Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР 12
1.1. Патогенный потенциал золотистых стафилококков 12
1.2. Инфекции, вызываемые S. aureus, в клинике и проблема
управления ими 15
-
Клинические формы и распространенность заболеваний, обусловленных золотистыми стафилококками 15
-
Лечение и специфическая профилактика инфекций, возбудителем которых является S. aureus 18
1.3. Перспективность использования рибосом для конструирования
антистафилококковых препаратов 23
1.3.1. Протективная активность рибосом микроорганизмов..24
1.3.2. Влияние бактериальных рибосом на неспецифическую
резистентность макроорганизма 28
1.3.3.Бактериальные рибосомы и специфический гуморальный
иммунитет 30
-
Бактериальные рибосомы и клеточный иммунитет 33
-
Иммуногенные свойства рибосом золотистых стафилококков 34
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 37
-
Характеристика экспериментального материала 37
-
Питательные среды и буферные системы 39
-
Питательные среды 39
-
Буферные системы 41
2.3. Выделение, идентификация и оценка патогенного потенциала
клинических штаммов S. aureus 42
-
Контингент обследуемых 42
-
Выделение и идентификация клинических изолятов
з
S. aureus 42
-
Взятие и первичный посев исследуемого материала 42
-
Видовая идентификация выделенных культур 42
-
Фаготипирование клинических штаммов S. aureus...43 2.3.3. Оценка патогенного потенциала 43
-
Получение культуральных жидкостей 43
-
Определение активности лецитиназы 44
-
Определение активности плазмокоагулазы 44
-
Измерение гемолитической активности 45
-
Измерение антилизоцимной активности 45
2.3.3.6. Определение пенициллиназной активности 47
2.3.3.7. Тестирование на хлопьеобразующий фактор 47
2.4. Выделение тотальных 70S рибосом 48
-
Получение биомассы 48
-
Дезинтеграция клеток 48
-
Выделение рибосомных фракций 49
-
Хранение рибосомного материала 49
2.5. Контроль качества полученных препаратов 49
-
Спектрофотометрический анализ 49
-
Седиментационный анализ 50
-
Электрофоретический анализ 50
-
Электрофорез рибосомных белков 50
-
Электрофорез рибосомной РНК 50
2.6. Моделирование инфекционного процесса, иммунизация
лабораторных животных, оценка реактогенности и протективных
свойств препаратов 70S рибосом 51
-
Моделирование локализованной формы стафилококковой инфекции 51
-
Иммунизация лабораторных животных 51
-
Оценка реактогенности препаратов рибосом 51
-
Оценка протективного эффекта 52
2.7. Иммунологические исследования 53
-
Забор крови у лабораторных животных 53
-
Тестирование функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов 53
-
Определение фагоцитарной активности 53
-
Оценка функциональной активности микробицидных систем нейтрофильных гранулоцитов 54
-
Спонтанный и стимулированный NBT-тест 55
-
Определение активности миелопероксидазы 55
-
Лизосомально-катионный тест 56
-
Определение активности хлорацетат-А8-Г>эстеразы 56
-
Определение активности щелочной фосфатазы 57
2.7.3. Оценка гуморального звена иммунитета 57
2.7.3.1. Определение антител к плазмокоагулазе и гемотоксинам...57
2.8. Статистическая обработка результатов 58
ГЛАВА 3. ОТБОР ШТАММОВ S. AUREUS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ
ПРЕПАРАТОВ РИБОСОМ 60
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПРЕПАРАТОВ 70S
РИБОСОМ 78
ГЛАВА 5. МОДЕЛИРОВАНИЕ ЛОКАЛИЗОВАННОЙ ФОРМЫ
СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ 84
ГЛАВА 6. ПРОТЕКТИВНЫЙ ЭФФЕКТ 70S РИБОСОМ
S. AUREUS НА МОДЕЛИ ГОМОЛОГИЧНОЙ
ЛОКАЛИЗОВАННОЙ ИНФЕКЦИИ 89
ГЛАВА 7. ИММУНОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ 70S РИБОСОМ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ШТАММОВ S. AUREUS С РАЗЛИЧНЫМИ
ВИРУЛЕНТНЫМИ СВОЙСТВАМИ 95
7.1. Реактогенность полученных препаратов рибосом 96
7.2. Влияние иммунизации 70S рибосомами различных штаммов
S. aureus на количество и популяционный состав лейкоцитов 99
7.3. Влияние 70S рибосом различных штаммов S. aureus
на фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов 101
-
Состояние микробицидных систем нейтрофильных гранулоцитов кроликов, иммунизированных 70S рибосомами различных штаммов золотистых стафилококков 110
-
Протективные свойства препаратов 70S рибосом, полученных из различающихся по вирулентным свойствам штаммов S. aureus 123
-
Влияние иммунизации 70S рибосомами различающихся по вирулентным свойствам штаммов S. aureus на специфический гуморальный
иммунитет 126
ГЛАВА 8. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ ЗОЛОТИСТЫХ СТАФИЛОКОККОВ НА ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ИХ
РИБОСОМ 132
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 139
ВЫВОДЫ 149
ЛИТЕРАТУРА 150
Введение к работе
Актуальность темы. Staphylococcus aureus является возбудителем широкого круга заболеваний, характеризующихся большим разнообразием клинических проявлений как по локализации инфекционного процесса, так и по тяжести его течения. Наиболее восприимчивы к поражениям данной этиологии лица со сниженной иммунобиологической резистентностью. Общепризнано, что наиболее эффективным и экономичным способом снижения инфекционной заболеваемости является использование иммунобиологических препаратов (Воробьёв А.А., 1999, Покровский В.И., Семёнов Б.Ф., 1999).
