Содержание к диссертации
Введение
1 Физико-химические и биологические свойства почвы 9
2 Влияние загрязнений на биологические характеристики почвы
2.1 Загрязнители природных экосистем 15
2.2 Количественные и качественные характеристики биоценоза почвы при углеводородном загрязнении 17
2.3 Биохимические характеристики биоценоза почвы при углеводородном загрязнении 24
3 Методы очистки загрязненных экосистем 29
3.1 Фиторемедиация 30
3.1.1 Влияние растения на почвенную экосистему. Сообщество микроорганизмов прикорневой почвы 32
3.1.2 Механизмы фиторемедиации 35
3.1.3 Фиторемедиация почв, загрязненных нефтяными углеводородами 38
4 Использование цеолитсодержащей породы в народном хозяйстве 43
4.1 Химическая структура и сорбционная способность 43
4.2 Применение цеолитсодержащей породы в разных отраслях хозяйства 45
4.3 Использование цеолитсодержащей породы для решения экологических проблем 46
Экспериментальная часть 50
5 Материалы и методы 50
5.1 Объекты исследования 50
5.2 Схема опыта 51
5.3 Определение биометрических параметров растений 53
5.4 Определение количества микроорганизмов 53
5.5 Определение биохимических параметров 54
5.6 Статистическая обработка 56
6 Результаты исследовании 57
6.1 Оценка влияния смеси углеводородов и цеолитсодержащей породы на почвенное микробное сообщество 57
6.1.1 Влияние углеводородного загрязнения и цеолитсодержащей породы на количественные характеристики микроорганизмов почвы 57
6.1.2 Ферментативная активность 59
6.1.3 Интенсивность почвенного дыхания 59
6.1.4 Модификация метода измерения почвенного дыхания для почвы с цеолитсодержащей породой 64
6.2 Воздействие почвенного загрязнения углеводородами на вегетацию различных растений и почвенное микробное сообщество 65
6.2.1 Количество выживших растений 66
6.2.2 Биометрические параметры растений 66
6.2.3 Количественные характеристики почвенных микроорганизмов 69
6.2.4 Ферментативная активность 72
6.2.5 Интенсивность почвенного дыхания 72
6.3 Влияния углеводородного загрязнения и цеолитсодержащей породы на вегетацию эспарцета и прикорневое почвенное 75
микробное сообщество
6.3.1 Количество выживших растений 75
6.3.2 Биометрические параметры растения 76
6.3.3 Количественные характеристики почвенного микробиоценоза 76
6.3.4 Ферментативная активность 81
6.3.5 Интенсивность почвенного дыхания 81
7 Обсуждение результатов 85
7.1 Особенности изменения микробных характеристик почвы с цеолитсодержащей породой при загрязнении смесью углеводородов 85
7.2 Изменение биометрических параметров растений и микробного сообщества почвы с вегетацией при загрязнении углеводородами 93
7.3 Биологические параметры загрязненной смесью углеводородов почвы и биометрические параметры эспарцета на фоне внесения в почву цеолитсодержащей породы 99
Выводы 106
Литература 107
- Влияние загрязнений на биологические характеристики почвы
- Влияние растения на почвенную экосистему. Сообщество микроорганизмов прикорневой почвы
- Химическая структура и сорбционная способность
- Определение биометрических параметров растений
Введение к работе
Углеводородное загрязнение является глобальной экологической проблемой и представляет угрозу для почвы, водоемов, подземных вод, источников питьевой воды и, в конечном итоге, для здоровья людей. В условиях города, вблизи топливных предприятий, автозаправочных станций и аэропортов, необходимо предотвращать и устранять загрязнения биотопов, в частности почвы, жидкими нефтяными углеводородами [Кобзев с соавт., 2001]. Почва, благодаря своей большой адсорбирующей поверхности, аккумулирует нефтяные углеводороды (УВ) в больших количествах, и под их влиянием происходят глубокие изменения морфологических, агрохимических, физических свойств почвы, в результате чего она становится токсичной для почвенной флоры и фауны, утрачивает плодородие [Иларионов с соавт., 2003, Киреева с соавт 2001, 2003]. В этих условиях возникает необходимость обезвреживания разливов углеводородного топлива, обладающего высокой токсичностью.
