Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биосурфактанты микробного происхождения
1.1. Природа, структура, типы 9
1.2. Физиологическая роль биосурфактантов 25
1.3. Влияние физико-химических факторов на синтез биосурфактнтов 27
1.4. Практическое применение биосурфактантов 30
1.5. Характеристика Л/юс/асосси.у-биосурфактантов 33
Глава 2. Влияние биосурфактантов на процесс разрушения нефтяных углеводородов в почве
2.1. Характеристика нефтяного загрязнения 37
2.2. Пути естественной деградации нефти в почве 40
2.3. Способы биологической очистки нефтезагрязненных почв 42
Глава 3. Материалы и методы исследования
3.1. Микроорганизмы и условия их культивирования 52
3.2. Определение поверхностной, межфазной и эмульгирующей активности биосурфактантов 52
3.3. Изучение нефтеотмывающих свойств Rhodococcus-биосурфактантов 54
3.4. Изучение процесса десорбции и мобилизации нефти в модельной почве под действием (био)сурфактантов 57
3.5. Математическое моделирование процесса нефтеотмывания почвы 59
3.6. Лабораторные эксперименты по биоремедиации нефтезагрязненной почвы 61
3.7. Полевые исследования по биоремедиации нефтезагрязненной почвы 62
3.8. Микробиологические исследования 63
3.9. Аналитические методы исследования 64
3.10. Определение фитотоксичности 65
3.11. Статистическая обработка результатов 66
Экспериментальная часть
Глава 4. Функциональная характеристика Rhodococcm-биосурфактантов 61
Глава 5. Оценка нефтеотмывающих свойств Rhodococcm-биосурфактантов 76
Глава 6. Исследование процесса десорбции и мобилизации нефти в почве под воздействием (био)сурфактантов
Заключение 121
Выводы 124
Список литературы 125
- Влияние физико-химических факторов на синтез биосурфактнтов
- Способы биологической очистки нефтезагрязненных почв
- Изучение нефтеотмывающих свойств Rhodococcus-биосурфактантов
- Оценка нефтеотмывающих свойств Rhodococcm-биосурфактантов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Загрязнение окружающей среды сырой нефтью и нефтепродуктами является важной экологической проблемой, возникающей в процессе добычи, транспорта и переработки нефти. Почва аккумулирует нефтяное загрязнение в большей степени по сравнению с атмосферой и природными водами. Нефтяные углеводороды оказывают негативное влияние на агрофизические и агрохимические свойства почвы, делая ее непригодной для ведения сельского хозяйства. Оптимальное сочетание агротехнических мероприятий позволяет снизить уровень почвенного загрязнения на 30-40% в основном за счет окисления легкодеградируемых компонентов нефти. При этом высокомолекулярные парафины, полиароматические и гетероциклические соединения адсорбируются почвенными частицами и становятся недоступными для микроорганизмов, что приводит к замедлению процессов самоочищения почвы (Коронелли, 1996; Boronin, 2001). Для повышения биодоступности гидрофобных поллютантов широко используют поверхностно-активные вещества (сурфактанты), которые способствуют десорбции и солюбилизации нефтяных углеводородов, тем самым, обеспечивая их ассимиляцию микробными клетками. Однако применяемые с этой целью синтетические сурфактанты представляют собой токсичные вещества с низкой степенью деградабелыюсти (Mulligan et al., 2001; Cort et al., 2002; Noordman et al, 2002; Doong, Lei, 2003). Накопление их в почве приводит к ее вторичному загрязнению, имеются сведения (Brucheim et al, 1999; Jahan et al., 1999) о подавлении углевод ородокисляющей активности почвенных бактерий при внесении синтетических сурфактантов.
Наиболее перспективным представляется использование
биосурфактаптов микробного происхождения, ибо они характеризуются низкой токсичностью, легкой биодеградабельностью, устойчивой активностью в экстремальных условиях среды (Коронелли и др., 1993; Desai, Banat, 1997; Lang, Wagner, 1999; Christofi, Ivshina, 2002; Makkar, Cameotra,
5 2002). Известно, что активными продуцентами биосурфактантов являются актинобактерии рода Rhodococcus (Коронелли 1984, 1988; Ившина и др., 1993, 1995; Kuyukina et ah, 2005). Установлено, что синтез биосурфактантов клетками родококков индуцируется только в присутствии жидких углеводородов; Rhodococcus-биосурфактаты представляют собой гликолипидные комплексы с широким спектром функциональной активности (Куюкина, 2006; Lang, Philp, 1998; Philp et al, 2002).
