Содержание к диссертации
Введение
1. Защита растений от фитопатогенов с помощью рост стимулирующих ризобактерий: роль микроорганизма и растения-хозяина (Обзор литературы) 8
1.1. Ризосфера - область интенсивных микробно-растительных взаимодействий 8
1.2. Ризобактерий как биопестициды 13
1.3. Колонизация корней и конкурентная способность ризобактерий 25
1.4. Влияние генотипа растения на эффективность ассоциаций с микроорганизмами 31
1.5. Выделение корнями растений органических веществ 35
1.6. Влияние корневых выделений на структуру микробных сообществ ризосферы
2. Материалы и методы 47
3. Результаты и обсуждение
3.1. Рост ризобактерий на основных компонентах корневых выделений 58
3.2. Влияние корневых выделений пшеницы с различной плоидностью генома на рост ризобактерий . 63
3.2.1. Рост ризобактерий в условиях, моделирующих ризосферу пшеницы...64
3.2.2. Состав корневых экзометаболитов пшеницы 66
3.3. Колонизация ризобактериями корней пшеницы с различной плоидностью генома 70
3.3.1. Численность клеток ризобактерий на корнях пшеницы с различной плоидностью генома 70
3.3.2. Описание колонизации корней пшеницы штаммами P. chlororaphis SPB1217 и P. fluorescens SPB2137 с использованием флуоресцентной микроскопии 73
3.4. Продуцирование ризосферными псевдомонадами соединений, обладающих антифунгальной активностью з
3.4.1. Ингибирование псевдомонадами роста фитопатогенных грибов 79
3.4.2. Выделение антифунгальных веществ из культуральных жидкостей бактериальных изолятов 82
3.4.3. Продуцирование сидерофоров штаммами P. chlororaphis SPB1217 и P. fluorescens SPB2137 и их связь с антифунгальной активностью в биотестах in vitro 91
3.5. Влияние компонентов корневых выделений на синтез антифунгальных мета болитов ризобактериями 97
3.5.1. Антифунгальная активность ризобактерий при росте на отдельных компонентах корневых выделений 97
3.5.2. Влияние состава питательной среды на синтез антифунгальных соединений штаммом P. chlororaphis SPB1217 103
Заключение 116
Выводы 122
Список литературы
- Ризобактерий как биопестициды
- Влияние корневых выделений на структуру микробных сообществ ризосферы
- Влияние корневых выделений пшеницы с различной плоидностью генома на рост ризобактерий
- Продуцирование ризосферными псевдомонадами соединений, обладающих антифунгальной активностью
Ризобактерий как биопестициды
Почва является местом обитания разнообразных микроорганизмов: бактерий, актиномицетов, грибов, простейших и водорослей. Среди них преобладают бактерии благодаря их способности быстро размножаться и утилизировать широкий спектр органических веществ (Paul, Clark, 1996).
Ризосфера является одним из немногих мест в почве, где вероятен быстрый рост микроорганизмов за счет постоянного притока корневых выделений, которые они могут использовать для поддержания роста и метаболизма (Barber, Lynch, 1971; Barca, Azcon-Aguilar, 1982). Согласно Линчу (Lynch, 1990), область ризосферы подразделяется на эндоризосферу (внутреннюю ризосферу) и экторизосферу (внешнюю ризосферу). Эндоризосфера включает поверхностные слои клеток корня: кортекса, корневого чехлика и эпидермиса. Экторизосфера представляет собой зону почвы, окружающую корень, включающую корневую поверхность, муцигель и отслаивающиеся клетки корня. Большинство авторов использует более узкое понятие ризосферы как области почвы, прилегающей к корню, противопоставляющееся непосредственной поверхности корней - ризоплане. Согласно Ортасу (Ortas, 1997), протяженность ризосферной зоны в радиальном направлении составляет до 390-640 мкм от поверхности корня.
