Содержание к диссертации
Список сокращений..... 5
Введение 7
1. Обзор литературы 10
1.1 Пропиновокислые бактерии 10
Классификация 10
Общая характеристика классических пропионовокислых бактерий 11
Морфология 12
Анатомия 13
Питательныевые потребности 13
Брожение, осуществляемое пропионовокислыми бактериями 13
Синтез витамина Bi2 16
Применение пропионовокислых бактерий 18
Мутагены и мутагенез. Классификация мутагенов 18
Антимутагенез. Классификация антимутагенов 23
Свойства и критерии оценки антимутагенов 27
Бактериальный антимутагенез - новое важное направление в микробиологии 29
1.4 Антимутагенные свойства бактерий 30
Антимутагенные свойства молочнокислых и бифидобактерий 30
Антимутагенез пропионовокислых бактерий 32
1.5 Методы определения мутагенных и антимутагенных свойств химических
соединений 34
1.6 Стрессы и регуляция стрессовых ответов 36
Системы сигнализации 36
Перекрывание антисрессовых ответов 37
Молекулярные шапероны 37
Тепловой шок 38
Низкотемпературный шок 41
Кислотный шок ..42
Окислительный стресс 45
Осмотический шок 50
2. Экспериментальная часть 54
2.1 Материалы 54
Реактивы 54
Буферные системы 55
Сорбенты 56
Среда для выращивания пропионовокислых бактерий, способствующая включению радиоактивных аминокислот 56
Рабочая субстанция 56
Приборы и оборудование 57
Источники мутагенов 57
Подготовка микросомальной активирующей смеси (S-9 mix) 61
Источники антимутагенов 61
Тест-культуры 62
Условия роста культур 62
Растворы используемые для постановки теста Эймса 63
2.2 Методы 64
Фракционирование клеточного экстракта сульфатом аммония 64
Обработка растворов сульфатных фракций PMSF 64
Концентрирование белкового раствора (1) 64
Концентрирование белкового раствора перед электрофорезом (2) 64
Электрофорез 64
Двумерный электрофорез 65
Введение радиоактивной метки - 65
Хроматографические методы 66
Определение аминокислотной последовательности белка с N-терминального участка молекулы 66
Определение концентрации белка и содержания нуклеиновых кислот 67
Определение гомогенности препаратов методом ВЭЖХ 67
Определение молекулярной массы белков 67
Определение биологической активности белковых фракций 67
Постановка модифицированного теста Эймса с использованием индикаторных штаммов Salmonella typhimurium 69
3. Результаты 72
3.1 Защитные и реактивирующие свойства пропионовокислых бактерий 72
Фракционирование на DEAE-сефарозе 72
Гель-фильтрация на сорбенте G-75 75
Изучение физико-химических характеристик очищенного белкового препарата 77
3.1.4 Изучение зависимости протекторной активности белка от его концентрации в отношении клеток
Е. coli, инактивированных УФ-светом 80
3.1.5 Изучение реактивирующего эффекта белка в отношении действия желчных кислот и теплового
стресса 81
3.2 Антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий» 82
Проверка генотипа тест-штамма 83
Исследование влияния компонентов сред на антимутагенную активность бактерий, используемых для их выращивания 85
Изучение влияния различных факторов на АМ-активность бактерий 85
а) Исследование АМ-эфекта в зависимости от возраста исследуемых культур 88
б) Изучение влияния концентрации микросомальной активирующей смеси на выражение АМ-эффекта .. ..88
в) Изучение влияния типа регистрируемой мутации на выражение АМ-эффекта 92
3.2.4 Антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий 94
а) Скрининг штаммов пропионовокислых бактерий в связи с их антимутагенной активностью 94
б) Антимутагенное действие культуральной жидкости и клеток в отношении мутагенеза, индуцируемого
азидом натрия 96
в) Антимутагенное действие культуральной жидкости и клеток в отношении мутагенеза, индуцируемого
2-НФ. 97
г) Антимутагенное действие культуральной жидкости и клеток в отношении мутагенеза, индуцируемого
4-НХО 98
