Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Бактерии рода Enterobacter и их роль в инфекционной патологии человека 14
1.2. Факторы патогенности бактерий рода Enterobacter как механизмы выживания в организме хозяина 17
1.3. Взаимоотношения в системе "патоген-хозяин" и особенности иммунного ответа 28
1.4. Взаимодействие бактерий с антигенпрезентирующими клетками иммунной системы хозяина 31
1.5. Цитокиновая регуляции иммунного ответа в системе "патоген-хозяин" 37
1.6. Регуляция апоптоза микробными клетками 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 48
2.1. Микробиологические методы исследования 51
2.2. Молекулярно-генетические 60
2.3. Иммунологические 68
2.4. Статистическая обработка результатов 76
ГЛАВА 3. Собственные исследования 79
3.1. Фенотипическая характеристика биологических свойств бактерий рода Enterobacter
3.1.1. Морфологическая и культуральная характеристика бактерий
рода Enterobacter 79
3.1.2. Биохимическая характеристика бактерий рода Enterobacter 84
3.1.3. Питательная потребность бактерий рода Enterobacter (ауксо- и прототрофность) 84
3.1.4. Адгезивные свойства бактерий рода Enterobacter 87
3.1.5. Факторы, коррелирующие с патогенностью бактерий рода Enterobacter 94
3.1.6. Персистирующие свойства бактерий рода Enterobacter 105
3.1.7. Тестирование токсигенности и вирулентности бактерий рода Enterobacter на биологических моделях 111
3.2. Генотипическая характеристика биологических свойств бактерий рода Enterobacter
3.2.1. Плазмидный профиль клинических штаммов Enterobacter spp 121
3.2.2. "Островки патогенности" бактерий рода Enterobacter, детерминированные генами E.coli 130
3.3. Взаимоотношения в системе взаимодействия "патоген -хозяин" 134
3.3.1. Влияние термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей 136
3.3.2. Влияние термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на лизосомальную активность перитонеальных макрофагов мышей 140
3.3.3. Влияние термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на внутриклеточный кислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов мышей 143
3.3.4. Влияние термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на антигенпрезентирующую функцию перитонеальных макрофагов мышей 146
3.3.5. Влияние термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на пролиферативную активность лимфоцитов мышей 149
3.3.6. Влияние термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на гуморальный иммунитет мышей 152
3.3.7. Влияние термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на экспрессию мРНК цитокинов макрофагами и нейтрофилами перитонеального экссудата мышей 153
3.3.8. Изучение влияния термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на феномен апоптоза клеток перитонеального экссудата в системе "патоген-хозяин" 157
Заключение 160
Выводы 182
Практические рекомендации 184
Список литературы
- Взаимоотношения в системе "патоген-хозяин" и особенности иммунного ответа
- Цитокиновая регуляции иммунного ответа в системе "патоген-хозяин"
- Иммунологические
- Тестирование токсигенности и вирулентности бактерий рода Enterobacter на биологических моделях
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время пристальное внимание уделяется проблеме инфекционных заболеваний, вызываемых условно-патогенными энтеробактериями (УПЭ), патогенез которых недостаточно изучен. В развитии инфекционного процесса, ассоциируемого с УПЭ, безусловно, основополагающую роль играют токсины возбудителя, среди которых особый интерес представляет термолабильный (LT) энтеротоксин бактерий рода Enterobacter.
Известно, что LT-энтеротоксины УПЭ имеют сходный механизм токсического эффекта на желудочно-кишечный тракт как человека, так и животных, к разряду основных клинических проявлений которого относят диарейный симптомокомплекс на фоне выраженной интоксикации организма (A.L. Horstman, M.J. Kuehn, 2000; A.M. Al-Majali et al., 2000; C. Khursigara et al., 2001; M. Field, 2003; R. Mundy et al., 2005; J. Weckamp et al., 2005). Их местное воздействие способствует закреплению инфекта и повышает вероятность инвазии; они инициируют системные реaкции, достаточно удаленные от зоны первичной локализации (F. Qadri et al., 2005; P.A. Kenneth et al., 2006; D. Borenshtein et al., 2008; A. Masuda et al., 2008). Кроме того, выявлено, что LT-энтеротоксины УПЭ иммунологически схожи, в частности, определены сходства LT-энтеротоксинов E. cloacae и Escherichia coli (F.A. Klipstein, R.F.Engert, 1977; S.F. Jiwa et al., 1981; F. A. Klipstein et al., 1983; F. J. Pagotto et al., 2003; Hajishengallis G. et al., 2004; 2005). Вместе с тем, комплексный анализ иммунобиологических характеристик в системе «патоген-хозяин» LT- энтеротоксина Enterobacter spp. не проводился.
Течение любого инфекционного процесса тесным образом взаимосвязано с факторами и механизмами иммунной реактивности, поэтому понимание глубины патогенеза заболевания невозможно без раскрытия иммунологического контекста этой проблемы.
В преодолении защитной функции системы иммунореактивности при инфекционных процессах важную роль играют особенности реагирования клеточных факторов врожденного иммунитета в ответ на возбудителя. Одними из главных клеток врожденного иммунитета, осуществляющих первую линию защиты организма от инфекции, являются фагоциты – макрофаги, нейтрофилы, натуральные киллеры, дендритные клетки и др. (А. А. Тотолян, И.С. Фрейдлин, 2000; И.С. Фрейдлин, 2008; Н.К. Ахматова, М.В. Киселевский, 2008; И.И. Долгушин и др., 2009; S. Pasare, R. Medzhitov, 2005; M. Hausmann et al., 2005; O. Levy, 2005; C.B. Kenneth et al., 2006; A.N. Kopitar et al., 2006; S. Uematsu et al., 2006; A.J. Talati et al., 2008). В основе защитной функции указанных эффекторов лежит фагоцитарный процесс, заключающийся в их способности поглощать и уничтожать чужеродный материал (В.А. Ляшенко, 1995; C.A. Кетлинский, Н.М. Калинина, 1995; А. А. Тотолян, И.С. Фрейдлин, 2000; 2008; И.И. Долгушин и др., 2009; C.A. Jr. Janeway, R. Medzhitov, 2002).
