Отношения микроб-хозяин в биотопах толстой кишки при дисбактериозах. Алешукина, Анна Валентиновна

Введение к работе

Актуальность проблемы

Организм человека и микроорганизмы, заселяющие его, составляют единую экологическую систему. Одним из проявлений возможных нарушений этой системы являются микроэкологические изменения в биотопах кишечника, наступающие под влиянием разных факторов (облучение, стрессы, переохлаждение и перегрев, использование различных лекарственных препаратов и др.). Особое место, в этой связи, занимают антибиотики, включаемые в схемы лечения людей с различной инфекционной и соматической патологией (Шендеров Б.А,, 1998; Маянский А.Н., 1999; Барановский А.Ю. с соавт., 2008; Sullivan A. et al, 2001). Дисбактериозы ассоциированы с проявлением многих инфекционных и соматических заболеваний, способствуя хроническому течению патологических воспалительных процессов различной локализации, включая желудочно-кишечный тракт (Воробьев А.А. с соавт., 1998; Бондаренко В.М., 2011).

Вопросам дисбактериоза кишечника посвящено много обзоров в современной отечественной и зарубежной литературе. Изучены изменения состава микрофлоры, биологические особенности условно-патогенных микроорганизмов, способы коррекции дисбактериозов при различной соматической и инфекционной патологии, взаимосвязь дисбактериозов с развитием вторичных иммунодефицитов (Борисова А.М. с соавт.,1997; Банников В.К. с соавт.,1997; Минушкин О.Н. с соавт., 1999; Васильев В.Г.с соавт., 2006; Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В., 2007). Сведения о взаимоотношениях симбиотической микрофлоры кишечника и неспецифического звена иммунитета освещают проблему на организменном уровне. В тоже время, о связи дисбиотических нарушений с изменениями клеточного и гуморального природного иммунитета в различных биотопах кишечника известно крайне недостаточно (Хавкин А.И., 2003; Е.И.Ткаченко, Успенский Ю.П., 2004 и др.). Отмечена корреляция между транслокацией ЛПС грамотрицательных бактерий из просвета кишечника в системный кровоток и развитием полиорганной патологии, включая атеросклероз (Бондаренко В.М., Рябиченко Л.В., 2010; Лиходед В.Г. с соавт., 2009). Отсутствие четких данных о патогенезе дисбиотических нарушений существенно влияет на результаты их эффективной коррекции. Известно, что основным методом лечения и профилактики дисбактериозов в практическом здравоохранении остается использование пробиотиков (Воробьев А.А. с соавт., 1997; Шендеров Б.А., 1998; Минушкин О.Н. с соавт., 1999; Хорошилова Н.В., 2003; Амерханова А.М.,2009; Бондаренко В.М., 2010; Алешкин А.В., 2011 и др.). Однако, такая коррекция не всегда эффективна. Поэтому разработаны схемы коррекции дисбиотических состояний, включающие энтеросорбцию, энтеропротекцию, селективную деконтаминацию кишечника, коррекцию моторно-секреторной функции желудочно-кишечного тракта, функциональное питание и коррекцию аутохтонной микрофлоры (Хергет Х.Ф. с соавт., 1997; Гриневич Е.Б. с соавт., 2003; Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В., 2007). В схему включают также иммунобиологические препараты (Горская Е.М.с соавт., 1995; Лебедев В.В. с соавт. 2003; Соболева С. В. с соавт., 2009; В.В.Чернин с соавт., 2011).

