Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Применение цитостатиков в клинической практике 11
1.2. Инфекционные осложнения, возникающие при заболеваниях, требующих цитостатической терапии 13
1.2.1. Инфекционные осложнения при ревматических заболеваниях 13
1.2.2. Инфекционные осложнения в онкологии 16
1.2.3. Инфекционные осложнения в трансплантологии 19
1.3. Изменения в микробиоценозах организма при аутоиммунных и онкологических заболеваниях 24
1.3.1. Микрофлора при ревматических заболеваниях 24
1.3.2. Микрофлора и онкологические заболевания 27
1.4. Изменения в микробиоценозах организма на фоне применения цитостатиков и иммунодепрессантов 32
1.5. Прямое влияние препаратов с цитостатическим механизмом действия нарост, развитие и свойства микроорганизмов 36
Собственные исследования 45
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Материалы 45
2.1.1. Препараты, использованные в работе 45
2.1.2. Штаммы микроорганизмов и питательные среды, использованные в работе 45
2.1.3. Лабораторные животные 45
2.2. Методы 46
2.2.1. Исследование микрофлоры толстой кишки экспериментальных животных 46
2.2.2. Схема эксперимента по исследованию влияния метотрексата на развитие популяции условно-патогенных бактерий 47
2.2.3. Схема эксперимента по исследованию влияния мето-тотрексата на биологические свойства и антибиотикорезис-тентность условно-патогенных бактерий in vitro 48
2.2.4. Оценка адгезивных свойств условно-патогенных бактерий 48
2.2.5. Оценка чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам 49
2.2.6. Оценка влияния метотрексата на продукцию факторов патогенности 51
2.2.6.1. Оценка активности плазмокоагулазы S. aureus 51
2.2.6.2. Оценка лецитиназной активности S. aureus и гемолитической активности S. aureus и P. aeruginosa 52
2.2.7. Программное обеспечение 52
2.2.8. Статистическая обработка данных 53
Глава 3. Популяционные уровни некоторых условно-патогенных бактерий в составе микрофлоры толстой кишки белых мышей, получавших мето трексат, циклофосфамид и преднизолон 54
Глава 4. Биологические свойства условно-патогенных бактерий, выделенных из фекалий экспериментальных животных 66
4.1. Факторы патогенности 66
4.2. Адгезивные свойства 68
4.3. Чувствительность к антибактериальным препаратам 70
Глава 5. Влияние метотрексата на развитие популяции условно-патогенных бактерий in vitro 82
Глава 6. Влияние метотрексата на адгезивные свойства, факторы патогенности и лекарственную устойчивость условно-патогенных бактерий in vitro 93
6.1. Адгезивные свойства 93
6.2. Факторы патогенности 96
6.3. Чувствительность к антибактериальным препаратам 99
Глава 7. Обсуждение результатов 111
Выводы 143
Практические рекомендации 145
Список литературы 146
- Инфекционные осложнения в трансплантологии
- Популяционные уровни некоторых условно-патогенных бактерий в составе микрофлоры толстой кишки белых мышей, получавших мето трексат, циклофосфамид и преднизолон
- Влияние метотрексата на развитие популяции условно-патогенных бактерий in vitro
- Чувствительность к антибактериальным препаратам
Введение к работе
Актуальность проблемы
Препараты, обладающие цитостатическим действием, являются эффективными противоопухолевыми средствами; кроме того, обладая иммуносупрес-сивным эффектом, цитостатики находят широкое применение в терапии аутоиммунных заболеваний и в трансплантологии.
К наиболее опасным и часто встречающимся осложнениям, развивающимся на фоне иммуносупрессии, возникающей при цитостатической терапии, относятся инфекции (Балабанова P.M., 2006; Белов Б.С. и соавт., 2006; Jallouli М., 2008), возбудителями которых являются, главным образом, условно-патогенные представители микрофлоры организма (Соколов А.А., 2009; Garbino J. et al., 2005; Lee P.P.W., 2007). При этом в ряде исследований было показано, что при заболеваниях, требующих назначения цитостатиков, имеют место изменения в микробиоценозах пациентов, выражающиеся, главным образом, в избыточном росте условно-патогенных микроорганизмов (Привалова Т.Ю., 2006; Гульнева М.Ю. и соавт., 2007, Stringer A.M. et al., 2009).
Одним из наименее изученных вопросов является прямое воздействие цитостатиков на биологические свойства микроорганизмов и состояние микрофлоры макроорганизма. Вместе с тем, препараты с цитостатическим механизмом действия являются ДНК-тропными агентами, проявляют выраженные мутагенные свойства и, следовательно, потенциально способны вызвать изменения свойств микроорганизмов. Отмечено, что биологические характеристики бактерий, выделенных на фоне введения рассматриваемых лекарственных средств, отличаются от аналогичных свойств бактерий, встречающихся у людей или лабораторных животных, не подвергавшихся воздействию препаратов с цитотоксическими свойствами (Вельский В.В. и соавт., 2008; Гульнева М.Ю. и соавт., 2007). Публикации о прямом влиянии цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий единичны (Шаповал О.Г., 2008).