Функциональные возможности фагоцитов могут меняться при действии разных объектов фагоцитоза (В.А. Ляшенко, 1995; И.И.Долгушин, О.В. Бухарин, 2001; М.В. Пащенков, Б.В. Пинегин, 2006; Н.Г. Плехова, 2006; Б.В. Пинегин, А.Н. Маянский, 2007; Б.В. Пинегин, М.И. Кирсанов, 2009; A.Sing et al., 2000; M.G. Paraje et.al., 2005; Л.М. Сомова, 2006; А.Н. Ильинская и др., 2007; М.И. Карсонова и др., 2007; D. Heumann et al., 2006; S.C. Eisenbarth, R.A. Flavell, 2006; T. Kawai, S. Akira 2006; S. Park et al., 2009).
Кроме того, чрезмерное воспаление, сопровождающееся избыточной продукцией и секрецией агрессивных молекул и радикалов, может привести к массивным повреждениям клеток и тканей организма (G.A. Stunczuk et al., 2003; D. Borenshtein et al., 2008).
Процесс взаимодействия патогена с клеткой хозяина вызывает развитие каскада иммунологических реакций, сопровождающихся продукцией цитокинов, спектр секреции которых зависит не только от вида бактерий, но и от их факторов патогенности (A.C. Симбирцев, 2004; Л.В. Ковальчук и др., 2005; А.Н. Маянский и др., 2007; Л.В. Ковальчук и др., 2008; C. Meserli et al., 1981; P.L. Meroni et al., 1987; G. R. Comelis, F. Van Gijsegem, 2000; S.W. Chensue et al., 2001; E.R. Kandimalla et al., 2003; O. Levy, 2005; A.J. Talati et al., 2008). Бактерии, со своей стороны, также используют разные возможности манипулирования цитокинами для своей выгоды (О.В. Бухарин и др., 2005; D.S. Merrell, S.Folkow, 2004).
В настоящее время существуют убедительные доказательства о том, что клинический исход заболевания во многом зависит от баланса секреции про- и противовоспалительных медиаторов (G.A. Stunczuk et al., 2003; S. Xanthoulea et al., 2004; D. Borenshtein et al., 2008; G. Mateolli et al., 2008).
Современное понимание особенностей иммунной реакции при инфекционных заболеваниях, вызванных энтеротоксигенными УПЭ, в частности, бактериями рода Enterobacter, невозможно без оценки функциональной активности Т- и В-лимфоцитов, так как направление дифференцировки Т-клеток в Т-хелпер – 1 (Th1)/ Т-супрессор – 1 (Тс1) или Т-хелпер – 2 (Th2)/ Т-супрессор – 2 (Tc2) тип, переключение В-клеток на продукцию классов иммуноглобулинов определяет характер и течение заболевания (А.С. Симбирцев, 2002; И.Н. Швыдченко и др., 2005; Г.Ф. Железникова, 2006; А.П. Суслов и др., 2006; Е.Г. Пономарева и др., 2007; А.Н. Маянский и др., 2007; J.M.A. Klapproth et al., 2000; B.S. Feng et al., 2008).
В настоящее время внимание исследователей привлекают вопросы изучения апопотоза эукариотических клеток, поскольку многие патогенные микроорганизмы выработали совершенные механизмы управления гибелью клеток хозяина в целях выживания (J. Moss et al., 1980; W. X. Ding et al., 2000; C. Arce et al., 2005; N. Kamado et al., 2008.). Вместе с тем, нарушение процессов инициации и реализации летальной программы клеток иммунной системы часто становится основополагающей в определении характера и тяжести течения патологического процесса. Поэтому изучение влияния LT-энтеротоксина Enterobacter spp. на апоптоз клеток иммунной системы хозяина также является актуальным.
Исходя из вышеизложенного, представляет научный и практический интерес изучение характеристики иммунобиологических возможностей LT-энтеротоксина Enterobacter spp. и сопряженных с ним иммунных реакций организма. Полученные данные помогут глубже проникнуть в фундаментальные механизмы патогенеза инфекционных заболеваний, вызываемых энтеротоксигенными Enterobacter spp., и откроют новые возможности управления ими.
На наш взгляд, представления о взаимоотношениях между паразитом и хозяином можно расширить, изучив морфологические особенности Enterobacter spp., характеристику факторов патогенности и генетические детерминанты патогенности.
Цель исследования
Дать комплексную характеристику иммунобиологическим свойствам термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter в системе взаимодействия “патоген-хозяин”.
Задачи исследования
-
Оценить фенотипические проявления факторов патогенности клинических штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с желудочно-кишечными, гнойно-воспалительными и урологическими инфекциями.
-
Провести комплексное тестирование биологических свойств клинических штаммов Enterobacter spp. и определить штаммы, обладающие факторами патогенности и являющиеся суперпродуцентами термолабильного энтеротоксина.
-
Изучить генотипическую характеристику «островков патогенности» Enterobacter spp., специфичных генам, входящим в состав патогенных кластеров E.coli и ответственных за разные этапы взаимодействия возбудителя с макроорганизмом.
