверность влияния каждого из изученных свойств на интенсивность лю-минолзависимой хемилюминесценции. При этом на долю антикомплемен 126 Относительные индексы хемилюминесценции макрофагов при фагоцитозе опсонизированных клеток S.aureus 209Р, обработанных внеклеточными продуктами S.aureus. Обозначения: По оси ординат — относительный индекс хемилюминесценции. По оси А — антикомплементарная активность S.aureus: 1 - [0; 5[ анти-СН5о; 2 - [5; 10[ анти-СН5о; 3 - 10 анти-СгІ5о. По оси Б - Fc-рецепторная способность S.aureus (титр в РПГА): 1 — от 1 до 1/4; 2 - от 1/8 до 1/64; 3 - 1/128 и выше. Антиопсоническое действие внеклеточных продуктов нейссерий. Взаимодействие микроорганизма с нейтрофильным фагоцитом является одним из ключевых звеньев в патогенезе нейссериальных инфекций. При этом, наряду с устойчивостью возбудителя к механизмам внутриклеточного киллинга, важное значение имеет и его уклонение от фагоцитарной реакции организма хозяина [170, 732]. Обнаружение у гонококков способности к инактивации комплемента, так же как и в случае со стафилококками, поставило на повестку дня вопрос о роли этого признака в возможных антиоп-сонических эффектах N.gonorrhoeae.
В качестве объектов для фагоцитоза использовали бактерии 20 культур N.gonorrhoeae, разделенных на 2 группы: 1) проявлявшие высокий уровень антикомплементарной активности ( 10 анти-СН5о); 2) проявлявшие низкую ( 3 анти-СН5о) АКА или не экспрессировавшие этот признак. Интактные бактерии обоих групп штаммов не отличались по исходному уровню гидро-фобности и способности к активации фагоцитов.
В качестве фагоцитирующих клеток использовали нейтрофилы крови человека (10 клеток/мл), выделенные на градиенте фиколл-верографин (1,077:1,119) после предварительного осаждения эритроцитов в растворе дек-страна Т500 (М= 500 000). Эффективность опсонизации оценивали по интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов. Регистрацию хемилюминесценции производили с помощью биохемилюминометра БХЛ-06 (НПО «Биофармавтоматика», Н.Новгород) как описано в разделе 2.7. Интенсивность хемилюминесценции выражали в виде отношения сигнала, полученного для опсонизированных бактерий к сигналу, полученному для интактных бактериальных клеток - индекса хемилюминесценции (ИХЛ).
Параллельно регистрировали гидрофобность поверхности бактериальных клеток, которую выражали в виде гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ; раздел 2.8). Опсонизацию бактерий (109 КОЕ/мл) проводили в разведении 1:4 в течение 30 минут при 37С с последующей трехкратной отмывкой. Использовали следующие режимы взаимодействия (таблица 16): а) контроль — опсонизация термоинактивированной сывороткой крови; б) опсо-низация интактной сывороткой; в) режим преинкубации — опсонизация сывороткой, предварительно обработанной (30 минут, 37С) гомологичными супернатантами; г) режим постинкубации — опсонизация интактными реагентами с последующей инкубацией клеток в смеси с гомологичными супернатантами (30 минут, 37С).
Вариабельность гидрофобности бактериальной поверхности
На первом этапе исследования нами предпринята попытка оценить уровни и пределы вариабельности гидрофобности поверхности бактериальных клеток в зависимости от их таксономической (главным образом видовой) и эковариантной принадлежности. Кроме того, нами проведен анализ взаимосвязи показателя гидрофобности бактерий с выраженностью их способности к инактивации ряда эффекторов антибактериального иммунитета (лизо-цима, комплемента, интерцида).
Изучение гидрофобности поверхности бактерий проводилось на выборке, состоящей из 311 штаммов патогенных и условно-патогенных грампо-ложительных и грамотрицательных бактерий, выделенных из различных эко-топов. Основная выборка состояла из шести групп штаммов: 1) 38 штаммов S.aureus выделенных из воздуха закрытых помещений, от бактерионосителей и из раневого отделяемого больных с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей; 2) 36 штаммов коагулазонегативных стафилококков, изолированных из воздуха и со слизистой носа бактерионосителей; 3) 34 штаммов бактерий - представителей вида Enterococcus faecalis, выделенных из фекалий здоровых лиц и при дисбиотических состояниях кишечника, а также из раневого отделяемого при различных гнойно-воспалительных заболеваниях; 4) 118 штаммов E.coli, выделенных из фекалий лиц с дисбиотическими нарушениями микрофлоры кишечника, из мочи при хроническом пиелонефрите и асимптомной бактериурии, из отделяемого ран при раневых инфекциях, а также из воды хозяйственно-питьевого назначения; 5) 11 клинических изолятов N.gonorrhoeae, выделенных при лятов N.gonorrhoeae, выделенных при гонорее, и 21 музейного штамма бактерий - представителей рода Neisseriaceae, полученных из коллекции живых бактериальных культур ГИСК им. Л.А.Тарасевича; 6) 15 штаммов K.pneumoniae, 15 штаммов S.flexneri и 14 штаммов S.enteritidis, выделенных из фекалий больных острыми кишечными инфекциями и при дисбиозе кишечника.
Обозначения: -коагулазонегативные стафилококки: S.epidermidis (18), S.cochnii (5), S.haemolyticus (12), S.simulans (1); 2 — представители других видов нейссерий, не относящиеся к N.gonorrhoeae: N.meningitidis (1), N.subflava (3), N.flavescens (3), N.flava (1), N.perflava (1), N.caviae (1), N.animalis (1), N.canis (2), N.sicca (3), N.ovis (1), N.elongata (1), N.cuniculi (1), N.denitrificans (1).