Известно, что концентрация бактерий, обнаруженных в прикорневой зоне, значительно превышает их концентрацию в основной массе почвы. Это явление, известное как ризосферный эффект, было впервые описано еще в 1904 году Хильтнером (Hiltner, 1904). Коэффициент ризосферного эффекта представляет собой отношение численности микроорганизмов в корневой зоне к количеству микроорганизмов, обитающих вне влияния корней (Katznelson, 1946; Кожевин, 1989). Функция, выражаю 9
щая изменение плотности микробной популяции, имеет экспоненциальный характер и является обратной расстоянию от корня (Dijkstra et al., 1987; Paul, Clark, 1996). Электронная микроскопия, теоретическое моделирование и традиционные методы культивирования показали, что в зоне 10-400 мкм наблюдается примерно 10-кратное уменьшение плотности бактериальной популяции по сравнению с непосредственной поверхностью корней (зоной 0-10 мкм) (Newman, Watson, 1977; Malajczuk, 1979; Foster, 1886).
Коэффициент ризосферного эффекта зависит от вида растения. Н.А. Красиль-ников (1958), изучая ризосферу различных культур, пришел к выводу, что общее количество микроорганизмов в прикорневой зоне растений превышало их количество в неризосферной почве в 10-1000 раз в зависимости от вида растения. Ривьер и Шал-виньяк (Riviere, Chalvignac, 1971) на основании имеющихся литературных данных отметили, что коэффициент ризосферного эффекта для различных видов растений варьирует от 2 до 200. Средняя величина коэффициента составляет 25-30.
На развитие ризосферной микрофлоры оказывает влияние не только вид растения, но и его физиологическое состояние (Vrany, 1962). а также агроэкологические условия, в которых это растение произрастает. Это тип почвы (Красильников, 1958; Геллер, Калмыкова, 1878), влажность почвы (Умаров, 1986; Шахназарова и др., 1999; Cook, 1973; Cook et al., 1986), кислотность почвы (Климашевский, 1988), осмотическое давление среды (Polonenko, et al., 1984), применяемые удобрения (Берестецкий, 1978; Епанчинов, 1978; Martin et al., 1983), условия аэрации (Trolldenier, Heche-Buchholz, 1984).
В процессе вегетации растения в ризосфере создаются условия, благоприятные для формирования специфических микробных сообществ. Качественный состав обитателей прикорневой зоны отличается от основной массы почвы. В ризосфере активнее размножаются грамотрицательные неспорообразующие палочки, в то время как грамположительные спорообразующие бациллы более многочисленны в отдаленной почве (Riviere, Chalvignac, 1971). Наиболее распространенными в ризосфере являются бактерии рода Pseudomonas (Возняковская, 1969: Brisbane, Rovira, 1961; Curl, True-love, 1986). Отчетливый ризосферный эффект был также обнаружен для многих гри 10 бов (Vaidehi, Farzana, 1979) и актиномицетов с антибиотическими свойствами (Katznelson, 1965).
В состав ризосферы входят представители различных физиологических групп, в развитии которых отмечены общие закономерности для разнообразных растений. Наиболее активно развиваются азотфиксаторы, аммонификаторы, денитрификаторы, олигонитрофилы, фосфатрастворяющие бактерии. По отношению нитрифицирующим микроорганизмам наблюдается отрицательный ризосферный эффект (Возняковская, 1969; Долгих, Грачева, 1977). С точки зрения современной теории экологических стратегий, большинство ризосферных микроорганизмов было отнесено к г-стратегам, спорообразующие бактерии - к L-стратегам, грибы и большинство актиномицетов - к К-стратегам (Кожевин, 1989).
В ризоплане и примыкающей к ней зоне ризосферы микробное разнообразие существенно выше, чем в более удаленной от корней почве (Foster, Rovira, 1976). Показано, что в ризосферных популяциях происходит интенсификация рекомбинацион-ных процессов, приводящих к повышению биоразнообразия ризобактерий (Лукин, Прозоров, 1994; van Elsas et al., 1988). С помощью современных методов исследования, включающих анализ последовательностей 16S-pPHK, удалось определить широкое нумерическое и филогенетическое разнообразие микрофлоры ризопланы и ризосферы, что было невозможно сделать с использованием традиционных методов культивирования (Grosskopf et al., 1998; Preston et al., 1998).