В настоящее время существуют различные методы очистки природных сфер от химических загрязнителей, в том числе от нефтяных УВ. Наиболее перспективными являются микробиологические методы, поскольку, как показано многочисленными исследованиями, именно биодеградация является первичным механизмом удаления УВ соединений из экосистем [Salt et al., 1998, Leahy, Corwell, 1990, Atlas, 1995].
Одним из развивающихся в последние десятилетия экологически безопасным и экономичным методом восстановления нарушенного почвенного плодородия является фиторемедиация [Shaw, Burns, 2003, Siciliano, Germida, 1998].
Для предотвращения распространения по почвенному профилю возможных разливов смеси УВ перспективным представляется применение цеолитсодержащей породы (ЦСП) как сорбента для снижения риска негативного влияния загрязнения [Bowman, 2003, Буров, 2001, Смирнова, 2003], а также последующая реабилитация загрязненных углеводородами экотопов с помощью выращивания растений. Изучение характера влияния ЦСП и выращивания растений на микробиоценоз загрязненной УВ почвы позволит обосновать возможность применения этих мелиорантов и их сочетаний.
Цель и задачи исследований. Цель данной работы - анализ биологической активности микробиоценоза загрязненной нефтяными углеводородами тяжелосуглинистого выщелоченного чернозема РТ при внесении цеолитсодержащей породы и вегетации растений. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Оценить действие цеолитсодержащей породы на биологические характеристики изучаемой почвы (численность аэробных гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов, количество биологического углерода почвы, активность почвенных ферментов дегидрогеназы и уреазы, респираторная активность) при разных уровнях загрязнения смесью нефтяных углеводородов.
2. Выявить влияние вегетации дикорастущих трав РТ (кострец, козлятник, эспарцет) на биологические характеристики загрязненной смесью углеводородов почвы, изучить биометрические параметры растений.
3. Выбрать на основе биометрических параметров растений и биологических характеристик почвы потенциальный фитомелиорант для загрязненного смесью углеводородов выщелоченного чернозема.
4. Выявить влияние углеводородного загрязнения почвы и цеолитсодержащей породы на биометрические параметры растения -выбранного фитомелиоранта.
5. Оценить совместное действие цеолитсодержащей породы и выбранного фитомелиоранта на биологические свойства загрязненного смесью углеводородов выщелоченного чернозема.
Научная новизна. В работе впервые изучено влияние загрязнения выщелоченного чернозема Западного Закамья республики Татарстан углеводородами средней и легкой фракции нефти на микробиологические и биохимические параметры почвы. Впервые охарактеризовано действие сорбционно-активного минерала, содержащего цеолит, на биоценоз исследуемой загрязненной почвы. Впервые дана качественная оценка биометрических параметров (масса корневой и надземной части растения), всхожести семян и устойчивости к загрязнению аборигенных для РТ трав. Впервые в условиях РТ проведены исследования по изучению влияния дикорастущих трав на биологические свойства выщелоченного чернозема. Впервые показано положительное действие местных мелиорантов (ЦСП и травы эспарцета) на микробиоценоз выщелоченного чернозема Западного Закамья республики Татарстан, загрязненного углеводородами средней и легкой фракции нефти.
Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для биологического мониторинга состояния почв при их загрязнении нефтяными углеводородами и проведения профилактических и ремедиационных мероприятий с использованием сорбционно-активных минералов и фиторемедиации. Так как данные приемы выгодно отличаются экономичностью вследствие использования местного минерального сырья и посевного растительного материала полученные результаты по направленной коррекции биологического статуса загрязненного чернозема могут быть основой для разработки биоремедиационных технологий для восстановления почв, в том числе черноземов Татарстана от загрязнения нефтяными УВ.