-
Определить особенности иммунного реагирования на разных этапах взаимодействия энтеротоксигенных представителей рода Enterobacter в системе “патоген-хозяин”.
-
Изучить механизмы патогенного действия термолабильного энтеротоксина Enterobacter spp. на этапах формирования иммунного ответа организма хозяина.
-
Определить влияние термолабильного энтеротоксина Enterobacter spp. на апоптоз перитонеальных фагоцитов мышей.
Научная новизна
Из коллекции культур Enterobacter spp. были выделены новые 3 штамма, обладающие комплексом факторов патогенности, в частности, продуцирующие термолабильный энтеротоксин: Enterobacter gergoviae ГИСК №259 (патент РФ №2161197 от 18.11.1999), Enterobacter cloacae ГИСК №258 (патент РФ №2164942 от 13.03.2000), Enterobacter agglomerans ГИСК №257 (патент РФ №2162485 от 13.03.2000).
Впервые получены данные, характеризующие фенотипические особенности бактерий рода Enterobacter, коррелирующие с их патогенностью. Установлены различия между клетками Enterobacter spp., образующими центр колоний и имеющими размеры 1,97±0,12 мкм в длину и 0,72±0,18 мкм в ширину, и формирующими на периферии колонии так называемые «швермеры» (бродяги). Эти высокоподвижные длинные клетки имеют избыточное количество жгутиков. У высокоадгезивных штаммов Enterobacter spp. обнаружены по периметру реснички длиной 297,8±152,8 нм и шириной 4,91±0,53 нм.
Впервые проведена молекулярно-биологическая характеристика клинических штаммов Enterobacter spp. в свете новых представлений о генетических основах патогенности микроорганизмов: обнаружены гены, аналогичные с “островками патогенности” E.coli.
На основе комплексного системного анализа выявлены особенности изменения иммунной системы животных, включая оценку феномена апоптоза клеток воспалительного экссудата.
Впервые выявлен эффект иммуносупрессивного влияния термолабильного энтеротоксина на антигенпрезентирующую и процессинговую функции перитонеальных макрофагов, расшифрованы молекулярные механизмы подавления указанных функций у макрофагов, опосредованных ложной индукцией трансформирующего фактора роста- (TGF-b).
В патогенезе инфекционного процесса, связанного с термолабильным энтеротоксином, впервые определен характер модулирующего влияния токсина на макрофаги и нейтрофилы. Он способен несколько снижать продукцию интерферона- (IFN-). В то же время исследование состояния внутриклеточных механизмов микробиоцидной активности перитонеальных фагоцитов под влиянием термолабильного энтеротоксина Enterobacter spp. выявило негативное действие токсина на активность ферментов гексозомонофосфатного шунта фагоцитов, что характеризовалось резким снижением образования супероксидных анионов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные экспериментальные данные дополняют и углубляют представления о молекулярных механизмах действия термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на иммунную систему хозяина, раскрывают патогенез инфекционных процессов, обусловленных токсинпродуцирующими штаммами энтеробактерий, и создают основу для разработки этиопатогенетических принципов лечения и целенаправленной профилактики инфекционных заболеваний. Полученные данные будут полезны для своевременной коррекции иммунологических нарушений, связанных с энтеротоксинпродуцирующими штаммами условно-патогенных энтеробактерий.
Установлены маркеры вирулентности у штаммов Enterobacter spp., что позволит разработать пути целенаправленной профилактики и лечения инфекционных заболеваний, вызванных бактериями рода Enterobacter.
Отработаны оптимальные подходы для выяснения этиологической значимости бактерий рода Enterobacter, выделенных от больных с желудочно-кишечными, гнойно-воспалительными и урологическими заболеваниями.
Результаты работы расширяют экспериментальную базу для изучения патологических процессов, происходящих при острой энтеробактерной инфекции.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Патогенетические возможности клинических штаммов Enterobacter spp. определяются их способностью к адгезии, продукции цитолизинов, токсинообразованию и персистентными свойствами.
-
Генотипическая характеристика «островков патогенности» бактерий рода Enterobacter детерминирована HlyA, HlyB, papAH, papC, sfaA, sfaG генами E.coli.
-
Бактерии рода Enterobacter, выделенные из очагов поражения, включают генетически разнородные варианты, что имеет ценность для эпидемиологической оценки.
-
Патогенетическое действие термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter связано с его действием на различные этапы формирования иммунного ответа хозяина, в первую очередь, на антигенпрезентирующую функцию перитонеальных макрофагов и продукцию ими цитокинов TGF-, TNF- и IFN-.
Внедрение результатов исследования
Депонированные в ФГУН ГНИИСК имени Л.А. Тарасевича 3 штамма Enterobacter spp. (Патенты: №2161197 от 18.11.1999; №2164942 от 13.03.2000; №2162485 от 13.03.2000) используются в работе лаборатории анатоксинов «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ в качестве токсигенных тест – культур.
Результаты исследования используются в бактериологических лабораториях Детской Республиканской клинической больницы и Республиканской клинической больницы им. Г.Г. Куватова г.Уфы.
Материалы исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии; эпидемиологии и детских инфекционных болезней ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава»; на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО «ЧелГМА». Издано учебное пособие для врачей – бактериологов и клинических лаборантов «Условно-патогенные энтеробактерии» (Уфа, 2006; 2009).
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на VI конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2005); конференции «Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтическое образование» (Уфа, 2006); конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека и прикладной иммунологии» (Челябинск, 2006); V Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006), Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука – 2007» (Уфа, 2007); IX съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука–2008» (Уфа, 2008); 73-й итоговой Республиканской Научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2008), X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2008), VII Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); обсуждены на совместном заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава», Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов и ведущих сотрудников уфимского филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ.