В соответствии с рассмотренными выше обстоятельствами, актуальным является исследование, позволяющее установить характер эффектов цитостатиков в отношении условно-патогенных бактерий микрофлоры организма в контексте возникновения инфекционных осложнений и микроэкологических нарушений при применении данных препаратов.
В реальной практике данные о состоянии и свойствах микрофлоры до назначения цитостатической терапии, как правило, отсутствуют, а учесть все факторы, влияющие на микрофлору организма больного, крайне затруднительно, поэтому получение объективных данных в рамках клинического исследования представляется весьма сложным. Можно предположить, что в условиях живого организма воздействие цитостатиков на микрофлору может реализовываться не напрямую, а за счет влияния на различные системы макроорганизма, прежде всего, на иммунную систему. В соответствии с изложенным, обоснованным подходом к достижению поставленной цели является исследование воздействия
широко применяемых в медицине цитостатиков - метотрексата и циклофосфамида - на условно-патогенные микроорганизмы в опытах как in vitro, так и in vivo, в сравнении с эффектами преднизолона - иммуносупрессивного препарата с нецитостатическим механизмом действия.
Цель исследования - оценка влияния цитостатиков на биологические свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника в экспериментах in vitro и in vivo.
Задачи исследования:
-
Оценить уровни колонизации толстой кишки стафилококками, энтерококками и знтеробактериями при курсовом введении белым мышам цитостатиков - метотрексата и циклофосфамида в сравнении с преднизолоном — иммуно-дспрессантом с нецитостатическим механизмом действия.
-
Изучить биологические свойства штаммов, выделенных у животных, получавших метогрексат, циклофосфамид и преднизолон.
-
Исследовать влияние различных концентраций метотрексата на развитие популяции музейных штаммов Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemo-lyticus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae и Pseudomo-nas aeruginosa в опытах in vitro.
-
Изучить биологические свойства условно-патогенных бактерий, подвергшихся воздействию различных концентраций метотрексата в опытах in vitro.
Научная новизна
В экспериментальном исследовании, исключающем влияние комплекса дополнительных факторов, действующих на микрофлору пациента в клинических условиях, получены новые данные о самостоятельной роли цитостатиков в изменении показателей кишечного микробиоценоза и свойств его представителей.
Новые данные о влиянии курсового введения цитостатиков разных групп (метотрексата и циклофосфамида) и иммунодепрессанта с нецитостатическим механизмом действия (преднизолона) на уровни колонизации толстой кишки белых мышей стафилококками, энтерококками и знтеробактериями показывают, что все препараты повышают общее количество условно-патогенных микроорганизмов, однако имеются некоторые различия в характере воздействия препаратов на популяционные уровни отдельных бактерий.
Впервые установлено, что цитостатики вызывают разнонаправленные изменения антибиотикорезистентности условно-патогенных бактерий, а также их адгезивпости; при этом выявлена прямая корреляция между показателями адгезии и популяциоными уровнями энтеробактерий в содержимом толстой кишки экспериментальных животных; под влиянием метотрексата in vitro происходит замедление развития популяции условно-патогенных бактерий и изменение культуральных свойств золотистого стафилококка.
Практическая значимость работы
Данные о способности цитостатиков вызывать микроэкологические нарушения и влиять на антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий в эксперименте являются основой рекомендаций для совместной работы с клиницистами при проведении цитостатической терапии, в частности, при лечении инфекционных осложнений, развившихся на её фоне.
Результаты выполненной работы необходимы для дальнейшего развития исследований, направленных на формирование концепции самостоятельной роли цитостатической терапии в изменении показателей микрофлоры и биологических свойств её отдельных представителей.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты работы внедрены в работу межкафедралыюй научно-исследовательской лаборатории на базе кафедры микробиологии ГОУ ВПО ЯГМА Росздрава, полученные данные используются при проведении занятий и чтении лекций для интернов, ординаторов, слушателей факультета последипломного образования и студентов всех факультетов ГОУ ВПО ЯГМА Росздрава.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Применение цитостатиков является самостоятельной причиной микроэкологических нарушений и изменения биологических свойств условпо-патогенных бактерий in vivo; сходные эффекты реализуются также при введении нреднизолона - иммунодепрессанта с нецитостатическим механизмом действия.
-
Введение циклофосфамида и метотрексата экспериментальным животным влияет на антибиотикорезистентность и адгезивные свойства условно-патогенных бактерий микрофлоры кишечника.
-
Прямое воздействие метотрексата в опытах in vitro характеризуется изменениями антибиотикорезистентности, показателей адгезии, культуральных свойств и динамики развития популяции условно-патогенных бактерий.
Апробация работы
Апробация диссертационной работы состоялась на межкафедральной научной конференции кафедр микробиологии с вирусологией и иммунологией, фармакологии и патологической анатомии с курсом судебной медицины Ярославской государственной медицинской академии, протокол № 1 от 5 мая 2010 года.