Микроорганизмы, населяющие ризосферу, могут оказывать на растение нейтральное, полезное или вредное воздействие. Многие микроорганизмы, обитающие в почве и ризосфере, синтезируют фитотоксины - вещества, подавляющие или задерживающие рост растений. Накапливаясь в почве, они вызывают токсикоз почв и снижение урожая сельскохозяйственных культур. Кроме того, попадая в растения, а затем в пищу и корм, фитотоксины могут оказывать отрицательное действие на организм человека и животных (Берестецкий, 1978). Некоторые почвенные бактерии, в частности родов Pseudomonas, Agrobacterium и др., могут быть в той или иной степени патогенными для растений. Однако основной урон сельскому хозяйству наносят фитопатогенные грибы родов Fusarium, Pyihium, Rhizoctonia, VerticUlium и др., являющиеся возбудителями различных гнилей, пятнистости, увядания, скручивания листьев и других заболеваний растений (Билай и др., 1988). В то же время многие почвенные бактерии и грибы способны улучшать рост и здоровье растений. Например, мицелиальный гриб Trichoderma harzianum способен защищать растения от фитопа-тогенных грибов (Lumsden et al., 1989). Арбускулярно-микоризные грибы (AM) положительно воздействуют на растение посредством улучшения его водного режима (Davies et al., 1993) и минерального питания (George et al., 1995), а также повышения его устойчивости к патогенам (Hooker et al., 1994).
Бактерии, положительно влияющие на растения, или PGPR (от англ. "plant growth-promoting rhizobacteria") (Kloepper et al., 1989), представляют собой довольно гетерогенную группу, включающую представителей многих родов, отличающихся уровнем ассоциации с растением. Это могут быть свободноживущие бактерии, которые также часто обнаруживаются вблизи, на поверхности и иногда внутри корня, т.е. образуют ассоциативный симбиоз, или эктосимбиоз, а также бактерии, образующие эндосимбиоз с растением, характеризующийся проникновением микросимбионта в растительные клетки (Lewis, 1985). В настоящее время наиболее хорошо изучены механизмы эндосимбиотических взаимодействий и, в особенности, формирования симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями, или ризобиями (Freiberg et al., 1997; Spaink, 2000; Long, 2001). К полезным почвенным бактериям, способным формировать эктосимбиозы с растением, можно отнести бактерии родов Azotobacter, Агhrobacter, Acetobacter, Azospirilium, Pseudomonas, Bacillus, и некоторые другие (Kloepper et al., 1989; Okon, Labandera-Gonzales, 1994, Thomashow, Weller, 1995).
Влияние корневых выделений на структуру микробных сообществ ризосферы
Размер и состав микробной популяции определяется природой и доступностью энергетических и пищевых источников (Gibson, 1957). Максимальная плотность популяции микроорганизмов в ризосфере не зависит от концентрации бактериального инокулята, а определяется только количеством энергетического материала корневых выделений (Bennet, Lynch, 1981).
Многими исследователями была отмечена зависимость качественного и количественного состава микрофлоры прикорневой зоны от фазы развития растения. Большинство авторов отмечало максимальную численность бактерий в период активного роста растений, когда усиливаются все биологические процессы (Долгих, Грачева, 1977; Брынза и др., 1982). Показано, что изменение состава корневых экзометабо-литов в процессе вегетации растения приводит к преобладанию на разных стадиях его развития микроорганизмов, относимых к различным экологическим стратегиям. В начале вегетации (весной и в первой половине лета) в ризосфере преобладают г-стратеги (неспорообразующие ризобактерии), а к концу сезона (вторая половина лета и осень) - К-стратеги (грибы и актиномицеты) (Кожевин, 1989).
Благодаря использованию современных методов исследования появилось множество экспериментальных доказательств, что варьирование состава экссудатов в зависимости от зоны корня, вида и возраста растения, типа почвы, минерального питания, стрессовых воздействий, заболеваний и других факторов среды приводит к изменению структуры микробных сообществ ризосферы (de Leij et al., 1994; Mahaffee, Kloepper, 1997; Maloney, van Bruggen, 1997; Griffiths et al., 1999; Yang, Crowly, 2000). В процессе роста новых корней экссудаты, выделяемые зоной элонгации вблизи окончания корня, поддерживают рост преимущественно тех колонизаторов, которые утилизируют легко усваивающиеся сахара и органические кислоты. В старых зонах корня ризодепозиты выделяются в основном в виде отслаивающихся клеток и состоят из более трудно усваивающихся материалов, включая лигноцеллюлозу и гемицеллю-лозу, поэтому эти зоны заселены грибами и бактериями, адаптирующимися к олиго-грофным условиям. Зону прорастания боковых корней, являющуюся относительно богатой источниками питания, населяют копиотрофы ( от англ. "copious" — обильный).