Следует отметить, что, несмотря на всё возрастающий интерес к бактериальным сурфактантам как агентам биоремедиации, до сих пор недостаточно изучены особенности их влияния на почвенные биоценозы, а также механизмы десорбции нефтяных углеводородов от почвенных частиц под воздействием биосурфактантов.
Цель настоящей работы - изучение влияния Rhodococcus-биосурфактантов на процессы десорбции и разрушения нефтяных углеводородов в почве.
Основные задачи исследования
Среди культур, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, ), отобрать штаммы родококков - активные продуценты биосурфактантов.
Определить нефтеэмульгирующую и нефтеотмывающую активность биосурфактантов, синтезируемых родококками при росте на жидких н-алканах.
Провести сравнительные исследования особенностей процессов десорбции и мобилизации нефтяных углеводородов в почве под действием биогенных и синтетических сурфактантов.
Оценить возможность использования Я/юс/ососси.у-биосурфактантов для биоремедиации нефтезагрязненной почвы в лабораторных и полевых условиях.
Научная новизна. На основе изучения большого массива коллекционных штаммов Rhodococcus spp. отобраны культуры родококков, синтезирующие биосурфактанты с высокой поверхностной и межфазной активностью при росте на жидких н-алканах. Установлено, что Rhodococcus-биосурфактанты характеризуются выраженными эмульгирующими свойствами и способствуют формированию стабильных (Е24=54-86%) водно-углеводородных эмульсий из сырой нефти и нефтепродуктов. Определены эффективная доза (2,0 г/л) внесения биосурфактантов и оптимальные условия десорбции нефтяных углеводородов от почвенных частиц под воздействием Rhodococcus-биосурфактантов. Выявлено, что биосурфактанты, продуцируемые родококками при росте на н-додекане (С^), наиболее эффективны в процессах нефтеотмывания почвы при низкой (10-15С) температуре. Экспериментально обосновано положительное влияние Rhodococcus-бтсурфжшпов на процессы микробиологической деструкции нефтяных углеводородов в почве.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о роли актинобактерий рода Rhodococcus в процессах восстановления нефтезагрязненной почвы, раскрывают механизмы десорбции нефтяных углеводородов от почвенных частиц под действием биосурфактантов, а также подтверждают целесообразность и необходимость использования /?/го^ососс«5-биосурфактантов в биотехнологиях очистки нефтезагрязненных почв. В результате проведенных исследований отобраны штаммы родококков, активно продуцирующих биосурфактанты с высокой нефтеэмульгирующей и нефтеотмывающей активностью. Разработана математическая модель процесса фильтрации нефтяных углеводородов в почве под воздействием биосурфактантов, на основании которой осуществлен прогноз интенсивности распространения нефтяного загрязнения в почве, а также выбор адекватного способа применения биосурфактантов для восстановления нефтезагрязненной почвы. Определены оптимальные условия применения Rhodococcus-бтсурфактаіпов в сочетании с
7 агротехническими приемами для ускорения процесса биоремедиации нефтезагрязненной почвы.
Основные положения, выносимые на защиту
Биосурфактанты, синтезируемые актинобактериями рода Rhodococcus при росте на жидких н-алканах, характеризуются высокой нефтеэмульгирующей активностью.
Нефтеотмывающая активность Rhodococcus-бтсурфактантов зависит от температуры внешней среды. В холодных (10-15С) условиях процесс десорбции нефти наиболее эффективно протекает при использовании биосурфактантов, продуцируемых родококками при росте на н-додекане.
Rhodococcus-биосур^актаты оказывают стимулирующее воздействие на развитие бактериального и растительного ценозов нефтезагрязненной почвы.