Таким образом, качественное и количественное состояние микрофлоры различных биотопов кишечника является важным звеном системы, поддерживающей нормальный гомеостаз организма. Несмотря на значительные успехи в изучении механизмов различных дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта многие вопросы остаются малоизученными. Это касается недостаточности наших знаний о клеточных и молекулярных процессах, в том числе иммунологических, проявляющихся на местном уровне при дисбактериозе толстой кишки различного генеза, особенно при воздействии антибиотических препаратов, широкое использование которых является важной составной частью лечения инфекционных и соматических заболеваний. Остаются также малоизученными механизмы количественного и качественного изменения биологических свойств индигенной микробиоты толстой кишки и условно-патогенных микроорганизмов в процессе развития дисбактериозов. Изучение этих механизмов является актуальным, так как получение новых знаний в этой области и методов их коррекции обеспечит снижение отрицательного воздействия на макроорганизм дисбиотических состояний и будет способствовать оздоровлению населения, особенно детей разного возраста.

Цель исследования - выявление закономерностей изменения микрофлоры и специфических и неспецифических факторов иммунитета, осуществляющих местную защиту пищеварительного тракта, и разработка патогенетически обоснованных схем коррекции и профилактики дисбактериозов кишечника.

Задачи исследования:

1. Изучить основные закономерности изменений нормальной микрофлоры кишечника при дисбактериозах, обусловленных применением антибиотиков у людей и в эксперименте на лабораторных животных.

2. Проследить за изменением показателей местного и общего иммунитета, продукцией цитокинов в динамике экспериментального лекарственного дисбактериоза на мышах.

3. На модели экспериментального лекарственного дисбактериоза оценить характер изменений аллергических показателей и уровня ЛПС грамотрицательных энтеробактерий и аутоантигенов слизистой кишечной стенки (реакция лейкоцитолиза, определение иммуннокомпетентных клеток в собственной пластинке кишечника и в селезенке мышей с дисбактериозом методом простого радиального гемолиза и популяционным уровнем в кишечнике дрожжевых грибов рода Candida.

4. Разработать клинические и микробиологические критерии оценки взаимоотношений «микроб-хозяин» при дисбиозах и предложить алгоритм диагностики и коррекции микроэкологических нарушений кишечника.

5. Воссоздать экспериментально вероятный механизм снижения лактазной активности кишечной палочки при глубинном культивировании и изучить корреляцию между снижением лактазной активности эшерихий и полисахаридазной недостаточностью при дисбактериозе кишечника.

6. Экспериментально обосновать возможность использования иммунобиологических препаратов нового поколения (НМП), полученных из иммунного молозива, для коррекции дисбактериозов кишечника.

Научная новизна исследования.

Впервые при экспериментальном дисбиозе, обусловленном введением антибиотиков лабораторным животным, выявлены особенности микробиоты толстой кишки, отражающие микробиологические, иммунологические и биологические аспекты взаимоотношений микроб-хозяин.

В эксперименте установлено, что по мере развития дисбиоза кишечника биотоп толстой кишки колонизируют патогенезированные штаммы условно-патогенных микроорганизмов, обладающие различными протеолитическими факторами патогенности и персистентными свойствами, в том числе, АЛА, АКА, «АИА» и АИгА, а также эшерихии со сниженной лактазной активностью, особенно, при их транслокации в другие биотопы. Выявлено, что колонизация биотопов ферментативно-активной лактазопозитивной субпопуляцией эшерихий способствует увеличению биологически активных веществ в просвете кишечника.

Впервые экспериментально показано, что при дисбактериозе в кишечнике повышается уровень провоспалительных цитокинов, обуславливая местные воспалительные реакции, а по мере уменьшения дисбиотических нарушений в кишечнике имеет место снижение уровня провоспалительных цитокинов.

Обнаружено, что при экспериментальном дисбиозе кишечника на локальном уровне развиваются процессы аутоаллергизации за счет антигенной общности липополисахаридов грамотрицательных бактерий и аутоантигенов слизистой кишечной стенки.

Впервые показано, что аллергические проявления при дисбактериозах коррелируют как с типом вскармливания, так и с проявлениями антиэндотоксиновых реакций иммунитета на местном уровне.

