Введение к работе
Актуальность работы. Интерес к термофильным микроорганизмам, которые активно исследуются последние два десятилетия, определяется задачами как фундаментального, так и прикладного характера. Последние в основном связаны с наличием у термофильных прокариот термостабильных ферментов и возможностью их применения в различных областях биотехнологии. Многие микробиологические и биохимические исследования посвящены органотрофным термофильным бактериям, в том числе обладающим способностью к гидролизу различных биомолекул. К ним относятся анаэробные умеренно-термофильные органотрофные бактерии, впервые описанные как представители рода Clostridium, но затем отнесенные к родам Thermoanaerobacterium и Thermoanaerobacter (Lee, 1993). В настоящее время в род Thermoanaerobacter входит 14 видов, выделенных из различных мест обитания: горячих источников (Zeikus et al., 1979), цианобактериальных матов (Бонч-Осмоловская и др., 1997), вулканических озер (Slobodkin et al., 1999), высокотемпературных нефтяных пластов (Cayol et al., 1995) и др. Это умеренные термофилы, облигатные анаэробы с бродильным типом метаболизма, способные в процессе брожения восстанавливать различные неорганические акцепторы электронов - серу, тиосульфат, окисное железо. Экстремально- термофильные организмы, первоначально отнесенные к этому роду (Xue et al., 2001; Kim et al., 2001), впоследствии реклассифицированы как представители нового рода Caldanaerobacter (Fardeau et al., 2004). Представители родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter оказались способными к синтезу протеиназ с новыми, ценными для биотехнологии свойствами (Riessen et al., 2001, Jang et al., 2002). Однако можно предположить, что разнообразие метаболических свойств и биотехнологический потенциал этих микроорганизмов еще далеко не исчерпаны. Это делает актуальным детальное исследование распространения и метаболического разнообразия термофильных бактерий, относящихся к родам Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter.
Цель работы. Целью данной работы являлось исследование распространения и разнообразия бактерий рода Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter молекулярно-биологическими методами.
Основные задачи исследования состояли в следующем:
1. Разработка методов молекулярной детекции и/или идентификации
термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter;
2. Детекция термофильных бактерий рода Thermoanaerobacter и
Caldanaerobacter в накопительных культурах и природных образцах;
3. Идентификация изолятов, фенотипически сходных с Thermoanaerobacter и
Caldanaerobacter, но имеющих новые для этих родов свойства;
4. Выделение и характеристика новых представителей этих таксонов;
5. Характеристика ферментативных активностей и/или генов, кодирующих
новые ферменты, у бактерий группы Thermoanaerobacter/Caldanaerobacter.
Научная новизна. Впервые разработаны олигонуклеотидные зонды для детекции и идентификации бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter. Доказана их высокая специфичность, что позволяет детектировать представителей Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter непосредственно в накопительных культурах и природных образцах, а также идентифицировать штаммы без необходимости культивирования.
Полученные результаты расширяют представление о распространении и физиологии термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter. В то время как все известные ранее виды родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter являлись нейтрофилами с минимальным рН роста 4.7, нами были идентифицированы как представители рода Thermoanaerobacter два анаэробных ацидофильных штамма, способные развиваться при рН 3.5. Впервые бактерии рода Thermoanaerobacter были обнаружены в пробах из глубоководных гидротерм. Впервые для термофильных прокариот установлена способность микроорганизмов родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter к гидролизу агарозы.
Установлено, что некоторым представителям рода Caldanaerobacter свойственна способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода. Сравнительное исследование генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии, проведённое с помощью ПЦР с разработанными нами праймерами, показало их своеобразие у представителей Caldanaerobacter на фоне единства организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов. Полученные данные подтверждаются результатами анализа полных геномов анаэробных кабоксидотрофов.
Практическая ценность работы. Разработанные нами олигонуклеотидные зонды позволяют идентифицировать представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных и чистых культурах, минуя стадии определения фенотипических дескрипторов, а также детектировать их в природных образцах. Полученные данные важны для развития представлений о распространении и физиологии родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter. Разработанный нами метод может быть использован для экспресс-детекции изолятов, в том числе при поиске представителей новых филогенетических групп.
Описанные нами агаролитические штаммы могут быть использованы для получения термостабильной агаразы с целью ее применения в молекулярной биологии для освобождения нуклеиновых кислот и белков из тугоплавких агарозных гелей.
Разработанные нами методы детекции генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии могут быть использованы для исследования экологии и распространения водородобразующих СО-трофов.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на IV Международном Конгрессе «Экстремофилы-2002» (Италия, Неаполь, 2002), 1-ом Международном FEMS Конгрессе Европейский микробиологов (Словения, Любляна, 2003), XV Международной зимней молодежной научной школе (Москва, 2003), VII Международной конференции «Термофилы-2003 (Экзетер, Англия), V
Международном Конгрессе «Экстремофилы-2004» (США, Мэрилэнд, 2004), VIII Международной конференции «Термофилы-2005» (Серфере Парадайс, Австралия, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи, 9 тезисов, 1 статья находится в печати.
Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей глав, обсуждения и выводов, изложенных на страницах печатного текста и включает таблиц и рисунков.
Место проведения работы и благодарности. Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Некоторые этапы работы были выполнены в лаборатории Центра Биоинженерии РАН под руководством к.б.н. Банниковой Г.Е. Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов был проведен совместно с к.б.н. А.В. Лебединским (НИМИ РАН). Определение состава Г+Ц пар в ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию выполняли совместно с к.б.н. Н.А. Черных (ИНМИ РАН). Анализ последовательностей 16S рРНК чистых культур микроорганизмов, а также ПЦР продуктов проводили совместно с к.б.н. Т.В. Колгановой (Центр Биоинженерии РАН) и к.б.н. Т.П. Туровой (ИНМИ РАН). Электронную микроскопию чистых культур микроорганизмов выполнила Н.А. Кострикина (ИНМИ РАН).
Автор выражает благодарность к.б.н. Н.А. Черных за помощь в освоении молекулярных методов, а также к.б.н. А.В. Лебединскому за постоянное внимание, советы и помощь на всех этапах молекулярной работы. Особенно признателен автор научному руководителю д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за интересную тему, обсуждение результатов, ценные советы и замечания на всех этапах работы.