Внесение Rhodococcus-биосурфактантов способствует ускорению процесса биодеградации нефтяных углеводородов в почве и повышению степени эффективности биоремедиации нефтезагрязненных почв.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Москва-Пермь, 1993; VI Всероссийской научной конференции «Новые направления биотехнологии», Пущино, 1994; Международном конгрессе по нефтяному загрязнению почвы, Лондон, 2001; II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь-Казань-Пермь, 2005; III Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Связь работы с крупными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики
8 микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение и сохранение функционального и видового разнообразия алканотрофных родококков in/ex situ, полезного для экоценозов и практической деятельности человека» (индекс приоритетного направления 5.28, номер госрегистрации 01.9. 70 005279). Исследования поддержаны грантами РФФИ № 04-04-97518р.офи и ИНТАС 01-2151.
Объем и структура работы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 18 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 240 наименований, в том числе 67 на русском и 173 на английском языках.
Благодарности. Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность своему научному руководителю чл.-корр. РАН И.Б. Ившиной, а также коллективу лаборатории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН за помощь и поддержку на всех этапах диссертационной работы.
Влияние физико-химических факторов на синтез биосурфактнтов
Биосинтез сурфактантов может быть непосредственно связан с клеточным ростом бактериальной культуры. При этом его можно стимулировать добавлением избытка ростового субстрата, оптимизацией состава питательной среды, дополнительным внесением веществ, изменяющих проницаемость клеточной стенки, а также путем изменения активности кислотности среды, концентрации растворенного кислорода и т.д. (Adamczak, Bednarski, 2000). В частности, для индукции синтеза биосурфактантов клетками алканотрофных родококков, по-видимому, необходимо присутствие липофилыюго субстрата. Так, гликолипиды R. erythropolis синтезируются при использовании культуральных сред, содержащих //-алканы или жирные спирты в качестве единственного источника углерода, и не продуцируются при культивировании родококков на углеводах, глицероле, пропаноле, пирувате, сукцинате или дрожжевом экстракте (Kretschmer et al, 1982; Ushida et al, 1989a). Изменяя состав питательной среды, возможно модифицировать химическую структуру синтезируемых гликолипидов (Елисеев, Кучер, 1991). Кроме того, на процесс синтеза биосурфактантов влияет длина цепи углеводородного субстрата. Так, образование эмульгирующих и поверхностно-активных компонентов коринеформными бактериями максимально при использовании н-алканов с длиной цепи углеродной цепи от 12 до 14 атомов (Cooper, Zajic, 1980).
Важную роль в процессе синтеза биосурфактантов играет источник азота или факторов его лимитирования в среде выращивания (Suzuki et al., 1969; Guerra-Santos et al, 1984). Так, синтез биосурфактантов бактериями рода Arthrobacter увеличивается при внесении в среду аминокислот (глицина, глутаминовой кислоты). Установлено (Ившина и др. 1993; Куюкина, 2006), что для синтеза биосурфактантов клетками родококков использование сульфата аммония в качестве источника азота более благоприятно по сравнению с нитратными солями. Так, наибольший выход биосурфактанта отмечается в среде с соотношением концентраций сульфата аммония к н-алканам 1:15. Следует отметить, что влияние лимитирующих факторов на процесс биосинтеза сурфактантов, по - видимому, не является строго специфичным и отражается, прежде всего, на физиологическом состоянии микроорганизмов-продуцентов (Елисеев, Кучер, 1991).
J. Desai и I. Banat (1997) отмечают, что процессы синтеза биосурфактантов и роста бактериальных клеток часто имеют различные оптимумы значений рН и температуры. Молекулы биосурфактантов стабильны при значениях рН в пределах от 5,5 до 12, но их активность снижается в более кислых условиях. Интересно, что микроорганизмы продуцируют сурфактанты при росте, как в аэробных, так и в анаэробных условиях, а также в присутствии высокой (до 8%) концентрации хлорида натрия (Georgiou et al., 1992). Температура является регулирующим фактором в процессе биосинтеза сурфактантов у представителей артробактеров, псевдомонад и родококков. В ряде случаев от температуры зависит не только количественный выход синтезируемых бисурфактантов, но и их качественный состав. При выращивании коринебактерий в биореакторе установлена зависимость между интенсивностью процесса синтеза биосурфактантов и скоростью вращения перемешивающего устройства, а также степенью насыщенности питательной среды кислородом (Desai, Banat, 1997).