Как видно из таблицы, представители видов E.coli (ГЛБ=-0,003±0,062), S.aureus (0,021±0,042), группы КОС (-0,119+ 0,099), а также энтерококки (0,144+0,033) и нейссерий (гонококки - 0,006±0,041; другие виды —0,180+0,127) характеризовались умеренной экспрессией гидрофобности клеточной поверхности. Этого нельзя было сказать в отношении ряда представителей семейства Enterobacteriaceae, которые отличались значительно более высокой гидрофобностью. Так, штаммы S.enteritidis проявляли самую высокую из всех исследуемых бактерий гидрофобность (1,546±0,177). Пред ставители вида S.flexneri были также высоко гидрофобны (1,271 ±0,122). Бактерии вида K.pneumoniae характеризовались умеренной выраженностью ГЛБ (0,364±0,183).
С целью выявления влияния таксономической (видовой) принадлежности исследованных бактерий на их гидрофобные свойства был применен дисперсионный анализ, основанный на сопоставлении внутри- и межгрупповой вариабельности признаков и проведенный в соответствии с рекомендациями [2, 41]. Результаты анализа указывают на выраженную связь гидро-фобно-липофильного баланса поверхности бактерий с их таксономической принадлежностью при высоком уровне достоверности (F=76,7; Р 0,001).
Обращает на себя внимание выраженная гипервариабельность изучаемого признака, сопровождающая все анализируемые группы бактерий. Подобный факт, связанный, по нашему мнению, с множественной детерминированностью ГЛБ, указывает на необходимость более детального анализа закономерностей экспрессии гидрофобности: не только в связи с таксономической принадлежностью, но и в зависимости от источника выделения изучаемых штаммов бактерий (патовариантные отличия).
На это, то есть на то, что вариабельность гидрофобности бактериальной поверхности связана не только с видовой принадлежностью, но также с патовариантными отличиями (источником выделения), указывают данные, приведенные в таблице 20 и рисунке 26. Так, штаммы S.aureus, изолированные со слизистой носовых ходов бактерионосителей, отличались более высокой степенью гидрофобности (0,130+0,036) по сравнению с изолятами из отделяемого при гнойно-воспалительных заболеваниях (-0,176±0,059; Р 0,05). Тот же характер распределения признака, выраженный примерно в той же степени, был зарегистрирован и для коагулазоотрицательных стафилококков (0,214±0,088 против -0,119+0,143; Р 0,05). Кроме того, аналогичная закономерность обнаружена для штаммов кишечной палочки, патовары которой, обитающие на слизистых (фекальные и уропатогенные), проявляли существенно большую гидрофобность поверхности по сравнению с патоварами, выделенными из очагов гнойно-воспалительных процессов мягких тканей. Патовариантные отличия бактерий по степени гидрофоб-ности нативных бактериальных клеток.
Обозначения: ЕС - E.coli; SA - S.aureus; SE - S.epidermidis; EF - E.faecalis. ДБК - фекалии при дисбиозе кишечника; ПН - моча при пиелонефрите; ГВЗ - отделяемой из очагов гнойно-воспалительных заболеваний; БН - слизистая носа бактерионосителей; ФЗД - фекалии здоровых людей.
Энтерококки, в целом более гидрофобные, также проявляли меньшую гидрофобность поверхности, если были изолированы из раневого отделяемо 146 го или очага инфекции при гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей (0,117±0,073; для различий с другими группами энтерококков F=10,72, Р 0,05), по сравнению со штаммами, выделенными из фекалий здоровых людей (0,181±0,032). Однако для данной группы бактерий наименьшие уровни ГЛБ отмечались у штаммов, выделенных из фекалий при дисбиоти-ческих расстройствах кишечника (0,039±0,133). Описанные эковариантные отличия бактерий по гидрофобности, согласуются с данными из таблицы 19, свидетельствующими об относительно более высоком уровне гидрофильно-липофильного баланса гонококков (0,006±0,041), сальмонелл (1,546+0,177), шигелл (1,271±0,122) и клебсиелл (0,364±0,183), изолированных при инфекциях, в патогенезе которых важное место занимает феномен адгезии к слизистым оболочкам макроорганизма. Влияние эпитопа обитания/выделения бактерий, так же как и таксономической принадлежности, на их гидрофобность подтверждено при применении процедуры дисперсионного анализа и оказалось статистически значимым при высоком уровне достоверности (F= 15,99; Р 0,001). Обозначения: - представители коагулазонегативных стафилококков: S.epidermidis (18), S.cochnii (5), S.haemolyticus (12), S.simulans (1); 2 - представители других видов нейссерий, см. обозначения к таблице 19; АЛА - антилизоцимная активность; АИА - антиинтерферо-новая активность; АКА — антикомплементарная активность. Сопоставление уровней АЛА, АКА и АИА изученных бактерий с уровнем их гидрофобности (таблица 21) указывает на выраженное плейо-тропное влияние эпитопа обитания на все представленные признаки бактерий. Наиболее отчетливо данное утверждение иллюстрируется на примере сальмонелл и шигелл, изолированных из одного эпитопа при острых кишечных инфекциях. Так, высоко гидрофобные штаммы S.enteritidis и S.flexneri (ГЛБ, соответственно, 1,546±0,177 и 1,271+0,122), имели высокую антилизо-цимную (4,14±0,43 и 7,10+0,17), антикомплементарную (47,29±3,83 и 5,68±0,72) и, в случае с сальмонеллами, антиинтерцидную (2,64±0,53) активности. Для золотистых стафилококков на фоне низких значений гидрофобности, отмечались низкие значения АЛА (0,321±0,090), АИА (0,286±0,091) и относительно невысокие значения АКА (3,900+0,559).