В ходе экспериментальной работы модифицирована и апробирована методика оценки респираторной активности почвы в сочетании с сорбентом и продемонстрирована возможность ее применения для биомониторинга в ходе ремедиации загрязненных почвенных объектов.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: 6-й международной конференции «Internat. Symp. & Exhibition on Environmental Contamination in Central & Eastern Europe and Commonwelth of Independent States» (г. Прага, 2003), V Республиканской научной конференции «Актуальные проблемы Республики Татарстан» (г. Казань, 2003), 7-й, 8-й и 9-й Пущинских школах-конференциях «Биология-наука 21-го века» (г Пущино, 2003, 2004, 2005), международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (г. Москва, 2004), международной научной конференции «Биотехнология-охране окружающей среды» (г.Москва, 2004), международной научно-практической конференции «Экология фундаментальная и прикладная» (г. Екатеринбург, 2005), а также на семинарах кафедры микробиологии Казанского Государственного Университета.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи, 9 тезисов и материалов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц и 14 рисунков. Библиография содержит 193 наименования работ российских и зарубежных авторов.
Благодарности. Автор выражает глубокую и искреннюю признательность научному руководителю к.б.н., с.н.с. Зариповой С.К., д. б.н., профессору Бреус И.П. и Ларионовой Н.Л. за внимание и помощь в проведении экспериментов, к.х.н. Гарусову А.В. за техническое обеспечение опытов, а также сотрудникам ЦНИИ Геолнеруд доктору геолого-минералогических наук, профессору Лыгиной Т.З., с.н.с Гревцеву В.А. и технику Михайлову А.А. за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований.
Автор искренне благодарит доктора биологических наук, профессора Наумову Р.П. за консультации и участие в обсуждении результатов исследований.
Влияние загрязнений на биологические характеристики почвы
Загрязняющие вещества относятся ко многим классам химических соединений с широким диапазоном функциональных групп. Наиболее распространенными поллютантами являются: нефтяные УВ (смеси н-алканов и других алифатических УВ, моно-, ди- и полиароматические соединения); хлорированные растворители (например, трихлорэтилен); сурфактанты, биоциды (хлорированные фенолы); тяжелые металлы (ртуть, мышьяк, кобальт, медь, цинк и др.) и масса других веществ, выпускаемых промышленностью, например, нитроароматика для военных целей. Ряд загрязнителей не поддаются полному микробному разложению, но многие микроорганизмы могут их трансформировать. Причем образующиеся продукты могут быть как менее, так и более токсичными, чем исходные формы [Philp et al., 2001, Наумов с соавт., 1999, Zaripov et al., 2002, Zaripov et al., 2004].
Взаимодействие загрязнителей с почвенным матриксом включает сорбцию на поверхности почвенных частиц, включение в почвенные микропоры, распределение в жидкой фазе [Christofi, Ivshina, 2002]. Из мелких пор почвы некоторые загрязнители, например УВ, вытесняются водой при поливе, поэтому можно ожидать, что с повышением влажности почвы должна расти их позиционная доступность для микробного окисления [Костерин, Софийская, 2004].
Нефть и нефтепродукты являются одними из самых опасных и широкомасштабных загрязнителей окружающей среды, поскольку при современных объемах добычи их потери составляют 50 млн.т в год.
Нефть - это жидкий природный раствор, состоящий из большого числа углеводородов разнообразного строения и высокомолекулярных смолистоасфальтеновых веществ. Главные нефтеобразующие элементы: углерод (83-87%), водород (12-14%), азот, сера, кислород (1-2%, реже 3-6% за счет серы). Десятые и сотые доли процента нефти составляют многочисленные микроэлементы [Пиковский,1988].
Нефтяные углеводороды можно разделить на четыре класса: насыщенные, ароматические, асфальтены (фенолы, жирные кислоты, кетоны, сложные эфиры, порфирины) и смолы [Leahy, Corwell, 1990]. В зависимости от температуры кипения нефтяных компонентов выделяют несколько фракций нефти. Легкая фракция - смесь УВ, температура кипения которой не превышает 180С, средняя фракция- температура кипения в интервале от 180 до 350С, тяжелая фракция - температура кипения более 350С [Краткая химическая энциклопедия, 1964].