Синтез биосурфактантов растущей бактериальной культурой может активироваться или ингибироваться при наличии или отсутствии в среде культивирования антибиотиков, биологически-активных веществ. Так, пеницилин стимулирует синтез липотейхоевой кислоты у стрептококков. Значительное влияние на процесс синтеза биосурфактантов представителями псевдомонад оказывают ионы железа и магния (Елисеев, Кучер, 1991).Установлєно, что синтез биосурфактанта клетками Ps. aeruginosa Б8 происходит только в присутствии ионов магния (Jain et ah, 1992). Присутствие таких органических веществ, как пропанол, бутанол, гексанол, деканол, циклогексан снижает скорость роста бактериальных клеток и образования гликолипидов. Анионные, неионные и катионные детергенты оказывают негативное влияние на скорость клеточного роста и количество синтезируемых сурфактантов. Снижение гликолипидной продукции наблюдается при добавлении в среду ингибиторов жирнокислотной деградации (акриловой кислоты, флуорида), по-видимому, в результате ингибирования процесса субстратного ассимилирования (Kretschmer et al., 1982).
Синтез биосурфактантов может осуществляться не только растущими, но и покоящимися бактериальными клетками. Иммобилизация клеток-биопродуцентов позволяет значительно увеличить выход биосурфактантов. Так, использование специальных иммобилизационных колонок с полимерными носителями не только исключает ингибирование процесса биосинтеза конечным продуктом, но и снижает процесс пенообразования, часто сопровождающий процесс синтеза биосурфактантов. Данный метод успешно применяется в производстве рамнолипидов покоящимися клетками псевдомонад, софорозолипидов - дрожжами рода Torulopsis и Candida, трегалозолипидов - родококками, целлобиозолипидов - грибами Ustilago spp. (Inoue, Itoh, 1982; Robert et al., 1989; Vardar-Sucar et al, 2000).
Способы биологической очистки нефтезагрязненных почв
Актуальной задачей экологов является поиск методов интенсификации процессов естественной деградации нефти в нефтезагрязненных экосистемах. Первоначально для очистки загрязненных почв использовали физические методы, в частности, выжигание пролитой нефти или землевание. Однако эти методы не способствуют восстановлению плодородия почвы и растительного покрова и, кроме того, часто сами наносят долговременный экологический ущерб. К тому же эти методы являются трудоемкими и капиталозатратными. Их эффективность, однако, может быть значительно повышена при использовании в сочетании с другими, в частности, физико-химическими методами. Суть последних заключается в том, чтобы с помощью различных приемов (обработка почвы паром, отмывание растворителями, сурфактантами, горячей водой и использование сорбентов) отделить пролитую нефть от грунта.
В последние годы все большее значение приобретают биологические методы {биоремедиация) восстановления поврежденных экосистем как наиболее экологически безопасные. Эти методы разрушения углеводородов применяют в тех случаях, когда количество их слишком мало, чтобы применить механические средства сбора, но, с другой стороны, слишком велико, чтобы использовать загрязненные земли и воду в хозяйственных целях (Коронелли, 1996). В акваториях такому уровню соответствует нефтяная пленка толщиной до 1 мм, в почвах - содержание углеводородов до 5% от веса почвы (Atlas, 1981; Atlas, Bartha, 1992).
Биоремедиация включает в себя комплекс приемов и технологий, задачей которых является использование биохимического потенциала аборигенных, адаптированных или модифицированных биологических систем, прежде всего, микроорганизмов, для деградации и детоксикации поллютантов. В отличие от промышленной биотехнологии, позволяющей осуществлять строгий контроль всех параметров технологического процесса, биоремедиация проводится в открытых экосистемах, в трудно контролируемых условиях. Поэтому успех работы по биоремедиации в значительной степени зависит от критической массы фундаментальных знаний, методологического опыта, методов, и, наконец, наличия микроорганизмов, способных эффективно осуществлять реакции биодеградации поллютантов. В известной мере данный процесс всегда является «ноу-хау», определяемым вышеперечисленными возможностями и обстоятельствами (Boronin, 2001).