Малони и ван Брюгген (Maloney, van Bruggen, 1997) показали, что соотношение численностей К - копиотрофных микроорганизмов, нуждающихся в обильном питании, и О - олиготрофов - в разных зонах корня у различных растений неодинаково. Это может объясняться различием в морфологии корней у отдельных видов растений, и в частности, местами локализации боковых корней, отличающимися наиболее интенсивной экссудацией. В то же время было показано, что в действительности в почве, прилегающей к корню, наблюдаются волнообразные колебания соотношения К:0, и не всегда максимумы совпадают с зонами усиленной экссудации. Это связано как с естественными циклами развития самих микробных популяций, так и с тем, что корень является движущимся источником питания, и выделяемый им поток углерода, также подвержен волнообразным колебаниям (Semenov et al., 1999).
Основную часть микроорганизмов ризосферы составляют гетеротрофы, утилизирующие корневые выделения растений (Nehl et al., 1997). Поэтому непосредственные взаимодействия микроорганизмов через выделение антибиотиков, сигнальных веществ и других экзометаболитов происходит на фоне межвидовой конкуренции за ресурсы, которая в настоящее время считается одним из основных факторов, влияющих на выживание интродуцентов в ризосфере (Белимов и др., 1999; Ikeda et al., 1998). В условиях конкурентных взаимоотношений в почве доминирующую роль играют популяции, обладающие возможностью роста в ризосфере, даже при низкой их первоначальной численности (Звягинцев и др., 1982). Бактерии, выделенные из ризосферы, как правило, оказываются физиологически более активными и размножаются быстрее, чем бактерии из более отдаленной почвы (Rovira, 1956).
Штаммы Pseudomonas fluorescens и P. putida, выделенные из ризосферы различных растений (Vancura, 1980), оказались способными утилизировать многие соединения, содержащиеся в корневых экзометаболитах. Все изучаемые штаммы могли использовать в качестве единственного источника углерода 11 Сахаров, входящих в состав корневых выделений, а из 10 органических кислот не использовали только щавелевую кислоту. Штаммы P. fluorescens не использовали бензойную кислоту, а Р. putida - метионин. Было отмечено, что некоторые штаммы P. putida использовали корневые выделения пшеницы и кукурузы на 73-91%.
Наиболее важным источником углерода для грибов являются углеводы (Лилли, Барнетт, 1953; Shachar-НШ et al., 1995; Pfeffer, et al., 1996). Однако в модельных экспериментах Кравченко (2000) численность грибов была одинаковой при росте на са-харах и органических кислотах. В той же системе спорообразующие бактерии лучше всего росли на сахарах, а псевдомонады - на аминокислотах. Наиболее выгодным источником питания для азоспирилл являются органические кислоты (Papen. Werner, 1982).
Установлено, что утилизация органических кислот является трофической основой колонизации корней томатов штаммом P. fluorescens WCS365, в то время как способность использовать сахара не влияет на уровень колонизации (Lugtenberg. Dekkers, 1999). С помощью мутантов P. fluorescens WCS365, неспособных синтезировать аминокислоты, было показано, что аминокислоты не могут существенно влиять на колонизацию ризосферы этого растения псевдомонадами (Simons et al, 1997).
Шиоми с сотр. (Shiomi et al., 1999) было проведено сравнение структуры бактериальных сообществ ризопланы томата в двух почвах из разных регионов. Одна из почв обладала способностью подавлять бактериальный вилт томата, а вторая - не обладала такой способностью. Оказалось, что бактерии, выделенные из ризопланы томата в первом типе почвы, очень интенсивно утилизировали пектин, являющийся одним из основных компонентов корневых выделений томата. Авторы предполагают, что причиной подавления бактериального вилта данным образцом почвы является то, что патогену трудно доминировать над ризобактериями, которые так успешно развиваются на одном из преобладающих экссудатов.