Основные положения работы были представлены на 57-60-й научных студенческих конференциях ГОУ ВПО ЯГМА Росздрава (г. Ярославль, 2003-2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2007), научно-практической конференции «Современные возможности клинической лабораторной диагностики в клинико-диагностическом процессе» (г. Ярославль, 2008), V съезде Общества биотехіїологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Москва, 2008), V съезде ревматологов России (г. Москва, 2009), X международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (г. Казань, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 3 - в других периодических изданиях, 6 - в материалах конференций, 6 - в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации
Инфекционные осложнения в трансплантологии
Инфекции, развивающиеся у пациентов, перенесших трансплантацию органов, представляют значительную опасность, входя в число наиболее часто встречающихся осложнений, угрожающих жизни [132]. Garbino J. et al. [136] отмечают, что с инфекциями (преимущественно вирусной этиологии) ассоциировано отторжение трансплантата. До 40% летальных исходов у пациентов перенесших трансплантацию, происходит в результате развития инфекционных осложнений [158],,в особенности, цитомегаловирусной этиологии [144]. Одним из фатальных осложнений при проведении иммуносупрессивной терапии является септический шок [66]. Летальность при развитии септического шока у детей, перенесших трансплантацию костного мозга, достигает 40% [110].
К факторам, обусловливающим высокий риск развития инфекционных осложнений, в первую очередь, относится иммуносупрессия, вызванная введением иммунодепрессантов с целью профилактики отторжения трансплантата. Кроме того, вероятность развития инфекционных осложнений повышается в связи с такими обстоятельствами, как контаминация трансплантата или его исходная инфицированность (например, латентная вирусная инфекция), нарушение целостности анатомических барьеров (в результате использования катетеров и т.п.), обширные оперативные вмешательства, наличие сопутствующей патологии, метаболические нарушения и др. [132, 133].
Опубликованы данные о встречаемости различных этиологических факторов инфекционного процесса в разные сроки с момента осуществления трансплантации [132, 133].
Так, в сроки менее 1 месяца встречаются метициллинрезистентные золотистые стафилококки, ванкомицинрезистентные энтерококки, Candida spp. (но не С. albicans), Clostridium difficile; к донор-опосредованным возбудителям относятся вирус простого герпеса, вирус бешенства, цитомегаловирус, вирус Западного Нила, ВИЧ, Trypanosoma cruzi, к рецепиент-опосредованным - Aspergillus spp., Pseudomonas spp.
В сроки 1-6 месяцев на фоне проведения профилактических мероприятий отмечены инфекции, вызванные полиомавирусами, С. difficile, вирусом гепатита С, аденовирусами, вирусами гриппа, Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis; при отсутствии профилактических мероприятий - инфекции, вызванные Pneumocystis spp., герпесвирусами (вирус простого герпеса, Varicella-zoster virus, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр), вирусом гепатита В, Listeria spp., Nocardia spp., Toxoplasma spp., Strongyloides spp., Leishmania spp., T. cruzi. В сроки более б месяцев встречаются инфекции, вызванные Aspergillus spp., атипичными плесневыми грибами, Mucor spp., Nocardia spp., Rhodococcus spp., цитомегаловирусом, а также вирусные гепатиты, полиомавирусная инфекция, энцефалиты, вызванные вирусом простого герпеса, атипичная пневмония.
Garbino J. et al. [136] проанализировали 228 случаев инфекционных осложнений у пациентов, перенесших трансплантацию печени. Среди них 107 (47%) случаев составляли бактериальные инфекции, 101 (44%) - вирусные, 17 (7,5%) - грибковые, 3 (1,5%) — протозойные. Следует отметить, что в ранний посттрансплантационный период (0-2 недели) преобладали бактериальные инфекции, в дальнейшем - вирусные. Из 107 случаев бактериальных инфекций 94 были моноэтиологическими и 13 - полиэтиологическими. Среди преобладающих бактериальных патогенов встречались: Enterococcus spp. - 17 (16%) случаев, с сопутствующей Е. coli (13 (12%) случаев), коагулазонегативные стафилококки - 12 (11%) случаев. Наиболее часто микроорганизмы выделялись из крови (39 случаев) и брюшной полости (33 случая). 57% случаев вирусных инфекций были вызваны вирусом простого герпеса 1 типа, 29% - цитомегаловирусом. Были также отмечены случаи гепатита В и претрансплантационных гепатитов С и В + С. Грибковые инфекции вызывались преимущественно Candida spp., прежде всего С. albicans (86%). Частота кандидемии составляла 3 на 1000 трансплантаций [204]. В числе грибов, являвшихся возбудителями посттрансплантационной инфекции, также указывается Aspergillus spp. [136]. Отмечен 1 случай пневмоцистной пневмонии. Протозойные инфекции были вызваны токсоплазмами. В ранний посттрансплантационный период (0-2 недели) преобладали бактериальные инфекции, в дальнейшем - вирусные.
Аналогичные результаты получили Montoya J.G. et al. [166], проведя детальный анализ случаев инфекционных осложнений у 620 пациентов после трансплантации сердца. Среди них 468 (43,6%) составляли инфекции, вызванные бактериями, 447 (41,7%) - вирусами, 109 (10,2%) - грибами, 43 (4%) -Pneumocystis jiroveci, 6 (0,6%) - простейшими. Riddle D.J., Dubberke E.R. [181], указывают на важную роль Clostridium difficile как возбудителя инфекций при трансплантации органов.