Разработка теоретических основ процесса биоремедиации, конкретных технологий и их осуществление требуют междисциплинарного подхода и участия специалистов в области микробиологии, генетики и молекулярной биологии, экологии, химии и инженерных дисциплин. Однако главная роль в этом научном содружестве принадлежит микробиологической науке, поскольку разработка стратегий и методов биоремедиации, в первую очередь, требует углубленных знаний биологии, экологии и эволюции микроорганизмов-деструкторов загрязнителей (Коронелли, 1996). Существуют два принципиальных подхода к биодеградации нефтяных углеводородов в природной среде: (1) стимуляция естественной нефтеокисляющей микрофлоры путем создания оптимальных условий для ее развития (внесение азотно-фосфорных удобрений, увлажнение, аэрация и др.); (2) введение (интродукция-) в загрязненную экосистему активных углеводородокисляющих микроорганизмов наряду с питательными минеральными добавками - биоаугментация. Оба подхода активно разрабатываются специалистами разных стран. Следует отметить, что при этом не существует однозначной точки зрения на эффективность того или другого подхода, их применение определяется, прежде всего, конкретными экологическими условиями. Однако противопоставление этих двух подходов, очевидно, не имеет смысла, поскольку для каждого из них существует своя область применения. Развитие углеводородокисляющих популяций микроорганизмов в естественной среде, подвергшейся нефтяному загрязнению, лимитируется следующими основными факторами: низкой температурой, недостатком кислорода, питательных элементов (прежде всего, азота, фосфора), избыточной плотностью микробной популяции (Коронели, 1996).
Известно много способов эффективного стимулирования развития естественных углеводородокисляющих бактерий в почвенной среде. Так, существует целый ряд агротехнических приемов, направленных на активизацию процессов самоочищения почвы, как-то: распашка и рыхление, которые улучшают аэрацию; увлажнение в сухой период и использование дренажных систем при избыточной влажности; внесение в почву органического материала (соломы, навоза), минеральных удобрений. (Radwan et al, 2000; Del Arco, de Franca, 2001; Vasuderan, Rajaram, 2001). Для улучшения механической структуры и повышения уровня аэрации в почву вносят различные типы разрыхлителей (полимерную крошку, древесную щепу и стружку). Оптимальное сочетание агротехнических мероприятий позволяет снизить уровень загрязнения, как правило, на 30-40%, в основном за счет легко деградируемых компонентов нефти (Christofi et al, 1998). Однако при этом высокомолекулярные парафины, ароматические и полициклические соединения, содержание которых в сырых нефтях колеблется от 20 до 65%, не разрушаются в течение ряда лет. Данные соединения прочно связываются с почвенными частицами, образуя гидрофобные пленки, и становятся практически недоступными для ферментных систем микроорганизмов (Banat, 1993; Ivshina et ah, 1998; Christofi, Ivshina, 2002).
Изучение нефтеотмывающих свойств Rhodococcus-биосурфактантов
В работе использовали модельную почву (песок - 40; глина - 40; чернозем - 20%), которую перед началом эксперимента высушивали при 105С в течение 3 ч и просеивали через сито (диаметр пор 2 мм). Стеклянные колонки (длина 57 см, диаметр 3,0 см) со стеклянным волокном на дне заполняли модельной почвой, в которую вносили дистиллированную воду до достижения уровня относительной влажности 20%. Увлажненную почву пропитывали нефтью {см. табл. 4), отобранной на территории Чашкинского нефтяного месторождения Пермского края, в концентрации 10 вес. %. Основные физические параметры модельной почвы (табл. 6) определяли стандартными методами (Вадюнина, Корчагина, 1986; Klute, 1986). В процессах нефтеотмывания модельной почвы использовали дистиллированную воду (контроль) и растворы сурфактантов -синтетического (Твин 60, Sigma) и биогенных (синтезируемых клетками R. ruber ИЭГМ 231 в присутствии я-додекана либо //-гексадекана). Однородные эмульсии биосурфактантов (300 мл), полученные с помощью ультразвуковой обработки (23 кГц; 1 мин), вносили в почвенные колонки на поверхность нефтезагрязненной почвы. Эксперименты проводили при различных (15, 22 и 28С) температурах. Степень проникновения исследуемых растворов через модельные почвенные колонки регистрировали через 15 мин, а затем через 30 мин и в течение часа. Элюенты из почвенных колонок собирали и разделяли с помощью делительной воронки. Полученную нефтяную фракцию использовали для химического анализа.