Как известно, некоторые из УВ могут считаться лабильными, поскольку они легко деградируются микроорганизмами (простые алифатические и ароматические вещества), а другие более стойкие и плохо поддаются биоразложению (асфальтены) [Marin et al., 2005]. К стойким УВ относятся ПАУ (полициклические ароматические углеводороды), которые являются гидрофобными и нелетучими веществами. Они сосредоточены в почве в полярной водной фазе и на гидрофобных поверхностях почвенного матрикса. Низкая степень летучести ПАУ связана с их большой молекулярной массой [Aprill, Sims, 1990]. В целом, под действием таких процессов как улетучивание, фототрансформация, вымывание и биотрансформация в почве снижается содержание более лабильных нефтепродуктов, в то время как менее лабильные в ней постепенно накапливаются [Марченко, Соколов, 2001].
Показано, что под влиянием нефтяных УВ происходят глубокие изменения морфологических, агрохимических, физических свойств почвы, поскольку липофильный загрязнитель обволакивает почвенные частицы, что ведет к закупорке воздушных пор и полостей почвы, уменьшая ее воздухопроницаемость. Загрязненная УВ почва становится токсичной для почвенных организмов и утрачивает плодородие [Ильин с соавт., 1982].
Многие липофильные УВ устойчивы к биодеградации вследствие их высокой аффинности по отношению к частицам почвы и низкой растворимости в воде. При попадании в почву УВ загрязнителя в различных горизонтах почвы концентрируются различные УВ. На поверхности почвы (0-3 см) среди УВ преобладают ПАУ. На глубине 10-12 см концентрация ПАУ снижается и преобладают замещенные УВ, в первую очередь нафталины [Чернянский с соавт., 2001].
Влияние растения на почвенную экосистему. Сообщество микроорганизмов прикорневой почвы
Растения влияют на микроклимат почвы, ее температуру, аэрацию, влажность, компенсируют враждебные колебания климата и воздействуют на способность почвы разлагать загрязнения [Cunningham et al., 1995, Qiu et al., 1997, Klose, Tabatabai, 2003]. Тип почвы, внесение удобрений и почвенные экофакторы в свою очередь воздействуют на рост растений. Изменения физико-химических условий в почве отражаются на структуре микробного сообщества [Marschner et al., 2001].
Почвенные химические и физические изменения могут стимулировать или ингибировать активность корней растений. Корневые волоски приводят к образованию каналов и пор, которые увеличивают аэрацию и способствуют обводнению и перемещению растворителя. Ризосфера представляет собой узкую область почвы вдоль поверхности корней растений и является динамичной микробиологической нишей. Она имеет особые физико-химические свойства по сравнению с неризосферной почвой, и эти свойства могут влиять на структуру микробного сообщества [Gramss et al., 1999, Shaw, Burns, 2003]. Ризосферный эффект является совместным действием растений и почвенных микроорганизмов [Siciliano, Germida, 1998]. Ризосферный эффект распространяется в удобренной почве на 2,5мм, а в неудобренной на 1мм [Lynch, 2002]. По данным других авторов влияние растения распространяется в зоне прикорневой почвы на расстоянии от 1,5 мм [Toal et al., 2000] до 9,0 мм [Kandeler et al., 2002].
He совсем ясна проблема конкуренции между растениями и микроорганизмами за химические элементы. Эти взаимоотношения часто являются нечто средним между мутуализмом, комменсализмом и антагонизмом [Nehl et al., 1997].
Микробное сообщество ризосферы имеет некоторые особенности. Так, в ризосферной почве больше грамотрицательных бактерий, а грамположительных бактерий относительно больше в незасеянной почве. Сообщество микроорганизмов более разнообразно около кончика корня [Soderberg et al., 2004]. Однако большая плотность популяции наблюдается в базальной части корня в месте прикрепления к семени [Кураков, Костина, 1997, Кожевин, 1989].