Публикации
По теме диссертации опубликованы 45 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 227 страницах, иллюстрирована 31 таблицами и 28 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 95 отечественных и 320 иностранных источников.
Взаимоотношения в системе "патоген-хозяин" и особенности иммунного ответа
Название рода Enterobacter предложено Hormaeche Е. и Edwards Р. в 1960 году. Первоначально этот род носил название Aerobacter, и был предложен Deijerinck для подвижных и неподвижных бактерий, растущих при температуре 28 С. Когда же возникли трудности при использовании одного и того же названия для двух различных микроорганизмов, группу подвижных бактерий назвали Enterobacter [64].
Род Enterobacter является представителем семейства Enterobacteriaceae и согласно IX изданию «Определителя бактерий Берджи» включает: E.aerogenes, E.amnigenus, E.asburiae, E.cloacae, E.dissolvens, E.gergoviae, E.hormaechei, E.intermedius, E.nimipressuralis, E. sakazakii, E. pyrinus, E. kobei и E.cancerogenus [57]. Видовой состав рода до настоящего времени пополняется и в качестве новых кандидатов в его члены предложены E.cowanii, E.turicensis, E.radicincitans, E.ludwigii и E.helveticus.
Бактерии рода Enterobacter широко распространены в окружающей среде. Их выделяют из почвы, открытых водоемов и различных растений [228,231]. Они могут контаминировать питьевую воду, пищевые продукты, а также предметы обихода [306,373]. Некоторые исследователи относят Enterobacter к представителям нормальной микрофлоры кишечника, поскольку в 40-80% случаев они выделяются от здоровых людей [241].
Enterobacter spp. обнаруживаются при патологии желудочно -кишечного тракта [4,8,51,256,330,377]..По данным некоторых исследований [162], от детей с острыми кишечными заболеваниями, вызванными условно-патогенными бактериями, в 7,1 % случаев определяли Enterobacter spp. в ассоциации с ротавирусами и патогенными энтеробактериями.
Бактерии рода Enterobacter могут быть причиной менингитов [240,407]. Чаще их регистрируют у новорожденных и детей младшего возраста. Не менее 94% подобных поражений вызывает E.sakazakii [111,121,206,221,270], при котором смертность достигает 40-80%, а у выживших развиваются осложнения в виде поликистозной энцефаломаляции, дефекта нервной трубки и аномалии развития мочевыделительной системы [125,242,137].
Подобная распространенность и способность Enterobacter spp. колонизировать различные манипуляционные устройства определяют значимость их как частых возбудителей госпитальных инфекций. Начиная с конца 80—х гг. XX века их роль существенно возросла, а частота поражений, вызываемых ими, постоянно увеличивается. Клинически связанные вспышки госпитальных инфекций протекают в виде пневмоний, менингоэнцефалитов [270,319], сепсиса [151], поражения мочеполовой системы [266] с наклонностью к генерализации и развития токсико-септических процессов [41,150]. Значительное число случаев обусловлено способностью энтеробактеров контаминировать различные растворы для внутривенных вливаний, дистиллированную воду, медицинский лед, кровь и ее препараты, диагностические и лечебные устройства: интубационные трубки, катетеры, вводимые в трахею, кровеносные сосуды, мочевыводящие пути и т.д. [126,320]. Особое значение как возбудитель госпитальных поражений имеет E.cloacae [212,219].
Энтеробактеры вызывают до 5% всех поражений мочевой системы и около 10% - бессимптомной бактериурии [171]. При этом частота поражений возрастает после катетеризации.
Согласно литературным данным, среди всех видов Enterobacter spp. по частоте выделения при различных патологических состояниях превалирующее значение имеют E.sakazakii [121,221]. Этим видом вызывается от 10 до 50% всех случаев патологических состояний у новорожденных и пациентов отделений интенсивной терапии [172,227,392,391]. В некоторых исследованиях удельный вес инфекций E.sakazakii превышает таковой E.cloacae и других видов Enterobacter spp. [392]. Достаточно частое обнаружение E.sakazakii в детских молочных смесях даже при очень низких концентрациях (1-10 КОЕ/г) может вызвать вспышки некротизирующего энтероколита у детей 1 -го года жизни, в первую очередь, у недоношенных новорожденных с низкой массой тела или иммунокомпромиссных, что регламентируется в настоящее время в ряде стран на правительственном уровне [221,392].
Энтеробактеры нередко приводят к осложнениям бактериемии [119,132,160,309,341]. Поражения регистрируются во всех возрастных группах. Тем не менее, септические состояния чаще наблюдаются у пожилых лиц с заболеваниями гепатобилиарной системы, органов дыхания, с почечной недостаточностью, новообразованиями и нарушениями иммунного статуса. Основные возбудители - это E.aerogenes, E.agglomerans и E.cloacae [132,311,348,389].
В многочисленных исследованиях установлено, что в большинстве случаев возбудители входят в состав нормальной эндогенной флоры больных [383]. Около 20-30% случаев бактериемии протекает по типу микст — инфекции, наиболее часто в ассоциации с E.coli, клебсиеллами, коагулаза -отрицательными стафилококками и энтерококками [305].
В составе микробных ассоциаций энтеробактеры могут вызывать поражение кожных покровов, подкожной клетчатки, мышц и фасций [63,180,310,383]. Особую этиологическую значимость бактерии имеют в развитии подобных инфекций у ожоговых больных. Основные возбудители при этом - E.aerogenes и E.cloacae, а также E.cancerogenus.