Влияние корневых выделений пшеницы с различной плоидностью генома на рост ризобактерий
Изучение колонизации корней является очень важным этапом исследования механизмов взаимодействий, происходящих в ризосфере между микроорганизмами и растением. Прочное прикрепление бактерий к корням растений способствует их выживанию в почве, благоприятно для поступления бактериальных экзометаболитов в межклетники корневого кортекса, а также защищает сайты связывания на поверхности корней от колонизации другими, подчас вредными микроорганизмами (Bashan and Holduing, 1987). Известно, что низкая степень защиты растений от фитопатогенов биоконтрольными бактериями часто сопровождается неэффективной колонизацией корней (Schippers et al., 1987).
В данном разделе изучали колонизацию корней пшеницы биоконтрольными ризобактериями P. chlororaphis SPB1217, P. fluorescens SPB2137, Pseudomonas sp. SPB3185 и Я subtilis 11 в условиях моноксеничной культуры. Результаты определения численности бактерий представлены на рис. 6.
Показано, что численность В. subtilis 11 на корнях была на 1-2 порядка ниже, по сравнению со штаммами псевдомонад. Наблюдалось также различие в уровне колонизации и между отдельными штаммами псевдомонад. Численность штаммов Р. chlororaphis SPB1217 и Pseudomonas sp. SPB3185 была выше на корнях диплоидной пшеницы, по сравнению с гексаплоидной, причем у штамма SPB1217 это различие было более выраженным. Численность штамма P. fluorescens SPB2137 была выше на корнях гексаплоидной линии.
В результате сравнения количества клеток на неотмытых корнях и оставшихся после отмывания (табл. 5) было установлено, что клетки штамма SPB1217, в отличие от штамма SPB2137, прикреплялись к корням пшеницы более прочно. Также было выявлено, что уровень адсорбции штамма SPB1217 на корнях диплоидной пшеницы 29 (be) одинаковыми буквами обозначены достоверно неразличимые значения. был существенно выше, чем на корнях гексаплоидной. Штамм SPB2137 также имел тенденцию к более прочному прикреплению к корням диплоидной пшеницы. Многие авторы связывают успешное протекание процессов прикрепления бактерий к корням с наличием комплементарных друг другу поверхностно локализованных рецепторов.
Было отмечено, что в результате инокуляции растений штаммом SPB1217 изменялось развитие корней пшеницы, в то время как штаммы SPB2137 и SPB3185 не оказывали заметного влияния на корни растений. Инокуляция проростков пшеницы штаммом SPB1217 приводила к укорочению и утолщению главных корней и ингиби-рованию роста боковых корней, длина корней уменьшалась на 10-25% по сравнению с контролем без инокуляции. В то же время инокуляция не влияла на длину побегов, при этом их сухой вес даже увеличивался на 30-40%, а сухой вес корней - на 60% (табл. 6).
Таблица 6. Влияние инокуляции штаммом P. chl or or aphis SPB1217 на развитие растений пшеницы Т.топососсит 45024 и Т.сотрасшт 502 Линия пшеницы (уровень плоидности) Корни Побеги Длина, % от контроля Сухой вес, % от контроля Длина, % от контроля Сухой вес, % от контроля 45024 (2п) 50206(6п) 71,5±3,7 89,2±2,4 160,1±19,2131,8±7,2 94,0±8,9 107,3±6,3 139,9±13,0134,2±15,8
В условиях данной модельной системы такое действие инокуляции штаммом Р. chlororaphis SPB1217 на корни пшеницы могло быть следствием относительно высокой концентрации бактерий. С одной стороны, изменение в развитии корней может быть связано с изменением гормонального баланса у растения. Известно, что укорочение и утолщение корней может вызывать этилен, синтезируемый растением в чрезмерно высоких концентрациях (Jackson, 1991: Ecker. 1995). Показано, что обработка растении экзогенным ауксином индолил-3-уксусной кислотой (ИУК) в опытах in vitro приводит к повышению уровня биосинтеза этилена в несколько десятков раз (Лутова и др., 2000). ИУК может синтезироваться как самой бактерией, так и растением в ответ на стимуляцию PGPR (Gaudin et al., 1994). С другой стороны, ингибирующее действие на рост корней могут оказывать выделяемые бактерией токсины, такие как фе-назины (Берестецкий, 1978; Toohey et al., 1965; Thomashow et al., 1990) и цианид водорода (HCN) (Voisard et al, 1989; Schippers et al., 1990; Bakker et al, 1991). Установлено, что штамм SPB1217 является продуцентом феназин-1-карбоновой кислоты (см. раздел 3.4. данной работы) и HCN (Кравченко и др., 1998).