Эффективность нефтеотмывания почвы определяли гравиметрически по количеству остаточной нефти в почве, экстрагированной хлороформом.
Разработку математической модели процесса десорбции/мобилизации нефти в почве под действием биосурфактантов, синтезируемых клетками R. ruber ИЭГМ 231, осуществляли с использованием теории фильтрации несмешиваюшихся жидкостей (Полубаринова-Кочина, 1977) совместно с доцентом кафедры теоретической механики Пермского государственного университета, д. ф.-м. н. СО. Макаровым.
Построенная математическая модель описывает процесс просачивания ньютоновских жидкостей (воды и нефти) через почву, которую рассматривают как гомогенную пористую среду. Модельная почвенная колонка представляет собой простую геометрическую модель, т. е. прямой цилиндр бесконечно большого радиуса и высоты, ограниченный сверху плоской горизонтальной поверхностью z = 0. Процесс фильтрации жидкости в пористой среде происходит в направлении силы тяжести S=ez- В начальный момент времени t = 0 на плоскую поверхность среды z = 0 наливается слой жидкости высотой ho. К моменту времени / жидкость просачивается через почву на глубину z = H(t). Процесс фильтрации происходит под действием силы тяжести g и формируемого капиллярными силами всасывающего отрицательного давления - q (Аа), которое зависит от угла смачивания между жидкой и твердой фазами и поверхностным натяжением (Да) сухих и смоченных почвенных частиц (Moseley, Dhir, 1996). В связи с тем, что внешнее давление принимается равным 0, давление на плоскости z = 0 определяется как р (z = 0,/) = pgh(t), а на границе между смоченной и сухой почвой внутри пористого матрикса давление определяется как где и (см/с) - скорость фильтрации; / (с) - время; р (г/см3) - плотность воды или нефти; р (Па) - давление; g (см/с ) - гравитационная постоянная; ц (г/см-с) - кинематическая вязкость жидкости; К (см ) - коэффициент проницаемости почвы, q(Aa) - капиллярное давление; Н (см) - уровень проникновения воды или нефти; h (см) - расстояние между водой/нефтью и почвенной поверхностью. Уравнение (2) описывает начало опыта, когда t - О, Я = 0 и в почвенной колонке нет жидкости. Уравнение (3) описывает условия, когда z = 0, и вода/нефть находится на поверхности почвы; в уравнении (4) отражены условия проникновения воды/нефти через почвенную колонку. Для построения теоретической кривой использовали программу, написанную на языке Turbo Pascal 7. На основании данных эксперимента с использованием модельной почвенной колонки проведена сравнительная характеристика экспериментальных и теоретически полученных графиков зависимости скорости просачивания воды/нефти в почве от времени при разных температурах.
Оценка нефтеотмывающих свойств Rhodococcm-биосурфактантов
Известно (Коропелли и др., 1994; Atlas, Bartha, 1992; Radwan et al, 2000), что биологические методы разрушения нефтяных углеводородов используют в том случае, когда их количество слишком мало для применения механических средств сбора нефти, но, с другой стороны, слишком велико, чтобы использовать загрязненные земли в хозяйственных целях. В почвах такому уровню соответствует содержание нефти 5 вес. % (Сидоров и др., 1997; Алехин и др., 1998). В связи с этим, в лабораторных условиях нами проводилась оценка эффективности использования /Мо /ососсг -биосурфактантов из R. ruber ИЭГМ 231 в процессе биоремедиации сельскохозяйственной почвы, искусственно загрязненной нефтью в концентрации 1,0 и 5,0 вес. %. Поскольку численность и состав почвенной микробиоты являются наиболее чувствительными биоиндикаторами изменений, происходящих в нефтезагрязиенной почве (Киреева и др., 2001; Мицевич, 2005), проводился регулярный мониторинг состояния почвенного бактериоценоза в течение всего эксперимента. Результаты микробиологического анализа показали (табл. 14), что в исследуемой сельскохозяйственной почве, отобранной на территории Межевского нефтяного месторождения, изначально присутствуют гетеротрофные и углеводородокисляющие бактерии в количестве 1,4x10 и 3,2x105 клеток/г почвы, соответственно. По нашим данным, на протяжении всего эксперимента численность гстеротрофов и углеводородокислителей в почве, не подверженной загрязнению, не испытывает резких колебаний и сохраняется на уровне 107и 105 клеток/г, соответственно. 100
В то же время, результаты агрохимического анализа сельскохозяйственной почвы (табл. 15) свидетельствуют о том, что исследуемая почва характеризуется относительно низким значением показателя кислотности (рН=5-6) и недостаточным содержанием азота для осуществления процесса биологического восстановления (Алехин и др., 1998). В связи с этим, с целью оптимизации питательного минерального баланса в контрольные и опытные варианты вносили сбалансированную минеральную добавку, содержащую необходимые элементы: азот, фосфор и калий в соотношении 70:5:1. В результате внесения минеральных солей в подобранном соотношении показатель кислотности исследуемой почвы достигает значения 6,8, что соответствовует оптимальному уровню рН для развития почвенного фито- и бактериоценоза.