Арсенал средств для специфической активной иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекций, возбудителем которых является S. aureus, достаточно богат. Он включает вакцинные препараты различных типов: анатоксин, ан-тифагин, корпускулярную, бесклеточную, поликомпонентные и аутовакцины (Медуницын Н.В., 1999). Но, несмотря на успехи в борьбе с распространением S. aureus, относить вызываемые им инфекции к числу эффективно управляемых преждевременно. Золотистые стафилококки по-прежнему занимают одно из ведущих мест в этиологической структуре оппортунистических инфекций (Алексеев А.А. и др., 1999, Яковлев В.П. и др., 1999, Решетников В.А. и др., 1999, Anielsky R., 1998). Остро стоят проблемы профилактики и санации стафилококкового бактерионосительства, а также терапии хронических локализованных инфекционных процессов.
В связи с этим очевидна необходимость пополнения арсенала специфических иммунотропных средств борьбы со стафилококковыми инфекциями более эффективными препаратами. В литературе последних лет широко обсуждаются проблемы и перспективы их создания (Протченко П.З., 1998, Николаев В.Л., Мац А.Н., 1998, Fattom A.I. et al., 1998, Fattom A.I., Naso R., 1996, Lee J.C., 1996, Lee J.C., 1998, Bavaris S., Dyas В., Ulrich R.G., 1996, Woody M.A., Krakaurer Т., Stiles B.G., 1997). Разработки ведутся, главным образом, в 2-х направлениях: поиск новых антигенов и конструирование фортифицированных вакцин на ос- нове уже имеющихся препаратов. Изучаются перспективы использования кол-лагенового адгезина, фибриноген- и фибронектинсвязывающих белков, кап-сульных полисахаридов S. aureus серовариантов 5 и 8, растворимых внеклеточных продуктов. Заслуживают внимания и рибосомы бактерий. Опыт изучения их иммуногенных свойств свидетельствует о высокой протективнои активности и низкой токсичности рибосомных фракций, а также способности оказывать иммунокорригирующее влияние на макроорганизм (Белкин З.П. и др., 1991, Левенсон В.И., Хазанова В.В., 1991, Хаитов P.M. и др., 1995, Akatov А.К., Prok-horov V.Ya., Tolovskaja K.R., 1981, Dussourd d'Hinterland L., Pinel A.M., Rey G., 1980, Nicolaeva L.V., Savel'ev E.P., 1991, Normier G. et al., 1992). В то же время, природа протективных антигенов рибосом и роль факторов вирулентности возбудителя в обеспечении их иммуногенной активности пока не выяснены.
Цели и задачи исследования, основные экспериментальные подходы.
Цель работы - оценка перспективности использования рибосом S. aureus для профилактики локализованной стафилококковой инфекции и определение роли вирулентного потенциала золотистых стафилококков в обеспечении иммуногенных свойств их рибосом. Задачи:
Собрать коллекцию клинических штаммов S. aureus.
Изучить распространённость плазмокоагулазы, лецитиназы, гемоток-сина, хлопьеобразующего и антилизоцимного факторов среди выделенных культур и отобрать штаммы различной вирулентности для сравнительного анализа иммуногенных свойств их рибосом.
Получить и стандартизовать препараты рибосом.
Разработать экспериментальную модель локализованной стафилококковой инфекции.
Изучить влияние плазмокоагулирующей, лецитиназной, гемолитической и антилизоцимной активностей штаммов S. aureus на иммуноген-ный потенциал их рибосом.
Решение поставленных задач, достигалось в результате: проведения бактериологических исследований, направленных на обнаружение различий в фенотипическом проявлении патогенного потенциала у клинических штаммов S. aureus; выделения тотальных 70S рибосом из отобранных по комплексу признаков штаммов золотистых стафилококков методом дифференциального ультрацентрифугирования; стандартизации качества полученных препаратов рибосом в ходе се-диментационного, спектрофотометрического и электрофоретического анализов; моделирования локализованной стафилококковой инфекции у различных лабораторных животных (мышей, морских свинок и кроликов); изучения способности 70S рибосом различных штаммов S. aureus защищать от развития локализованной стафилококковой инфекции; исследования изменений фагоцитарной активности и состояния мик-робицидных систем нейтрофильных гранулоцитов; изучения действия 70S рибосом различающихся по фенотипическому проявлению патогенного потенциала штаммов S. aureus на динамику синтеза антител к гемотоксину и плазмокоагулазе; оценки влияния факторов вирулентности золотистых стафилококков на иммуногенный потенциал его рибосом.