Впервые установлено, что у детей раннего возраста дисфункции кишечника и развитие дисбиоза могут быть связаны с наличием ротавирусной инфекции, которая сопровождается снижением активности фермента лактазы в кишечнике. Накопление лактозы и повышение содержания лактозоотрицательных энтеробактерий, связано, по-видимому, с развитием у микроорганизмов процессов ретроградного биохимического ингибирования лактазной активности, развивающегося на фоне высокой концентрации конечных продуктов ферментации лактозы.

Экспериментально установлен новый механизм лечебно-профилактического действия лактоглобулинов против условно-патогенных бактерий путем их воздействия на цитокиновую систему макроорганизма и выявлено иммуномодулирующее действие нативных низкомолекулярных пептидов, полученных из иммунного молозивного сырья.

Представлена модель развития дисбиоза кишечника с позиции усиления транслокации ЛПС условно-патогенных энтеробактерий из просвета кишечника в подслизистую и системный кровоток, срыва антиэдотоксической иммунной защиты и развития цитокинового дисбаланса.

Теоретическая значимость работы.

На экспериментальной модели лекарственного дисбиоза кишечника показан один из вероятных механизмов развития микроэкологических нарушений в биотопах кишечника с позиции усиления транслокации эндотоксина грамотрицательных бактерий из просвета кишечника в слизистую оболочку с прорывом в лимфу и системный кровоток, ведущей к аутосенсибилизации макроорганизма.

Проведенные исследования служат теоретическим обоснованием использования лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл и низкомолекулярных пептидов молозивного происхождения для профилактики и коррекции местных воспалительных реакций через инициацию цитокинового каскада, приводящего к усилению Т-клеточной защиты кишечника.

Практическая значимость работы.

Практическая значимость исследования определяется оптимизацией диагностики и проводимой коррекции дисбиотических нарушений в кишечнике у людей разных возрастных категорий на основе комплексного клинико-лабораторного обследования с использованием подходов в изучении изменений свойств микроорганизмов и состояния местной иммунной защиты.

Предложен препарат низкомолекулярных пептидов молозивного происхождения, обладающий интерферон-стимулирующей и бифидогенной активностью, который может быть использован для профилактики дисбиозов кишечника при антибиотикотерапии.

Внедрение результатов исследования

Полученные результаты положены в основу Медицинской технологии «Технология диагностики местных метаболических и иммунологических изменений при дисбактериозах кишечника», разработанной автором совместно с д.м.н. Терновской Л.Н., к.б.н. Голошва Е.В., к.б.н. Гапон М.Н (Регистрационное удостоверение № ФС-006/264-У от 25.08.2006г).

Проведены доклинические испытания препарата НМП в эксперименте. Оформлен и направлен на экспертизу проект пакета документов для разрешения проведения 1 этапа клинических испытаний препарата НМП молозивного происхождения: Отчет о проведении доклинических испытаний; Брошюра для исследователя и Проект протокола клинических испытаний на ограниченном контингенте добровольцев.

Патенты на изобретения (в соавторстве)

1. Патент на изобретение № 2202609 Российская Федерация МПК C12N1/20 // (C12N1/20, C12R1:225), Заявка №2000125959/13 от 12.10.2000, опубликовано 20.04.2003, бюл. №11/ Питательная среда для выделения лактобактерий.

2. Патент на изобретение № 2299237 Российская Федерация МПК C12N1/14, C12R1/72, Заявка №2005116458/13 от 30.05.2005, опубликовано 20.05.2007, бюл. №14/ Питательная среда для выделения грибов рода Candida.

3. Патент на изобретение № 23 38197 Российская Федерация МПК G01N 33/53, Заявка №2006128806/15 от 08.08.2006, опубликовано 10.11.2008, бюл. №31/ Способ диагностики степени выраженности дисбактериоза кишечника.

4. Патент на изобретение № 2409678 Российская Федерация МПК C12P21/00, C07K 1/43, Заявка №2009132802/10 от 31.08.2009, опубликовано 20.01.2011, бюл. №2/ Способ получения низкомолекулярных пептидов, обладающих интерферон-стимулирующей активностью.