Антибиотикорезистентность возбудителей, особенно нозокомиальных инфекций, представляет значительную терапевтическую проблему практически во всех стационарах. Энтеробактеры - это наиболее антибиотикоустойчивые бактерии семейства Enterobacteriaceae. Изоляты, выделенные от пациентов с госпитальными инфекциями, являются устойчивыми к пенициллинам [136,200], аминогликозидам [103,164], цефалоспоринам I, II и частично III поколения [298,340,392]. Более 30% штаммов E.cloacae, E.aerogenes и Е agglomerans содержат хромосомные гены, кодирующие синтез Д-лактамаз [148,414,388]. У энтеробактеров также выделены плазмидные гены, кодирующие синтез /3-лактамаз расширенного спектра групп ТЕМ, SHV и СТХ [142,288], цефалоспориназ группы CMY и карбапенемаз групп IMP и VIM [173,243].
Таким образом, из представленного обзора видно, что отмечается тенденция к нарастанию заболеваний, вызванных Enterobacter spp. Энтеробактеры выделяются при острых кишечных заболеваниях, патологии респираторного тракта, инфекциях мочевых путей, при новообразованиях, сепсисе и внутрибольничных инфекциях. По данным литературы, энтеробактеры резистентны к пенициллинам, цефалоспоринам и аминогликозидам, что связано с наличием ферментов, которые ингибируют фармакотерапевтические возможности современных антибиотиков.
1.2. Факторы патогенности бактерий рода Enterobacter как механизмы выживания в организме хозяина
Под патогенностью принято понимать способность микроорганизмов вызывать заболевание, которое определяется совокупным действием различных свойств или факторов патогенности, обуславливающих развитие в организме патологических изменений [7].
Как известно, факторы патогенности (ФП) микроорганизмов подразделяются на 4 группы: 1)определяет взаимодействие бактерий с эпителием соответствующих экологических ниш и колонизацию зоны первичного инфицирования; 2)обеспечивает устойчивость микробов к факторам защиты макроорганизма и способность к размножению in vivo; 3)индуцирует синтез цитокинов и медиаторы воспаления, способствующие иммунопатологии; 4)токсины и токсические продукты, вызывающие патологические изменения в органах и тканях макроорганизма [7]. Взаимодействие микроорганизма с клетками хозяина начинается с адгезии, основанной на избирательном взаимодействии бактерий с рецепторами эпителиоцитов с последующим размножением (колонизацией) бактерий на поверхности слизистой [40,139,246,368]. У большинства грамотрицательных бактерий адгезины собраны в поверхностные пили (pili) и завитки (curli) или ассоциированы с нефимбриальными адгезинами: полисахаридами капсул, липополисахаридами наружной клеточной стенки, липотейхоевыми кислотами или поверхностными белками [110,188].
Энтеробактеры образуют комплекс фимбриальных адгезинов. У 70-80% Enterobacter spp. обнаружены маннозочувствительные и маннозорезистентные гемагглютинины, обуславливающие склеивание эритроцитов различных животных и птиц. Их фенотипическая экспрессия строго коррелирует с образованием фимбрий Р 1-го и 3-го типов, обеспечивающих адгезию бактерий и быструю колонизацию самых разнообразных поверхностей, в том числе мембран клеток [307,308].
Маннозозависимые фимбрий 1-го типа представлены тонкими ригидными структурами, характерными для всех представителей семейства Enterobacteriaceae. Они состоят из основного белка FimA и адгезионов FimG и FimH [182,233,387]. Фимбрий 1-го типа, обнаруживаемые у бактерий рода Enterobacter, принадлежат к двум антигенным группам: 1) E.cloacae, Е. aerogenes, Е. sakazakii, Е. amnigemis; 2)Е. intermedium.
В работах у Old D.C. и Adegbola R.A. [307] было показано, что штаммы E.cloacae, обладающие фимбриями 1-го типа, являются патогенными и обнаруживаются при заболеваниях мочевыводящих путей и респираторного тракта.
Цитокиновая регуляции иммунного ответа в системе "патоген-хозяин"
Сложные механизмы взаимодействия между патогеном и хозяином обусловлены многообразием факторов иммунной защиты макроорганизма и секретируемыми молекулами патогенности возбудителя.
Принцип множественности и разнообразие факторов защиты реализуется, с одной стороны, факторами врожденного иммунитета, а с другой, - формированием специфического клеточного и гуморального иммунного ответа [24,28,34,].
Врожденный иммунитет является филогенетически более древней линией защиты организма от патогенов, который обеспечивает распознавание, элиминацию микроорганизмов и выработку сигналов, обусловливающих формирование специфического иммунного ответа [37,38,42].
Центральную роль в инициации врожденного иммунитета выполняют антигенпредставляющие клетки (АПК) - макрофаги, нейтрофилы, моноциты, дендритные клетки и др. [35,36,59,60,62,71,89]. Они снабжены мощным рецепторным аппаратом, осуществляющим избирательное распознавание консервативных структур и молекул микробных патогенов. Это обеспечивает их направленную нейтрализацию и конечную элиминацию.
В процессе взаимодействия патогена и хозяина наблюдается синтез и секреция цитокинов разных классов. Цитокины оказывают плейотропные биологические эффекты на различные типы клеток, регулируя реакции врожденного иммунитета и направляя развитие адаптивного иммунного ответа [26,44,73,81,96,216,220,390].