Увеличение количества микроорганизмов в зоне корня основывается на 1. хемотаксисе (бактерии и грибы, находящиеся вдалеке от корня, приближаются к нему в ответ на синтез корнем выделений), 2. способности некоторых видов микроорганизмов мигрировать к ризоплане, утилизировать растворимые экссудаты, быстро размножаться и способствовать росту растения, 3. на прямом развитии определенных видов в микробном сообществе с мутуалистическими преимуществами (например, последовательное разложение недоступных субстратов и горизонтальный транспорт катаболических плазмид) [Burdman et al., 2000].
Обнаружено, что на структуру сообщества влияет тип растения (вследствие различного состава корневых экссудатов, различного возраста растения), зона корня и тип почвы [Marschner et al., 2001]. Например, Даан с соавторами обнаружил, что ризосфера болотных растений содержит иные, отличные от других растений популяции УОМ [Daane et al., 2001].
Замечено, что пик численности бактерий, актиномицетов и грибов в ризосфере растений, совпадающий с максимумом корневых выделений, приходится на 13-14 дни вегетации в лабораторных условиях [Оразова с соавт., 2000] и на 4 неделю вегетации в полевых условиях, а после этого количество корневых выделений падает и к концу вегетации достигает нуля [Красильников, 1958]. Растение выделяет с корневыми экссудатами до 40% углерода от общего количества фотосинтезированных веществ, что не может не привести к принципиальной перестройке почвенных микробных популяций [Lynch, 2002].
Многие авторы отмечают, что корни растений и их ризодепозиты увеличивают количество микроорганизмов и их активность примерно на 2 порядка [Shaw, Burns, 2003, Lee, Banks, 1993, Reynolds et al., 2001, Кравченко, 2001].
Хабрерие обнаружил зависимость между ферментативной активностью и биомассой микробного сообщества почвы под аборигенными травами, но эти же показатели не реагировали на рост высаженных кустарниковых растений [Chabrerie et.al, 2003].
Химическая структура и сорбционная способность
Природные цеолиты являются каркасными алюмосиликатами щелочных и щелочноземельных металлов. Кристаллическая решетка построена из 4х, 5ти, бти-членных и более колец, образованных кремнекислородными тетраидрами. Некоторые атомы кремния замещены алюминием. В результате такого строения в кристаллической структуре цеолитов образуются каналы и поры, которые составляют до 50% объема минерала, что обуславливает его сорбционные свойства [Буров, 2001, Leggo, 1999].
Цеолитовые минералы обладают сравнительно большой скоростью сорбции, которая увеличивается с повышением атмосферного давления, но при длительном процессе сорбции она снижается, так как сорбционная емкость минерала ограничена [Bowman, 2003]. Цеолиты характеризуются большой внутренней и внешней поверхностью и высокой способностью к ионообмену [Son et al., 1999, Nieves et al.,1998]. Адсорбция молекул зависит не только от размеров и количества пор-каналов сорбента, но и от размера и пространственной структуры адсорбированных молекул. Катионами, определяющими заряд цеолита являются Na+, К+, Са2+, Mg2+ [Hernandez et al., 2000]. Молекулы газа или пара проникают в кристаллическую структуру цеолита через несколько каналов. Цеолиты являются хорошими сорбентами, как неорганических ионов, так и органических молекул, которые могут служить в качестве акцепторов электронов [Fuierer et al., 2001, Bowman, 2003].
Поглощающая способность цеолитов связана с химическими особенностями сорбируемых молекул: цеолиты наиболее эффективны в отношении полярных молекул и ненасыщенных УВ [Ишкаев, Шакиров, 2001]. Реакционная способность некоторых сорбированных молекул резко и избирательно увеличивается, в результате чего цеолиты проявляют каталитическую активность во многих реакциях [Shindo et al., 2001].