Результаты проведенных исследований послужили основой для лекций и практических занятий в рамках специального курса «Медицинская микробиология» и элективного курса «Патогенные бактерии в природных экосистемах» для студентов и магистров факультета биологических наук Южного федерального университета в виде учебных пособий:

1. Симбионтная микрофлора желудочно-кишечного тракта человека. Дисбактериоз и его коррекция./ Алешукина А.В., Патрушева Е.В., Голошва Е.В. /Методические указания к занятиям по медицинской микробиологии ДО и ОЗО РГУ. - Ростов – на – Дону: Издательство РГУ. - 2000. - 22с.

2. Алешукина А.В. Медицинская микробиология Учебное пособие для ВУЗов.- Ростов-на-Дону: Издательство «Феникс». - 2003. - 472с.

3. Алешукина А.В. Учебно-методическое пособие (электронный вариант) для студентов очно-заочного образования к курсу по выбору «Патогенные бактерии в природных экосистемах» - Ростов-на-Дону : официальный сайт ЮФУ. - 2009.- 48с.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При дисбактериозах кишечника на фоне снижение колонизирующей способности облигатных симбиотических микроорганизмов происходит потенциирование патогенности условно-патогенных микроорганизмов и их транслокация в несвойственные биотопы организма хозяина.

2. Одним из механизмов снижения лактазной активности эшерихий может быть подавление ее активности избытком лактозы, что приводит к накоплению неполных метаболитов, снижению рН кишечного содержимого и ретроградному ингибированию лактазной активности эшерихий.

3. Микроэкологические нарушения при дисбиозах функционируют по типу хронического воспалительного очага с той особенностью взаимоотношений микроба и хозяина, что в качестве доминирующих инфекционных агентов выступают эндогенные условно-патогенные энтеробактерии и лактозонегативные эшерихии, а в качестве основного антигена при этом действует липополисахарид, который связывается с клетками макроорганизма, что является причиной аутосенсибилизации при дисбактериозе кишечника.

4. Основные изменения иммунных механизмов при дисбактериозах происходят на локальном уровне: после введения антибиотика индуцируется цитокиновый каскад; затем продукция провоспалительных цитокинов увеличивается в связи с повышением содержания ЛПС УПЭБ; стимулируется выработка антиэдотоксиновых антител. При усилении транслокации ЛПС из просвета кишечника избыток цитокинов действует эндокринно, активируя антиэндотоксиновые механизмы в организме в целом.

5. Механизм профилактического действия НМП молозивного происхождения связан с введением в кишечник параллельно с антибиотиком ИЛ-1, который стимулирует в биотопе врожденный иммунитет и через активацию ИНФ- влияет на Т-клеточный иммунитет, тем самым сдерживая рост УПМ, уменьшает «эндотоксиновую агрессию». Содержащаяся в препарате лактоза повышает количество бифидобактерий, что также способствует снижению содержания УПЭБ, стафилококков и кандид.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора, протокол №7 от 27.12.2010 г.

Основные результаты исследовании диссертации доложены и обсуждены на 23 российских и международных конференциях, в том числе: 3-й Международной конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем» (Махачкала, 2001); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); Международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микрокроорганизмы-современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002); Международной конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010); Научно-практических конференциях VI, VII,VIII, IX, X, XI, XII, XIII ,XIV «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2003-2011); III научно-практической междисциплинарной конференции «Микроэкология человека и антимикробная терапия» (Железноводск, 2011).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 58 научных публикаций: в том числе в 15 статей, рекомендованных ВАК РФ, в других изданиях – 1, в материалах конференций - 35, в патентах на изобретение РФ – 4, в учебных пособиях – 3.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 289 страницах основного текста, содержит 59 рисунка и 57 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы из 382 наименований, в том числе 97 зарубежных и 285 отечественных работ и приложения.