Инструментами адаптивного иммунитета являются Т- и В-лимфоциты. Деление иммунитета на клеточный и гуморальный весьма условное, поскольку реакция иммунной защиты всегда осуществляется при одновременной активации Т- и В-клеток. Активированные Т-лимфоциты
(Th) в целях уничтожения инфекции могут действовать в нескольких направлениях. Цитотоксические Т-клетки атакуют и лизируют клетки хозяина, экспрессирующие на своей поверхности инородные антигены. Хелперные Т-клетки — ТЫ запускают клеточный механизм иммунного ответа, Th2 - гуморальный [81,82,85,89].
Неоценимую роль в осуществлении межклеточных контактов выполняют цитокины. Они служат связующим звеном между механизмами врожденного и адаптивного иммунитета. Отмечено, что характер и исход многих инфекций зависит от способности возбудителя, его компонентов и продуктов индуцировать синтез разных классов цитокинов, в частности, IL-12 [100].
Это обстоятельство и определяет набор механизмов бактерийного выживания, позволяющих противостоять механизмам иммунитета хозяина. Так, стратегия переживания бактериями неблагоприятных условий в макроорганизме включает следующие механизмы: «тайное присутствие» (stealth), позволяющее патогену избежать немедленного распознавания иммунной системой хозяина, «саботаж» (повреждение механизмов иммунной защиты) и «эксплуатацию», то есть, использование механизмов иммунитета в своих интересах [28].
Недавно раскрыт еще один важный механизм взаимодействия в системе «патоген-хозяин» — способность бактерий изменять свое «поведение» в организме хозяина в зависимости от численности собственной популяции — так называемое «чувство кворума». Сенсорные белки бактерий активируются только при достижении определенного уровня специальных химических сигналов, поставляемых самими бактериями в количестве, пропорциональном их плотности. Активированные сенсорные белки включают транскрипцию генов факторов патогенности возбудителя, что и t служит сигналом к атаке на клетки хозяина [28,48].
Спектр механизмов бактерийного выживания в последнее время расширился за счет способности микробных патогенов регулировать процесс апоптоза или запрограммированную форму клеточной гибели, что является необходимым этапом вызванного ими инфекционного процесса.
У микробов постоянно меняются факторы вирулентности, в результате чего им удается ускользнуть от эффектов врожденного и приобретенного иммунитетов. Это обусловлено генетическими элементами типа IS-последовательностей, бактериофагами и плазмидами, которые обеспечивают условия перехода комменсальных сапрофитов УПЭ в агрессивные агенты, нарушающие естесственную резистентность хозяина [39].
Иммунный ответ хозяина имеет свои некоторые особенности, когда в качестве возбудителя выступают условно-патогенные энтеробактерии. Это связано с тем, что представители бактерий семейства Enterobacteriaceae являются составляющими фон нормальной микрофлоры в экологической нише кишечника человека и при снижении резистентности организма могут вызывать заболевания, для которых характерно отсутствие нозологической специфичности и локализации инфекционного процесса. Поэтому в настоящее время остро стоит вопрос, касающийся условий перехода непатогенных и УПЭ в патогенные, а также лежащих в этой основе определенные молекулярные механизмы взаимоотношений в системе «хозяин-паразит» [83].
Оценивая в целом фундаментальный характер проблемы по изучению особенностей взаимоотношений между микро- и макроорганизмом, следует подчеркнуть актуальность и необходимость всестороннего комплексного изучения фенотипических признаков факторов патогенности, генотипических характеристик структур, входящих в состав «островков патогенности», а также особенностей механизмов взаимного реагирования и защиты иммунного ответа хозяина при инфекциях, связанных с УПЭ и имеющих известные ключевые факторы патогенности. Это позволит на основании имеющихся данных уже сегодня выявить наиболее уязвимые звенья в цепи патогенеза заболеваний и выбрать оптимальные стратегии этиопатогенетического лечения и профилактики заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae.
Иммунологические
Исследование энтерогемолитической активности клинических штаммов Enterobacter spp. показало, что 20 (9,2%) штаммов Enterobacter spp. обладали энтерогемолитической активностью.
Наиболее высокими значениями энтерогемолитической активности характеризовались штаммы Enterobacter spp., изолированные от больных с желудочно-кишечными инфекциями. При этом высокая активность отмечалась у 3 (6,1%) штаммов против 0 контроля, средняя - у 4 (8,2%) против 0 контроля, низкая - у 5 (10,2%) против 3 (8,1%) контроля (р=0Д052), неактивных- 19 (75,5%) штаммов против 34 (91,9%) контроля (р=0,5445).
Результаты согласуются с данными Beutin I. et al. [128] о способности E.coli и Proteus spp., выделенных при желудочно-кишечных инфекциях, продуцировать энтерогемолизин.
Наименее выражен этот показатель среди штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с гнойно-воспалительными процессами, поскольку эти штаммы обладали только низкой активностью — 3 (7,7%). Следует отметить, что среди штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с урологическими инфекциями, 1 (2,3%) штамм обладал высокой активностью и 1 (2,3%о) штамм средней активностью. В группе контроля активных штаммов Enterobacter spp. не было.
Изучение силы влияния среды обитания на энтерогемолитическую активность штаммов Enterobacter spp. не выявило статистически значимой зависимости.
Таким образом, сила влияния экологического фактора на энтерогемолитическую активность клинических штаммов Enterobacter spp. оказалась крайне слабой.
Результаты данного раздела исследований свидетельствуют о том, что клинические штаммы Enterobacter spp. способны продуцировать а-гемолизин, синтезировать тиолзависимый и энтерогемолизин, каждый из которых играет определённую роль в развитии инфекционного процесса различной локализации.