Процесс сорбции бактерий зависит от различных факторов. Скорость сорбции зависит от концентрации сорбента (по данным Руденко при количестве микроорганизмов 106 КОЕ/мл и концентрации цеолита 15 мг/мл полная сорбция происходила через 3 часа, а при концентрации 7 мг/мл -через 6 часов). Показано также, что она зависит от форм колоний, а, следовательно, и от строения клеточной стенки сорбируемых микроорганизмов: быстрее и полнее сорбируются S-формы, хуже - R-формы. Полнота и скорость сорбции зависит от принадлежности к таксону. Например, Clebsiella pneumonia сорбируется при низких концентрациях сорбента, так как обладает слизистой капсулой; Esherihia coli и Candida albicans - при средних концентрациях сорбента; хуже сорбируются Proteus mirabilis и Streptomices aureus [Руденко с соавт., 2003].
На характер сорбции микроорганизмов оказывают влияние в первую очередь свойства сорбента (в частности, доля сорбционных центров, на которых происходит мгновенная сорбция микроорганизмов) и индивидуальные свойства конкретного микроорганизма (общий заряд поверхности, наличие органов передвижения, возможно, экологическая специфика) [Девин, 2001]. Тионовые бактерии различных видов, окисляющие серу, железо, сульфиды, накапливаются на поверхности цеолита в количестве 108-109кл/г цеолита. При сорбции микроорганизмов минералом они могут расти в порах и на поверхности цеолита, не деградируя его и долго сохранять жизнеспособность [Fuierer et al., 2001, Son et al., 1999, Bowman, 2003].
Применение ЦСП в земледелии и растениеводстве основано на ее способности повышать буферность почвы, увеличивать почвенную влагоемкость, объем корневой системы и повышать прочность стебля растений, сорбировать питательные вещества минеральных удобрений, предохранять их от вымывания, повышать урожайность и улучшать качество сельскохозяйственной продукции, а также увеличивать всхожесть семян, снижать содержание вредных веществ - загрязнителей почв (соли тяжелых металлов, радионуклеиды и т.д.) [Leggo, 1999, Смирнова, 2003, Campbell, Devies, 1996, Буров, 2001, Ишкаев, Шакиров, 2001, Ишкаев с соавт., 2001, Алиев с соавт., 2001, Сафронов, 1988]. Повышение плодородия почвы при внесении в нее цеолита может быть обусловлено увеличением численности почвенных микроорганизмов, поскольку сорбент может содержать в порах не только ионы и молекулы веществ, в том числе и питательных, но и клетки микроорганизмов [Fuierer et al., 2001, Ишкаев, Шакиров, 2001].
При исследовании цеолитсодержащих пород разных месторождений показано, что оптимальное количество вносимого в почву цеолита в сельском хозяйстве 3-15т/га. Цеолит действует эффективно в течение 4-7 лет и даже более длительное время, что зависит от свойств конкретного сорбента. Минерал дополнительно вносит в почву легкоусваевыемые микроэлементы (Cr, Fe, Mn, Mg и др.) и эффективно регулирует кислотно-щелочной баланс прикорневой части растения.
В литературе имеются данные о применении цеолитов в качестве пищевых добавок [Буров с соавт., 2001]. Обнаружено, что использование 5% цеолита для приема внутрь приводит к ингибированию пролиферации клеток, поскольку индуцируются ингибиторы киназ, ответственных за апоптоз, поэтому минералы предлагаются для использования в онкологии [Pavelicetal.,2001].
Определение биометрических параметров растений
Численность аэробных гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов определяли методом высева на твердые питательные среды 10-кратных разведений почвенной суспензии. Исследование численности аэробных гетеротрофных микроорганизмов проводили на МПА. Аэробные углеводородокисляющие микроорганизмы выращивались на синтетической среде следующего состава (г/л дистиллированной воды): (NH4)2S04 - 1 г/л, MgS04 - 0,25 г/л, КН2Р04 - 3 г/л, Na2HP04 12Н20 - 4,5 г/л, керосин - 11 мл/л. Количество микроорганизмов выражали как число КОЕ на 1г воздушносухого субстрата (почва или смесь на ее основе) [Колешко, 1981].