д) Антимутагенный эффект культуральной жидкости и клеток P. freudenreichii subsp. shermanii KM 103 и
P.freudenreichii subsp. freudenreichii KM 133в отношении мутагенеза, индуцируемого H202, BAP, PhiP ...99
з) Антимутагенный эффект культуральной жидкости и клеток P. freudenreichii subsp. shermanii KM 103 в
отношении мутагенеза, индуцируемого МННГ и9-АА 106
Исследование механизма АМ-действия эффект культуральной жидкости и клеток P.freudenreichii subsp. shermanii KM 103 вотношении мутагенов, индуцирующих мутации замены пар оснований у тестерного штамма S. typhimurium ТА 100 107
Изучение влияния нагревания, диализа и протеолиза на антимутагенное действие культуральной жидкости P. freudenreichii subsp. shermanii KM 103 и. A freudenreichii subsp. freudenreichii KM 133 108
Изучение АМ-свойств представителей другигих видов бактерий 110
4. Обсуждение результатов 113
Антистрессовые свойства пропионовокислых бактерий 113
Антимутагенные свойства пропионовокислых бактерий 115
Выводы 120
Список литературы 121
Список сокращений
А280 - поглощение при длине волны, равной 280 нанометрам
А260- поглощение при длине волны, равной 260 нанометрам
9-АА - 9-аминоакридин
Акт. - биологическая активность
AM - антимутаген
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ИД - индекс деления
Конц-я белка, мг/мл, В. - концентрация белка, определенная
спектрофотометрическим методом Варбурга-Кристиана
Конц-я белка, мг/мл, Л. - концентрация белка, определенная методом Лоури
МННГ - М-метил-М-нитро-Ы-нитрозогуанидин
НК - нуклеиновые кислоты
2-НФ - 2-нитрофлуорен
4-НХО - 4-нитрохинолин-1-оксид
Пост - постзащита или реактивирующее действие
Пред и Пр - предзащита или защитное действие
Трис - трис(оксиметил)аминометан
ЭГ - этиленгликоль
ВАР - бенз(а)пирен
СА - сульфат аммония
CHAPS - 3[(3-холамидопропил) диметиламмоний]-1-пропансульфонат
СВВ - кумасси бриллиантовый голубой
DEAE - диэтиламиноэтил
DMSO - диметилсульфоксид
DTT - дитиотреитол
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
IPG — иммобилизованный рН градиент
PMSF - фенилметансульфонилфторид
PhiP - 2-амино-1метил-5-фенилимидопиридин
PSA - персульфат аммония
PVDF - поливинилдифлуорид
SDS - додецилсульфат натрия
SDS PAGE_- электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата
натрия
S-9 mix - микросомальная активирующая смесь
TEMED - тетраметилэтилендиамин
UV или УФ - ультрафиолетовое облучение
Введение к работе
Человек является частью природы. Влияние человека на среду обитания всегда зависело от этапа развития цивилизации, исторической и географической ситуации.
На данном этапе прогресс сопровождается глобальными экологическими нарушениями и изменениями. Особое внимание вызывает загрязнение окружающей среды факторами, не свойственными биосфере в норме, что не только превосходит компесаторные возможности природы, но влияет на здоровье людей и уже сейчас может нанести ущерб будущим поколениям. Антропогенное загрязнение мутагенами окружающей среды приводит к увеличению частоты мутаций у микроорганизмов, растений, животных и человека; При этом особенно опасным представляется то обстоятельство, что большинство мутаций рецессивны, то есть они не проявляются в фенотипическом состоянии. Отсутствие фенотипических проявлений позволяет таким мутациям избегать действия естественного отбора и незаметно распространяться Вт популяциях, постепенно накапливаясь. Каждое поколение получает от предыдущего определенное количество мутаций и на протяжении своей жизни в условиях мутагенного загрязнения окружающей среды приобретает еще некоторое дополнительное число, мутаций, передавая последующему поколению значительно больше мутаций. Предотвратить увеличение мутационного груза, способного вызвать «взрыв» мутабельности и тем самым сохранить наследственность - актуальная и .сложная задача стоящая перед человечеством.