Выполнены исследования, содержащие сопоставление частоты встречаемости различных инфекций в зависимости от того, какие иммуносупрессивные препараты использовались для профилактики отторжения трансплантата. Kramer M.R. et al. [158], проанализировав инфекционные осложнения при тройной (циклоспорин А, преднизолон, азатиоприн) и двойной (циклоспорин А, преднизолон) иммуносупрессивной химиотерапии у больных, подвергавшихся трансплантации лёгких и сердца, не выявили достоверных различий между группами. Прокопенко Е.И. и соавт. [64] сравнивали этиологическую структуру и частоту инфекционных осложнений у пациентов с почечным аллотрансплан-татом, получавших тройную иммуносупресивную терапию (циклоспорин А, преднизолон, азатиоприн - 1 группа, циклоспорин А, преднизолон, мофетила микофенолат - 2 группа). Получены данные, сходные с результатами исследований других авторов [136, 166], показавших, что этиологическая структура и частота инфекционных осложнений не зависит от схемы иммуносупрессивной терапии.
Важное значение имеют экспериментальные исследования, рассматривающие влияние иммуносупрессивной терапии на микробную обсеменённость трансплантата [169]. У животных, получавших иммуносупрессивные препараты, отмечены изменения в качественном составе бактериальной флоры пересаженного участка кожи: наблюдалось появление таких условно-патогенных микроорганизмов, как Pseudomonas spp., Е. coli, Corynebacterium spp. и др.
Анализируя данные литературы об инфекционных осложнениях, развивающихся на фоне болезней, лечение которых включает цитостатическую терапию, следует отметить, что спектр возбудителей рассматриваемых осложнений достаточно широк и включает в себя бактерии, вирусы, грибы и простейшие. В число возбудителей инфекционных осложнений бактериальной этиологии входят условно-патогенные представители микрофлоры организма (грамположи-тельные кокки, энтеробактерии, Clostridium spp. и др.), Pseudomonas spp., мико 23 бактерии, листерии, сальмонеллы и др. Среди вирусов в первую очередь встречаются представители семейства Herpesviridae, среди грибов — Candida spp., Pneumocystis jiroveci, Aspergillus niger, Ciyptococcus neoformans и др.
Несмотря на относительную широту спектра возбудителей рассматриваемых осложнений, большинство из них укладывается в общепринятую парадигму представлений о возбудителях оппортунистических инфекций у иммуно-компрометированных лиц. Это, главным образом, представители микрофлоры организма, а также транзиторные микроорганизмы с невысоким уровнем патогенносте, редко вызывающие заболевания у лиц с нормальным иммунным статусом.
Хотя перечни возбудителей инфекционных осложнений при различных формах патологии по данным разных авторов иногда различаются, можно предположить, что это связано не с какими-либо специфическими особенностями каждой конкретной нозологической формы, а преимущественно с особенностями проведения исследования (контингент больных, степень детальности и глубины обследования, используемая микробиологическая техника, условия конкретных регионов и стационаров, наличие и характер сопроводительной антимикробной терапии и др.). По-видимому, общность этиологической структуры инфекционных осложнений при рассматриваемых формах патологии связана с наличием общих предрасполагающих факторов, в первую очередь, им-муносупрессии и нарушения целостности анатомических барьеров организма. Часть выявленных инфекций являются сопутствующими (вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекция) и не связаны с патогенезом рассматриваемых заболеваний.
Популяционные уровни некоторых условно-патогенных бактерий в составе микрофлоры толстой кишки белых мышей, получавших мето трексат, циклофосфамид и преднизолон
Результаты экспериментов по изучению влияния метотрексата, цикло-фосфамида и преднизолона и на микрофлору толстой кишки белых мышей представлены в таблице 3 и на рисунках 1-3.
Установлено, что у всех животных, получавших препараты, наблюдались статистически достоверные изменения показателей микрофлоры, выраженность которых, как правило, возрастала по мере увеличения продолжительности введения препаратов.
Так, через 2, недели после начала введения препаратов у мышей всех опытных групп отмечалось статистически достоверное (р 0,05) увеличение в фекалиях общего числа аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (АФАМ), особенно выраженное у мышей, получавших МТ (в 5,2 раза по сравнению с контрольной группой, рисунок 1А, таблица 3). Однако различия между опытными группами по данному показателю оказались недостоверными (р 0,05). У животных всех опытных группах наблюдалось достоверное повышение количества стафилококков по сравнению с контрольной группой (рисунок 1Б, таблица 3): при введении ЦФ - в 31,7 раза, ПЗ- в 49 раз, МТ - в 85,8 раза (р 0,05); различия между опытными группами по данному показателю недостоверны (р 0,05); выявлялась также тенденция к повышению содержания энтерококков, однако достоверное их увеличение имело место только у мышей, получавших МТ (в 6,7 раза). Между опытными группами не было отмечено достоверных различий по признаку численности энтерококков. При введении МТ наблюдалось статистически достоверное (р 0,05) снижение уровня типичных кишечных палочек (рисунок 2Б, таблица 3) - в 12,4 раза по сравнению с контрольной группой и в 21,9 раз по сравнению с группой, получавшей ЦФ (р 0,05). Различия в численности кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью (КПСФА) носили недостоверный характер, однако следует отметить-тенденцию к повышению данного показателя на фоне введения ТДФ и МТ (рисунок ЗА, таблица 3). Введение ЦФ приводило к возрастанию содержания ЛНЭБ в 64,1 раза по сравнению с контрольной группой и в 47,6 раза по сравнению с группой, получавшей ПЗ (р 0,05; рисунок ЗБ, таблица 3).