Определение биохимических параметров
Дегидрогеназную активность почвы определяли методом Ленарда, который основан на колориметрическом измерении формазана (ТТФ), образующегося в результате восстановления 2,3,5 триметилтетразолийхлорида (ТТХ). Количество формазана находили по калибровочной кривой, построенной по чистому формазану. Активность выражали в мг формазана на грамм почвы за сутки [Хазиев, 1982].
Уреазную активность почвы определяли методом Каупа, который основан на хроматографическом определении углекислого газа, образовавшегося при уреолитическом разложении мочевины. Для пересчета углекислого газа на мочевину полученное количество С02 умножали на коэффициент 1,27, исходя из того, что 1 г/моль С02 образуется при гидролизе 1,27г/моль мочевины. Активность уреазы выражали в мкг мочевины на грамм сухой почвы за 1 час [Хазиев, 1982].
Респираторную почвенную активность определяли методом газовой хроматографии и выражали в мг С02 на кг почвы в час (Гарусов с соавт., 1999). Определяли скорость продуцирования С02 необогащенной почвы (базальное - VBAS) И обогащенной глюкозой в концентрации 10% (субстрат-индуцированное дыхание - VSIR). Величину коэффициента микробного дыхания (QR) рассчитывали как отношение VBAS /VSIR [Благодатская, Ананьева, 1996]. Все измерения проводили в 3-5-ти кратной повторности.
Количество выделившегося С02 определяли на хроматографе «Chrom-5», оснащенном насыпной хроматографической колонкой (длина - 2,5 м, внутренний диаметр 4 мм), твердая фаза - силикагель L (зернение 0,20-0,25 мм); тип детектора - катарометр; газ-носитель - Не2, расход через колонку -30 мл/мин, Т испарителя и детектора - 70С [Гарусов с соавт., 1999].
Количественный расчет проводился по формуле: Рсо2=0.0121 ССО2 СУф-0.7Vn)(P-17.5), где Ссо2 - процентное содержание С02 в пенициллиновом флаконе, Уф -объем флакона, см , Уп - объем почвы,см , 0,7 - коэффициент, учитывающий рыхлость почвы, Р - атмосферное давление, 17,5 - давление паров воды.
Количество почвенного биологического углерода определяли методом Охлингера фумигации-экстракции почвенных образцов. Почвенные образцы выдерживали в парах хлороформа 24 часа. Контролем являлись образцы, не обработанные парами хлороформа. Затем проводили эвакуацию паров и для экстракции органического углерода почвенные образцы перемешивали с сульфатом калия. Содержание углерода в образце определяли дихроматным окислением почвенного экстракта с последующим титрованием опытного раствора индикаторным раствором медно-(2)-аммонийного сульфата. Количество биологического углерода выражали в мг микробного углерода на г сухого вещества почвы [Schinner etal., 1996].
Количественный расчет количества растворимого органического углерода проводился по формуле: Сорг= (B-S) 0,3 V 1000 100/т1 а %св, где
В — объем раствора медно-(2)-аммонийного сульфата, пошедший на титрование холостой пробы, S - объем раствора медно-(2)-аммонийного сульфата, пошедший на титрование опытной пробы, 0,3 - пересчетный коэффициент (1мл раствора медно-(2)-аммонийного сульфата соответствует 0,3мг С), V - объем экстракта, 1000 - пересчетный коэффициент, %св:100 -пересчет на сухое вещество, ml — аликвота экстракта, а — начальный вес почвы.
Исходя из получившегося количества растворимого органического углерода, по формуле рассчитывали количество биологического углерода: Сбиол=8-С/0,35, где S — среднее значение растворимого углерода в опытном образце, С -среднее значение растворимого углерода в контрольном образце, 0,35 — пересчетный коэффициент.