Новизна и теоретическое значение работы. Впервые установлены следующие факты: зависимость иммунотропных эффектов рибосом S. aureus от плазмокоа-гулирующей, лецитиназнои, гемолитической и антилизоцимнои активностей возбудителя; способность 70S рибосом различных штаммов S. aureus защищать макроорганизм от развития локализованной стафилококковой инфекции. Раз- работана схема иммунизации, обеспечивающая высокий уровень протекции; введение животным 70S рибосом золотистых стафилококков в протек-тивных дозах сопровождается увеличением пула циркулирующих в периферической крови лейкоцитов и изменением их популяционного состава с повышением доли лимфоцитов; протективные дозы 70S рибосом S. aureus активируют кислородзависи-мые механизмы биоцидности и повышают уровень миелопероксидазы и катионных белков, но не щелочной фосфатазы и хлорацетат-ASD-эстеразы нейтрофильных гранулоцитов иммунизированных животных; протективные дозы 70S рибосом S. aureus не влияют на динамику образования антител к плазмокоагулазе и гемотоксинам микроорганизма; протективный эффект рибосом не снижается при иммунизации гетероло-гичным по отношению к возбудителю препаратом рибосом S. aureus.
Научно-практическое значение работы
Полученные факты углубляют представления о механизмах реализации протективного эффекта, индуцированного рибосомами прокариот и роли в этом процессе нерибосомных антигенов. Это позволяет более детально осмыслить природу защитных свойств бактериальных рибосом, а, следовательно, шире применять их в конструировании вакцинных препаратов.
Ареактогенность и высокая протективная активность 70S рибосом S. aureus позволяет рекомендовать их к применению в конструировании новых вариантов антистафилококковых вакцин. Выяснение характера влияния факторов вирулентности золотистых стафилококков на иммуногенный потенциал их рибосом определяет подходы к отбору штаммов для получения препаратов с направленной стимуляцией отдельных иммунологических реакций макроорганизма.
Внедрение результатов в практику
По материалам исследования опубликовано 12 печатных работ. Основ ные положения диссертации докладывались на II международной конференции "Современная вакцинология" (г. Пермь, 1998), научно-практической конферен ции молодых учёных и студентов Кубанской государственной медицинской академии (Краснодар, 1999), V краевой научно-практической конференции мо лодых учёных (г. Анапа, 1999), II съезде иммунологов России (г. Сочи, 1999), региональной научно-практической конференции молодых учёных "Развитие социально-культурной сферы Северо-Кавказского региона" (Новороссийск, 2001).
Результаты изучения обстоятельств реализации индуцированного 70S рибосомами S. aureus протективного эффекта и влияния на иммуногенный по тенциал этих препаратов вирулентных свойств возбудителя внедрены в науч ную работу центральной научно-исследовательской лаборатории и кафедры ал- Ф лергологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики Кубанской государственной медицинской академии, лабораторий клинической микробиологии и иммунологии Российского центра функциональной и хирургической гастроэнтерологии, Северо-Кавказского научно-исследовательского института СК НИИ "Биотеххим".
Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры микробиологии Кубанской государственной медицинской академии и кафедры микробиологии и генетики Кубанского государственного университета.
Положения, выносимые на защиту:
70S рибосомы S. aureus обеспечивают высокий уровень протекции при локализованной форме стафилококковой инфекции, причем эффективность создаваемой защиты не снижается при заражении гетерологичным по отноше нию к препарату штаммом; ф формирование протекции происходит на фоне возрастания уровня лимфоцитов и увеличения общего количества лейкоцитов в периферической
11 крови животных, а также повышения интенсивности процессов поглощения микробных клеток нейтрофильными гранулоцитами; в реализации индуцированного рибосомами протективного эффекта антитела к гемотоксину и плазмокоагулазе существенной роли не играют; in vivo 70S рибосомы различных штаммов S. aureus стимулируют активность кислородзависимых и отдельных компонентов (катионные белки и миелопероксидаза) кислороднезависимых микробицидных систем нейтрофиль-ных гранулоцитов; на иммунотропные эффекты 70S рибосом S. aureus оказывают влияние плазмокоагулирующая, гемолитическая, антилизоцимная и, в меньшей степени, лецитиназная активности возбудителя.
Похожие диссертации на Влияние плазмокоагулирующей активности золотистых стафилококков на иммунопротективные свойства их рибосом