Существует несколько подходов к решению проблемы. Предотвращение; загрязнения среды а также идентификация и изъятие мутагенов окружающей среды, весьма эффективны, но их реализация является весьма проблематичной. Одним из подходов является повышение устойчивости организмов к действию экстремальных факторов. Для этих целей возможно использование антимутагенов, веществ, способных снижать частоту спонтанной и индуцированной мутации (Алекперов, 1989).
Прокариоты, как потенциальные источники антимутагенов почти не изучались, хотя, учитывая общность фундаментальных реакций прокариот и эукариот, а также способность прокариот осуществлять реакции некоторых уникальных синтезов, позволили ученым предположить, что бактерии могут быть источниками ценных антимутагенов. Есть и другие положения, подтверждающие важность поиска и использования бактериальных антимутагенов. Во-первых, трудности по получению и использованию микробной биомассы сведены к минимуму, так как бактерии в
большинстве своем эффективно наращивают биомассу на дешевых средах (например, на отходах некоторых производств) и за довольно короткий промежуток времени. А также, существуют возможности воздействия на бактериальный метаболизм, позволяющие стимулировать преимущественную выработку необходимого человеку продукта и его дальнейшую экскрецию из клеток. Во-вторых, бактерии являющиеся облигатными составляющими нормальной микрофлоры, а также используемые в приготовлении разнообразных продуктов < представлены главным образом анаэробами. Значит, они в большей степени, чем аэробные микроорганизмы, нуждаются в защите от кислорода и его активных форм, и, следовательно, должны иметь эффективнейшие системы с антимутагенной активностью.
Кроме антимутагенного действия в отношении мутагенеза, индуцированного химическими соединениями, бактерии привлекли к себе внимание исследователей способностью к реактивирующему действию в ответ на стрессовые ситуации. Стресс-это ситуация при которой параметры окружающей среды резко отличаются от обычных условий существования организма. Венгерский врач Ганс Селье, дал имя и идею, стрессорного ответа как запрограмированной реакции организма на резкое изменение условий окружающей среды. Со времен Г. Селье этот термин стал очень популярен и приобрел более широкий смысл, включая сейчас действие экстремальных факторов на биообъект и противодействие им.
Удивительная общность стрессорных ответов у всех исследованных про- и эукариотных организмов1 позволила выявить высокую консервативность фундаментальных механизмов клеточной регуляции. Поэтому микроорганизмы могут служить моделями для изучения стрессовых ответов.
Целью настоящей работы стало изучение, с одной стороны, антистрессовых, а также антимутагенных свойств пропионовокислых бактерий, что открьшает широкие перспективы их практического использования в качестве профилактических и лекарственных препаратов.
Объект наших исследований выбран нами в связи с тем, что пропионовокислые бактерии рассматриваются как перспективные пробиотики, положительное влияние которых на здоровье человека общепризнанно. Пропиновокислые бактерии:
подавляют активность гнилостных грибов и патогенных грибов,
образуют витамины группы Вив большом количестве витамина В12,
некоторые штаммы вызывают торможение роста раковых клеток,
обеспечивают защиту от кишечной инфекции.
Кроме того, пропионовокислые бактерии не перевариваются в желудочно-кишечном тракте людей, устойчивы к действию желчных кислот и вьщерживают низкую (рН 2.0) кислотность желудка. P. acidipropionici ингибирует акивность /3-глюкуронидазы, азаредуктазы и нитроредуктазы - ферментов, образуемых кишечной микрофлорой и вовлекаемых в образование мутагенов, канцерогенов и промоторов роста опухолей. Пропионовые бактерии стимулируют рост фекальных бифидобактерий и помогают в лечении бактериальных дисбактериозов.