Вследствие того, что исследуемые штаммы оказывали различное влияние на развитие корней пшеницы, разница в численности клеток на отмытых корнях могла определяться уровнем обратной адсорбции, происходящей в процессе отмывки корней. Гексаплоидные линии, по сравнению с диплоидными, имеют более развитую корневую систему с большей площадью поверхности, и на них может адсорбироваться большее количество бактерий. Проведенные нами ранее опыты с азоспирил-лами показали, что численность бактерий на корнях гексаплоидных линий пшеницы существенно выше, чем на корнях диплоидных (Кравченко и др., 1993). Штамм SPB2137 не оказывал существенного влияния на корни пшеницы, поэтому обратная адсорбция могла вносить существенный вклад в его численность. В наших экспериментах инокуляция штаммом SPB1217 приводила к уменьшению площади поверхности корней пшеницы, в результате чего обратная адсорбция могла не играть существенной роли. Также варьирование численности бактерий на корнях пшеницы может быть связано с различным характером колонизации корней пшеницы исследуемыми штаммами псевдомонад.
Продуцирование ризосферными псевдомонадами соединений, обладающих антифунгальной активностью
В результате проведенных исследований установлено, что псевдомонады и бациллы существенно различаются по потребностям в источниках питания. Штаммы Pseudomonas chlor or aphis SPB1217 и P. fluorescens SPB2137 эффективно утилизировали органические кислоты, а сахара - неэффективно. Наивысшую скорость роста псевдомонады развивали на яблочной, лимонной и янтарной кислотах, причем на яблочной кислоте они быстрее всего переходили в экспоненциальную фазу роста. Для Bacillus subtilis 11, напротив, более предпочтительным источником углерода являлись сахара. Полученные данные могут оказаться полезными при изучении энергетической базы процессов формирования эффективных ассоциаций между растением и бактерией в ризосфере. Например, в совместной работе с учеными Лейденского университета, было показано, что у псевдомонад способность к утилизации органических кислот является трофической основой колонизации ими корней томата (Wijfies et al., 1999),
В результате исследований, проведенных в условиях, моделирующих ризосферу пшеницы, было установлено, что бациллы менее интенсивно потребляли в качестве единственного источника углерода корневые выделения пшеницы, чем псевдомонады. Это указывает на большую зависимость псевдомонад от исследуемых растений. В ризосфере диплоидных линий пшеницы рост бактерий рода Pseudomonas был более интенсивен, чем в ризосфере гексаплоидных, что оказалось связанным с особенностями количественного и качественного состава корневых экзометаболитов этих растений.
В стерильных опытах с использованием модельной системы было показано, что с увеличением плоидности генома общее количество органических веществ в корневых выделениях возрастает, но при этом изменяется соотношение между отдельными фракциями: относительное содержание Сахаров существенно возрастает, а процент органических кислот понижается. Соотношение количеств органических кислот к са-харам в корневых выделениях диплоидной линии 45024 составляло 4,6, у тетрапло-идной линии 18777 - 0,8 и у гексаплоидной линии 50206 - 0,6. Корни диплоидной линии Т. топососсит 45024 выделяли в 1,5 раза больше органических кислот, чем тет-раплоидная линия Т. durum 18777 и гексаплоидная - Т. aestivum 1906. При этом количество яблочной кислоты в корневых выделениях диплоидной линии было в 2 раза больше, чем у тетраплоидной, и в 3,5 раза больше, чем у гексаплоидной. Ранее нами было показано, что азоспириллы. для которых органические кислоты являются наиболее предпочтительным источником углерода, также более эффективно потребляют корневые экссудаты диплоидных линий пшеницы (Кравченко и др., 1993). Таким образом, более высокая эффективность использования псевдомонадами корневых экзометаболитов диплоидной линии 45024 может быть связана с относительно высоким содержанием в их составе органических кислот.