На 4-ой неделе введения животным ЦФ и ПЗ наблюдалось достоверное повышение общего числа АФАМ (рисунок 1А, таблица 3) по сравнению с данными контрольной группы, соответственно - в 6,6 и в 3,4 раза (р 0,05). Различия данного показателя у контрольной группы и группы, получавшей МТ, недостоверны, однако общее число АФАМ на фоне введения МТ было достоверно ниже (в 5,5 раза), чем при введении ЦФ. У мышей всех групп содержание стафилококков оставалось повышенным (рисунок 1Б, таблица 3), однако главным образом в меньшей степени, чем на 2-ой неделе (при введении ЦФ - в 6,7 раза, ПЗ - 50,1 раза, МТ - в 7 раз в сравнении с контрольной группой). Достоверных различий по данному показателю между опытными группами не было выявлено. Содержание энтерококков было достоверно повышено в фекалиях мышей, получавших ПЗ и МТ (соответственно в 5,1 и 1,7 раза; р 0,05). Достоверных различий в количественном содержании энтерококков у животных опытных групп не было отмечено. Численность типичных КП продолжала оставаться сниженной у мышей, получавших МТ (в 10,8 раза по сравнению с контрольной группой и в 51,6 раза по сравнению с группой, получавшей ЦФ); в последней группе имела место тенденция к повышению уровня типичных КП по сравнению с группой контроля (в 4,8 раза, р 0,05; рисунок 2Б, таблица 3). Выявлено статистически достоверное (р 0,05) повышение уровня КПСФА у мышей, получавших ЦФ - в 70 раз по сравнению с контрольной группой, в 25,1 и в 26,2 раза по сравнению с группами, получавшими ПЗ и МТ соответственно (рисунок ЗА, таблица 3); в этой же группе животных наблюдалось достоверное повышение численности ЛНЭБ (в 9 раз по сравнению с контрольной группой и в 10,2 раза по сравнению с группой, получавшей МТ; рисунок ЗБ, таблица 3).
На 6-ой неделе после начала введения препаратов наблюдалось выраженное повышение общего количества АФАМ у мышей, получавших ЦФ и ПЗ (соответственно в 36,7 и в 7,2 раза, р 0,05; рисунок 1А, таблица 3). Отмечены достоверные различия по данному показателю между группами, получавшими ЦФ и МТ (при введении МТ общее содержание АФАМ было ниже в 25,6 раза; р 0,05). Наибольшее повышение уровня стафилококков имело место на фоне введения ПЗ (в 129 раз по сравнению с контрольной группой; рисунок ЗБ, таблица 3). На данном этапе описываемого исследования уровень стафилококков в группе, получавшей ЦФ, был достоверно ниже, чем в других опытных группах (р 0,05). Достоверных различий в высеваемости энтерококков у мышей экспериментальных групп не было выявлено. Имела место тенденция к снижению уровня типичных КП на фоне введения ПЗ (р 0,05), достоверное снижение численности типичных КП в группе, получавшей МТ (в 4,8 раза по сравнению с контрольной группой, р 0,05; рисунок 2Б, таблица 3). У мышей, получавших ЦФ, констатировано достоверно повышенное содержание типичных КП по сравнению с группами, получавшими ПЗ и МТ (в 18,7 и 54,7 раза соответственно, р 0,05). В этой же группе наблюдалось значительное статистически достоверное по сравнению с контрольной группой увеличение уровня КПСФА (в 310,3 раза, р 0,05; рисунок ЗА) и ЛНЭБ (в 419,5 раза; р 0,05; рисунок ЗБ). Значения указанных показателей в группе, подвергшейся воздействию ЦФ, было достоверно выше, чем в остальных опытных группах (р 0,05).
Процентное содержание гемолитических микроорганизмов в фекалиях мышей, получавших иммунодепрессанты, во все сроки наблюдения не имело достоверных отличий от аналогичных показателей контрольной группы (Р 0,05).
Анализируя особенности воздействия разных препаратов, можно отметить, что введение ЦФ вызывало статистически достоверное повышение высеваемости стафилококков на 2-й и 4-й неделях (р 0,05), а также ЛНЭБ, типичных КП и КПСФА, особенно на 4-й и 6-й неделях эксперимента (р 0,05). В группе животных, получавших ПЗ, отмечено наиболее выраженное по сравне 58 нию с другими группами повышение высеваемости стафилококков на протяжении всего периода введения препарата (р 0,05). На 6-й неделе отмечена тенденция к преобладанию ЛНЭБ (р 0,05). Введение МТ вызывало статистически достоверное снижение высеваемости типичных КП на протяжении всего периода введения препарата (р 0,05). На 2-й неделе наблюдалось повышение содержания КПСФА и ЛНЭБ, а в дальнейшем - снижение данных показателей. На протяжении всего периода введения МТ отмечено достоверное повышение высеваемости стафилококков.