Известна способность условно-патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae деполимеризовать нуклеиновые кислоты. Однако в доступной нам литературе мы встретили лишь единичные сообщения, касающиеся ДНК-азной активности бактерий рода Enterobacter spp.
Установлено, что 59 (27,1%) штаммов Enterobacter spp. обладают ДНК — азной активностью.
Наиболее высокая ДНК-азная активность была у штаммов Enterobacter spp., изолированных от больных с инфекциями желудочно-кишечного тракта. При этом высокая активность отмечалась у 13 (26,5%) штаммов против 0 контроля, средняя-у 10 (20,4%) против 1 (2,7%) контроля (р=0,0171), низкая - у 7 (14,3%) против 3 (8,1%) в контроле (р=0,377), неактивными были — 19 (38,8%) против 33 (89,2%) ( =4,63; р 0,001). Полученные результаты согласуются с данными Поликарпова Н.А. с соавт. [74]. Наименее выражен этот показатель среди штаммов Enterobacter spp., выделенных при урологических инфекциях. Так, высокой активностью обладал 1 (2,3%) штамм против 0 контроля, средней активностью - 3 (6,8%) против 0 контроля, низкой активностью - 4 (9,1%) против 5 (20%) контроля (р=0,2008), неактивными были - 36 (81,8%) штаммов против 20 (80%) контроля (р=0,8548). Среди штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с гнойно-воспалительными процессами, высокую активность имели 2 (5,1%) против 0 контроля, среднюю активность 5 (12,8%) против 0 контроля, низкую активность 4 (10,3%) против 4 (4,2%) контроля (р=0,3889), неактивных штаммов было 28 (71,8%) против 23 (95,8%) контроля (р=0,0217). Результаты изучения ДНК-азной активности штаммов Enterobacter spp. в зависимости от источника выделения представлены в табл.
Показатели силы экологического влияния на ДНК-азную активность штаммов Enterobacter spp. По оси абсцисс: 1 - штаммы Enterobacter spp., выделенные с инфекцией желудочно-кишечного тракта; 2 - штаммы Enterobacter spp., выделенные при урологических инфекциях; 3 - штаммы Enterobacter spp., выделенные при гнойно-воспалительтных процессах; по оси ординат - показатели силы влияния экологического фактора (%).
Лецитиназная активность, наряду с гемолитическими и протеолитическими активностями микроорганизмов, относится к факторам патогенности, что является важным показателем вирулентности выделенных клинических штаммов УПЭ.
Результаты исследования показали, что из 218 штаммов Enterobacter spp. 22 (10,1%) обладают лецитиназной активностью.
В зависимости от источника выделения лецитиназную активность проявляли штаммы Enterobacter spp., выделенные при желудочно-кишечных инфекциях. Так, штаммы Enterobacter spp. с высокой активностью составили 1 (2,1%) против 0 контроля, со средней - 3 (6,1%) против 0 контроля, с низкой - 2 (4,1%) против 0 контроля, неактивных штаммов было 43 (87,8) против 37 (100%.) контроля ( =0,068; р=0,79).
Среди культур Enterobacter spp., выделенных от больных с гнойно-воспалительными процессами, высокой активностью обладали 4 (10,3%) штамма против 0 контроля, средней активностью - 2 (5,1%) против 0 контроля, низкой активностью - 2 (5,1%) против 0 контроля, неактивные - 30 (79,5%) против 24 (100%) контролей ( =0,26; р=0,61).
У штаммов Enterobacter spp., изолированных при урологических инфекциях, высокая активность определялась у 2 (4,5%) штаммов против 0. контроля, средняя активность - у 4 (9,1%) против 0 контроля, низкая активность - у 1 (2,3%) против 0 контроля, неактивных штаммов - 38 (84,1%) против 25 (100%) контроля ( =0,052; р=0,81). Результаты изучения лецитиназной активности штаммов Enterobacter spp. в зависимости от источника выделения представлены в таблице 13.
По-видимому, низкие показатели лецитиназной активности у Enterobacter spp., изолированных из мочи и кала при соответствующих заболеваниях, отражают результат приспособления бактериальных популяций к специфическим условиям среды обитания, что связано с отсутствием в данной среде тканевого лизоцима.
Изучение силы экологического влияния на лецитиназную активность Enterobacter spp. показало, что более подверженными экологической детерминации оказались штаммы Enterobacter spp., выделенные при желудочно-кишечных инфекциях (772=22%, F=24,8; р 0,001). Это, возможно, отражает результат приспособления бактериальных популяций к специфическим условиям среды экониш (табл. 14).
Тестирование токсигенности и вирулентности бактерий рода Enterobacter на биологических моделях
Коэффициент влияния экологического фактора на ДНК-азную активность была высокой у штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с инфекциями желудочно-кишечного тракта, и составила К] =11,8% (F=19,5;p 0,001).
В настоящее время ДНК-азы рассматривают не только как группу ферментов, участвующих в репликации ДНК, но и как фактор персистенции, способствующий адаптации микроорганизмов к изменяющимся условиям окружающей среды.
Доказана связь активности ДНК-азы условно-патогенной микрофлоры с их вирулентностью [65].
Лецитиназная активность Enterobacter spp. была определена у 59 (27,1%) штаммов, среди которых штаммы Enterobacter spp. с высокой лецитиназной активностью, были выделены от больных с гнойно-воспалительными процессами. Сила экологического влияния на лецитиназную активность Enterobacter spp. оказалась выше у штаммов Enterobacter spp., выделенных при инфекциях желудочно-кишечного тракта (7j2=22%, F=24,8; р 0,001). Это, возможно, отражает результат приспособления бактериальных популяций к специфическим условиям среды экониш.