При изучении колонизации корней двух линий пшеницы штаммами P. chloro 118 raphis SPB1217, P. fluorescens SPB2137 и Bacillus subtilis 11 было установлено, что бациллы значительно хуже колонизируют корни по сравнению с псевдомонадами. Между псевдомонадами также наблюдались значительные различия в уровне колонизации. Максимальный уровень колонизации корней диплоидной пшеницы Т. топо-соссит 45024 наблюдался при инокуляции штаммом SPB1217. В то же время корни гексаплоидной линии Т. compaction 50206 лучше колонизировал штамм SPB2137. Также было установлено, что клетки штамма SPB1217 наиболее прочно адсорбировались на корнях диплоидной пшеницы.
Для изучения локализации бактерий на поверхности корня было проведено микроскопическое исследование с использованием маркированных штаммов SPB1217-GFP и SPB2137-GFP, которые были получены в данной работе. Было обнаружено, что штамм SPB1217-GFP формирует микроколонии на корнях пшеницы. Микроколонии локализовались на поверхности корня и, предположительно, в местах соединения клеток эпидермиса, где корневые экзометаболиты являются более доступными. Штамм SPB2137-GFP четких микроколоний не образовывал, адсорбировались лишь единичные клетки. Известно, что колонии микроорганизмов более прочно удерживаются на различных поверхностях, чем единичные клетки, благодаря покрывающему их полисахаридному слою. Следовательно, более высокая численность клеток штамма SPB1217 на отмытых корнях пшеницы может быть обусловлена формированием микроколоний. Штамм SPB1217, вероятно, является более зависимым от растения, по сравнению со штаммом SPB2137, и более комплементарным корневой поверхности диплоидной пшеницы.
При инокуляции корней пшеницы штаммом Pseudomonas chlororaphis SPB1217 наблюдалось изменение развития корней, характеризующееся их укорочением и утолщением. Известно, что подобного рода действие на корневую систему может оказывать стрессовый гормон этилен, уровень которого может существенно повышаться под действием ауксина, синтезируемого бактерией. Некоторыми авторами отмечается, что PGPR, вызывая реакцию растения на действие этилена, могут индуцировать его механизмы системной устойчивости (Pieters et al., 1996; Van Loon et al., 1998; Pieters. Van Loon, 1999). Возможно, одним из механизмов действия штамма Р. chlororaphis SPB1217 в экспериментах по биоконтролю является индукция системной устойчивости у растения. В связи с этим было бы интересно продолжить изучение проблемы в данном аспекте.
В результате большого количества биоконтрольных экспериментов с ризобак-териями, продуцирующими антибиотики, проводимых во всем мире, было показано, что их действие по отношению к различным фитопатогенам специфично и зависит от вида поражаемого данным патогеном растения. Нашей задачей было выявить, какие вещества отвечают за антифунгальную активность исследуемых штаммов псевдомонад и какова роль корневых выделений в продуцировании этих метаболитов.
В биотестах in vitro штаммы Pseudomonas chlor or aphis SPB1217, P.fluorescens SPB2137, P. corrugata SPB2142, P. corrugata SPB2184, Pseudomonas sp. SPB3185 и Pseudomonas sp. SPB4087 проявляли селективность антагонистического действия по отношению к различным фитопатогенным грибам (Fusarium culmorum, F. graminea-rum, F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, Verticillium dahliae, Alternaria consortiale). С помощью HPLC-анализа нами было установлено, что экзометаболиты различных видов псевдомонад различаются по качественному и количественному составу. Некоторые из соединений, присутствующих в метаболитах, обладают антифунгальной активностью. Антифунгальными метаболитами штамма P. chlororaphis SPB1217 являются феназин-1-карбоновая кислота и феназин-1-карбоксамид, являющиеся токсичными для грибов, а также еще два неидентифицированных соединения, отличающиеся по химической природе от производных феназина. За антифунгальное действие штамма P. fluorescens SPB2137 отвечают два неидентифицированных вещества, предположительно являющиеся соединениями ароматического ряда. Частично анти-фунгальная активность штаммов P. chlororaphis SPB1217 и P. fluorescens SPB2137 может быть связана с продуцированием бактериальных сидерофоров.