Таким образом, при введении ПЗ наблюдалось наибольшее увеличение высеваемости стафилококков, тогда как ЦФ вызывал наиболее выраженные изменения в численности ЛНЭБ и КПСФА. Отличительной особенностью влияния МТ было уменьшение высеваемости типичных КП.
Также был выполнен анализ повторных измерений исследованных показателей в каждой группе животных.
В контрольной группе на протяжении всего периода наблюдений не происходило статистически значимых изменений анализируемых показателей. Исходные уровни анализируемых показателей (до введения препаратов) в опытных группах были близки к аналогичным показателям контрольной группы.
Циклофосфамид. На фоне введения ЦФ в течение всего периода наблюдения отмечалось повышение общего числа АФАМ, причём показатели нарастали в течение всего периода введения препарата (рисунок 1А). Так, на 2-ой неделе от начала опыта наблюдалось нарастание в 4,4 раза по сравнению с исходным уровнем, на 4-й неделе - увеличение в 1,5 раза по сравнению со 2-ой неделей, на 6-й неделе - увеличение в 5,3 раза по сравнению с 4-й неделей (Р 0,05).
На 2-й неделе было констатировано достоверное повышение содержания стафилококков по сравнению с исходным уровнем в 31,7 раза (рисунок 1Б). В течение последующего периода наблюдалось снижение уровня стафилококков: на 4-й неделе в 5,1 раза по сравнению со 2-ой неделей (р 0,05), а на 6 неделе в 11,5 раз по сравнению с 4-ой неделей (р 0,05).
Влияние метотрексата на развитие популяции условно-патогенных бактерий in vitro
Установлено, что метотрексат угнетал рост всех взятых для исследования микроорганизмов, за исключением P. aeruginosa АТСС 27853. В диапазоне концентраций 0,1 — 1000 мг/л не наблюдалось полного угнетения роста, имело место частичное ингибирование по сравнению с контролем. В таблице 16 приводятся соответствующие данные в % от интенсивности роста контроля (культура на МПБ без добавления метотрексата).
Наиболее выраженное ингибирующее действие МТ оказывал на рост Е. faecalis АТСС 29212 и S. aureus АТСС 25923. При концентрации МТ 1000 мг/л у всех взятых для исследования штаммов микроорганизмов, за исключением Р. aeruginosa АТСС 27853, наблюдалось статистически значимое угнетение роста; при концентрации 100 мг/л отмечено достоверное ингибирование роста S. aureus АТСС 25923, Е. faecalis АТСС 29212, Е. coli АТСС 25922 и К. pneumoniae 119, при концентрации 10 мг/л - только & aureus АТСС 25923 и Е. faecalis АТСС 29212. В диапазоне концентраций МТ 0,1-1,0 мг/л не наблюдалось ста 83 тистически достоверного влияния на рост взятых для исследования штаммов УПБ.
Использование относительных величин, стандартизированных по контролю, не содержащему МТ, позволяет осуществить сравнение влияния отдельно взятых концентраций препарата на рост различных УПБ.
При концентрации препарата 1000 мг/л наблюдалось приблизительно одинаковое воздействие на рост S. aureus АТСС 25923, Е. сої і АТСС 25922 и Е. faecalis АТСС 29212 (р 0,05). Между остальными взятыми для исследования штаммами микроорганизмов имелись статистически достоверные различия (р 0,05). При концентрации МТ 100 мг/л статистически достоверные различия не выявлялись при сравнении между собой показателей роста S. haemolyticus 107 и P. aeruginosa АТСС 27853, а также Е. faecalis АТСС 29212 и К. pneumoniae 119 (р 0,05); в остальных случаях между разными штаммами УПБ были отмечены статистически значимые различия (р 0,05). При концентрации МТ 10 мг/л были констатированы достоверные (р 0,05) отличия роста S. aureus АТСС 25923 и Е. faecalis АТСС 29212 от остальных штаммов. Показатели указанных штаммов не имели достоверных отличий друг от друга; остальные штаммы также достоверно не различались между собой (р 0,05). При концентрациях МТ 0,1 - 1,0 мг/л между взятыми для исследования штаммами достоверных различий не было выявлено (р 0,05).
Воздействие МТ на рост штаммов, выделенных у мышей, сходно с воздействием на рост музейных штаммов. Достоверные различия с показателями роста контрольных образцов приходятся главным образом на концентрации препарата 1000 и 100 мг/л.
При исследовании динамики развития популяции бактерий было отмечено, что ингибирующий эффект имел место на всех фазах развития бактериальной популяции. Наиболее ощутимые различия между контрольными и опытными образцами проявлялись в поздние сроки; на ранних фазах различия были выражены в меньшей степени (рисунки 5-8, таблицы 17-20).