В целях самосохранения бактериальные клетки обладают защитными механизмами дистанционного действия, которые благоприятствуют их выживанию. В этом отношении были изучены фенотипические признаки способности инактивировать лизоцим, лейкоцитарный интерферон и комплемент.
Результаты показали, что среди 218 клинических штаммов Enterobacter spp. АЛА обладали 87 (40%), АИА - 56 (25,7%) и АКА - 65 (29,8%) штаммов. Частое обнаружение антилизоцимного и антиинтерферонового признака у Enterobacter spp., выделенных при инфекциях желудочно 165 кишечного тракта, обусловлено, с одной стороны, индукцией продуктами экзокриноцитов (клетками Панета с ацидофильными гранулами), а, с другой, - тканевых структур кишечника. Способность бактерий противостоять факторам врожденного иммунитета дает возможность неограниченно долго удерживаться в данной экологической нише [14].
По определению Бухарина О.В. [14], персистенция микроорганизмов — это форма симбиоза про- и эукариотических клеток, характеризующаяся длительным сосуществованием симбионтов. В условиях инфекции это положение находит отражение в формировании бактерионосительства, персистентных инфекций, хронизации процесса, когда возбудителю удается обеспечить себе сохранение (переживание) в организме хозяина.
Способность бактерий продуцировать токсин тесным образом связана с патогенетической значимостью возбудителя при развитии ряда инфекционных заболеваний. В литературе имеются сообщения об энтеротоксигенной способности Enterobacter spp. [41,247,248], при этом исследования, направленные на выявление способности Enterobacter spp. вырабатывать токсины, немногочисленны и противоречивы [3]. Рутинным подходом к определению токсигенности и вирулентности служат биологические пробы, которые, однако, имеют ряд недостатков, связанных с необходимостью использования лабораторных животных, трудоемкостью, но, вместе с тем достаточно полно отражают этиологическую значимость предполагаемого возбудителя. В связи с этим, было проведено тестирование клинических штаммов Enterobacter spp. с использованием модели «плантарного теста», «интраназального инфицирования» беспородных белых мышей и определение протистоцидной активности на токсигенность и вирулентность.
В результате постановки теста «отек лап» у мышей лишь 17 (7,8%) исследованных культур Enterobacter spp. давали положительный результат. Наибольшей активностью в этом тесте характеризовались 9 (18,4%) культур, выделенных от больных с желудочно-кишечными инфекциями. Показатели у культур Enterobacter spp., выделенных при инфекциях мочевыделительной системы, были сопоставимы с результатами культур, изолированных при гнойно-воспалительных процессах, соответственно 4 (9,1%) и 4 (10,3%) (rf=l,607; р=0,446). Ни один из штаммов Enterobacter spp., изолированных от здоровых людей, не вызывал появления визуально определяемой отечности лап.
Полученные результаты свидетельствуют о способности клинических штаммов Enterobacter spp. синтезировать термолабильное токсическое вещество, обусловливающее развитие «отека лапки» у белых мышей, что совпадает с вирулентностью, поэтому плантарный тест может быть использован в качестве биологической модели для выявления LT-энтеротоксигенности бактерий рода Enterobacter.
Среди клинических штаммов Enterobacter spp., давших «отек лапки», центрифугат 3 штаммов оказался способным давать отек лапки мышей с разницей к интактной лапки до 80 мг. На основании полученных результатов 3 штамма Enterobacter spp., были депонированы в ФГУН ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича, как продуценты LT-энтеротоксина (патенты РФ: №2161197 от 18.11.1999; №2164942 от 13.03.2000; №2162485 от 13.03.2000).
В следующей серии опытов для подтверждения способности клинических штаммов Enterobacter spp. продуцировать LT-энтеротоксин был использован метод «лигированная петля тонкого кишечника кролика».
Было выявлено 20 (9,2%) культур Enterobacter spp., вызывающих накопление экссудата в просвете тонкого кишечника кролика. При этом наибольшей активностью обладали штаммы Enterobacter spp., выделенные от больных с желудочно-кишечными инфекциями - 9 (18,4%).
Сила влияния экологического фактора на показатели V/L была низкой и не имела статистически значимых различий.
Для проверки способности бактерий рода Enterobacter продуцировать ST-энтеротоксин был использован тест на мышах-сосунках. Результаты были отрицательные. Согласно литературным данным, частота продукции ST-энтеротоксина бактериями рода Enterobacter невысокая [Klipstein, F.A., 1976]. Возможно, причины отрицательного результата кроются в этом.
Для установления патогенного потенциала у клинических штаммов Enterobacter spp. был использован тест «легочной модели». Среди 218 клинических штамма Enterobacter spp. 54 (24,8%) вызывали гибель экспериментальных мышей.
Патогенный потенциал был наиболее выражен среди культур, выделенных при инфекциях желудочно-кишечного тракта.
При определении силы влияния экологического фактора на показатели интраназального теста обнаружено, что штаммы Enterobacter spp., выделенные от больных с желудочно-кишечными инфекциями и гнойно-воспалительными процессами, находились в одинаковой зависимости от условий обитания, где сила влияния экологического фактора составила соответственно 72=8,6% (F=16,8; р 0,001) и /2=8,6% (F=13,5; р 0,001).
Проведенные нами исследования на различных биологических моделях экспериментальной инфекции показали, что интраназальное заражение и плантарный тест требуют значительного количества экспериментальных животных, поэтому не всегда выполнимы в условиях бактериологической лаборатории.
В связи с этим была использована модель P.caudatum, на основании которой выявлен 61 (27,9%) клинический штамм Enterobacter spp., вызывающий гибель простейших.