По нашим данным, внесение в почву нефти в различных концентрациях оказывает дифференцированное воздействие на почвенную биоту. Так, при добавлении нефти в концентрации 5,0 вес. % наблюдается десятикратное снижение численности гетеротрофных бактерий (1,4x107 до 1,1 хЮ6 клеток/г), тогда как численность почвенных углеводородокислителей остается на прежнем (3,0x105 клеток/г) уровне (см. табл. 14).
В результате проведенной агротехнической обработки (рыхление, внесение минеральных удобрений, увлажнение) в искусственных нефтезагрязнеппых почвенных системах наблюдается увеличение численности почвенных микроорганизмов. При этом микробиологические показатели почвы с уровнем загрязнения 1,0 вес. % характеризуется более высокими значениями по сравнению с таковой, содержащей 5,0 вес. % нефтепродуктов. Так, в почвенной системе с содержанием нефти 1,0 вес. % уже к концу первой недели численность углеводородокисляющих бактерий достигает 1,5x106 клеток/г. В то же время аналогичная численность (1,8x106 клеток/г) исследуемой группы микроорганизмов в почве с содержанием 5,0 вес. % нефтепродуктов отмечается только через три недели эксперимента (см. табл. 14).
По нашим данным, внесение Rhodococcus-биосурфактантов стимулирует развитие почвенной углеводородокисляющей и, в меньшей степени, гетеротрофной микрофлоры. При этом каждое последующее внесение биосурфактаитов вызывает повышение числа углеводородокисляющих бактерий и стабилизацию их численности па уровне 10-10 клеток/г. Следует отметить отсутствие достоверной разницы между средними показателями численности исследуемых микроорганизмов в обработанных биосурфактантами почвенных системах с разным уровнем исходного загрязнения. Таксономическая структура исследуемого углеводородокисляющего бактериоценоза представлена аэробными грамположительными актинобактериями, принадлежащими к родам Micrococcus (М. luteus) и Rhodococcus (R. erythropolis, R. opacus, R. ruber), а также грамотрицательными протеобактериями родов Acinetobacter, Agrobacterium, Pseudomonas. Результаты химического анализа почвенных образцов (табл. 16) свидетельствуют о постепенном уменьшении содержания нефти во всех исследуемых почвенных системах в ходе эксперимента. Так, в контрольной почве наблюдается 30%-ное снижение концентрации нефти в первые две недели эксперимента, по-видимому, за счет улетучивания легких углеводородных фракций. В дальнейшем убыль поллютанта в данной почве была не такой значительной и составляла 12%. В почвенных системах, обработанных Л/юяЬсосст-биосурфактантами, степень разложения нефтепродуктов к концу эксперимента достигает 45-58% в зависимости от первоначального уровня загрязнения, тогда как в контрольных системах эта величина составляет 28-42%) {см. табл. 16). Следовательно, высокая численность углеводородокисляющих бактерий, зарегистрированная в искусственных почвенных системах с применением /Мо ососсмя-биосурфактантов, обусловливает повышенную интенсивность протекания в них процесса биологической деструкции нефтепродуктов.