Так, в отношении S. aureus АТСС 25923 было отмечено, что статистически значимое (р 0,05) угнетение роста данного штамма при концентрации МТ 100 мг/л выявлялось начиная с 18 часов после инокуляции; при концентрации препарата 1000 мг/л на протяжении всего периода наблюдения имели место статистически достоверные различия с контролем (р 0,05). Статистически значимое угнетение роста Е. соїі АТСС 25922 при концентрации МТ 100 мг/л наблюдалось только в момент наблюдения 18 часов, а при 1000 мг/л - начиная с 8 часов после инокуляции (р 0,05). При исследовании развития популяции Е. faecalis АТСС 29212 и К. pneumoniae 119 констатировано, что достоверное (р 0,05) угнетение роста данных штаммов имело место на протяжении всего периода наблюдения как при концентрации 100 мг/л, так и 1000 мг/л МТ.
При оценке чувствительности к метотрексату взятых для исследования штаммов УПБ диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон наличие зоны задержки роста было выявлено только для S. aureus АТСС 25923 и S. haemolyticus 107. Зависимость диаметра зоны задержки роста штамма S. aureus АТСС 25923 от содержания МТ в диске отражена на рисунке 9.
При последующей оценке чувствительности к метотрексату стафилококков, выросших в зоне частичного угнетения роста, установлено, что их уровень чувствительности не отличался от исходного, т.е. формирование рассматриваемой зоны не было связано с селекцией мутантов, резистентных к метотрексату.
Также было осуществлено сравнение чувствительности к метотрексату штаммов стафилококков, выделенных у мышей контрольной группы и группы, получавшей метотрексат; при этом достоверных различий не было выявлено. При содержании МТ в диске 250 мкг диаметр зоны частичной задержки роста (мм, M±SD) для стафилококков, выделенных у контрольной группы составил 19,93±5,85 мм, а у стафилококков, изолированных от мышей, получавших МТ, - 21,36±6,64 мм (р 0,05). Показано, что чувствительность разных штаммов к метотрексату варьирует в достаточно широких пределах: диаметры зон задержки 56 штаммов стафилококков находились в пределах от 12 до 36 мм. Распределение значений данного показателя соответствует нормальному (Р=0,0013 при использовании W-теста Шапиро-Уилка). При использовании метода серийных разведений в агаре было показано, что на среде, содержащей метотрексат, рост колоний S. aureus АТСС 25923 в значительной степени замедлялся (рисунки 12А-12В); колонии имели меньшие размеры и неправильную форму (таблица 21, рисунки ПА, 11 Б). Изменения культуральных свойств были наиболее выражены при концентрации метотрек-сата в агаре 500 и 1000 мг/л. При последующем пересеве колоний неправильной формы на агар Мюллера-Хинтон, не содержащий МТ, культуральные свойства выросших колоний полностью соответствовали исходным свойствам музейного штамма.
Выраженное замедление роста колоний и изменение их формы имели место только при культивировании S. aureus АТСС 25923 на агаре Мюллера-Хинтон. При выполнении аналогичного исследования на МПА (рисунки 13А -1 ЗВ) с теми же концентрациями МТ наблюдалось лишь незначительное уменьшение размера колоний; достоверные различия с контролем (р 0,05) были от 91 мечены только при высокой концентрации МТ - 1000 мг/л (таблица 22, рисунок 13В).
Таким образом, МТ даже при достаточно высоких концентрациях в опытах in vitro не вызывает полного ингибирования роста ни одного из взятых для исследования штаммов; имеет место замедление развития популяций всех микроорганизмов, за исключением P. aeruginosa АТСС 27853, интенсивность роста которой не претерпевает изменений под влиянием МТ; наиболее чувствительны к препарату S. aureus АТСС 25923 и Е. faecalis АТСС 29212. Статистически значимое угнетение роста УПБ отмечено при концентрациях МТ от 10 мг/л и выше. Эффект МТ является наиболее выраженным при выполнении исследования на среде Мюллера-Хинтон. Повышения устойчивости к МТ на фоне его воздействия не отмечено ни in vivo, ни in vitro.
Чувствительность к антибактериальным препаратам
Данные о чувствительности УПБ, выращенных в присутствии МТ, к различным АБП, представлены в таблицах 31-45. Чувствительность оценивали двумя методами, при этом были получены принципиально сходные показатели; результаты в настоящем разделе описаны преимущественно по данным метода серийных разведений.
S. aureus АТСС 25923. Были отмечены следующие статистически достоверные изменения в антибиотикорезистентности данного штамма (таблицы 31 -33): повышение чувствительности к бензилпенициллину (при воздействии МТ в концентрациях 10 и 100 мг/л), гентамицину (концентрации МТ- 10, 100 и 500 мг/л), линезолиду (концентрации МТ - 1, 100 и 500 мг/л) и рифампицину (концентрация МТ — 10 мг/л); снижение чувствительности к ципрофлоксацину (концентрации МТ - 10, 100 и 500 мг/л), ванкомицину (концентрации МТ - 1, 10 и 100 мг/л), рокситромицину (концентрация МТ - 10 мг/л).
Изменённый уровень чувствительности к бензилпенициллину, ванкомицину, рифампицину сохранялся при последующих пересевах штамма; в отношении остальных АБП изменённый уровень чувствительности не сохранялся.
Изменения чувствительности к бензилпенициллину, гентамицину, линезолиду, эритромицину, рокситромицину, меропенему и рифампицину являлись однонаправленными; изменения чувствительности к гентамицину, меропенему и линезолиду (в последнем случае - за исключением результата, полученного при концентрации МТ 1 мг/л) углублялись с повышением концентрации МТ. Зависимость уровня чувствительности к вышеназванным препаратам от кон 100 центрации МТ в МПБ, на котором осуществлялось культивирование стафилококков, показана на рисунках 16-18.
Е. coli АТСС 25922. Были констатированы следующие статистически достоверные изменения в антибиотикорезистентности данного штамма (таблицы 34-36): повышение чувствительности к Цефтриаксону (при культивировании штамма МТ в присутствии концентраций МТ 1, 100 и 500 мг/л), снижение чувствительности к ампициллину (концентрация МТ — 500 мг/л), меропенему (10 мг/л МТ), гентамицину (10 мг/л МТ), ципрофлоксацину (10 мг/л МТ).
При последующих пересевах культур сохранялся изменённый уровень чувствительности к ампициллину, меропенему и гентамицину; в случае цеф-триаксона и ципрофлоксацина изменения чувствительности не сохранялись.
Изменения чувствительности Е. coli АТСС 25922 к цефтриаксону при воздействии разных концентраций МТ имели однонаправленный характер и углублялись при повышении концентрации препарата (за исключением результата, полученного при концентрации МТ 1 мг/л), рисунок 19.
E. faecalis ATCC 29212. Отмечены следующие статистически достоверные изменения в антибиотикорезистентности данного штамма (таблицы 37-39): повышение чувствительности к эритромицину (при культивировании штамма в присутствии концентрации МТ 500 мг/л), снижение - к бензилпенициллину, рифампицину, линезолиду и фурадонину (при концентрации МТ 1 мг/л), гента-мицину (100 мг/л МТ). Изменения чувствительности к ванкомицину имели разнонаправленный характер: при воздействии 1 и 100 мг/л МТ было отмечено снижение чувствительности, при 10 и 500 мг/л МТ - повышение.
При последующих пересевах культур изменённый уровень чувствительности сохранялся в отношении эритромицина и не сохранялся - в случае остальных АБП.
Изменения чувствительности Е. faecalis ATCC 29212 к бензилпенициллину и эритромицину носили однонаправленный характер при всех концентрациях МТ в питательной среде.
Изменённый уровень чувствительности к ципрофлоксацину сохранялся при последующих пересевах штамма и не сохранялся - к остальным антибиотикам.
Изменения чувствительности P. aeruginosa АТСС 27853 к карбеницилли-ну носили однонаправленный характер на всём диапазоне концентраций МТ в МПБ, но различия по данному показателю между опытным и контрольным штаммами оказались статистически недостоверными.
К. pneumoniae 119. Были отмечены следующие статистически достоверные изменения в антибиотикорезистентности данного штамма (таблицы 43-45): повышение чувствительности к полимиксину (при культивировании штамма в присутствии МТ в концентрации 500 мг/л), снижение - к цефтазидиму (100 мг/л МТ), амикацину (все концентрации МТ), тетрациклину (100 и 500 мг/л МТ).
Изменённый уровень чувствительности к тетрациклину и амикацину сохранялся при последующих пересеве и не сохранялся - к остальным АБП.
Изменение чувствительности К. pneumoniae 119 к цефтазидиму, амикацину и ципрофлоксацину (в последнем случае - тенденция) носило однонаправленный характер на всём диапазоне концентраций МТ.
Выявленное снижение чувствительности К. pneumoniae 119 к тетрациклину является наиболее выраженным среди всех отмеченных фактов изменения антибиотикорезистентности взятых для исследования штаммов УПБ: имело место повышение значения МПК в 16 раз по сравнению с исходным уровнем. Было отмечено, что популяция бактерий была неоднородна по данному признаку: в зоне задержки роста вырастали колонии клебсиелл, резистентных к тетрациклину (рисунок 20).
Таким образом, у всех взятых для исследования штаммов УПБ имели место изменения чувствительности к АБП при культивировании на МПБ, содержащем МТ. В целом, преобладали факты сниженния чувствительности по сравнению с исходным уровнем. Изменения антибиотикорезистентности происходили преимущественно при концентрациях МТ в среде культивирования 10 и 100 мг/л, в меньшей степени - 1 и 500 мг/л. Среди взятых для исследования штаммов наибольшее число изменений в чувствительности к АБП было выявлено у S. aureus АТСС25923 и Е. faecalis АТСС 29212.
В ряде случаев изменения чувствительности имели однонаправленный характер на всём диапазоне концентраций МТ, причём для некоторых штаммов величина сдвигов показателей антибиотикорезистентности возрастала по мере увеличения концентрации МТ; при этом следует отметить, что кривая «концентрация МТ - диаметр зоны задержки роста» для всех подобных ситуаций имеет сходную форму, соответствуя повышению чувствительности по сравнению с исходным уровнем.
