Введение к работе
з
Актуальность работы
Добыча и транспортировка нефти сопровождаются массированным загрязнением окружающей среды, о масштабах которого можно судить по потерям, составляющим по оценкам разных авторов от 1 до 7 % в год (Давыдова и Тагасов, 2004). С учетом того, что в мире ежегодно добывается свыше 2,5 млрд т сырой нефти, ее потери составляют минимум 25 млн т. Интенсификация деятельности нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей отраслей экономики приводит к тому, что существующие технологии ликвидации нефтяных загрязнений уже не обеспечивают требуемых объемов, темпов и степени очистки природных, промышленных и хозяйственных объектов, оказываются малоэффективными и высоко затратными и не соответствуют современным экологическим требованиям.
Для России особенно актуальна проблема ликвидации разливов нефти, поскольку на ее территории в настоящее время эксплуатируются сотни тысяч километров магистральных и промысловых трубопроводов, из-за коррозии и механических повреждений которых происходят многочисленные аварии, сопровождающиеся попаданием нефтяных углеводородов в природные объекты. В силу несовершенства существующего экологического законодательства и низкой культуры производства устранение последствий подобных аварий осуществляется в лучшем случае по отраслевым регламентам, а зачастую ограничивается лишь наложением весьма умеренных штрафов.
Выход из создавшегося положения заключается не только в модернизации и повышении надежности оборудования и реорганизации производства в нефтяной отрасли, но и в переориентировании рекультивационного процесса с количественных показателей на качественные и создании условий для внедрения в практику более прогрессивных с экологической точки зрения и научно-обоснованных, так называемых «щадящих» рекультивационных технологий.
Такой технологией в настоящее время является фиторемедиация - биологический способ восстановления загрязненных почв с использованием растений и их ризосферной микрофлоры (Glick et al., 1999). С помощью этой технологии, можно удалить как неорганические (тяжелые металлы и радионуклиды) так и органические (нефтяные углеводороды, хлорированные растворители, взрывчатые вещества, пестициды и др.) поллютанты (Meagher, 2000; Arthur et al., 2005). Ее значимость особенно повышается на поздних этапах рекультивационных мероприятий, когда скорость деградации нефтяных углеводородов замедляется, увеличивается доля «тяжелых» нефтяных остатков, представленных частично
окисленными гетероциклическими соединениями и высококонденсированными ароматическими структурами.
Выживанию растения в загрязненном грунте способствует ризосферное микробное сообщество благодаря его стимулирующей рост растений активности, а также за счет снижения фитотоксичности поллютанта вследствие его биодеградации. В этой связи интерес представляют микроорганизмы, относящиеся к группе PGPR (plant growth-promouting rhizobacteria - стимулирующие рост растений ризобактерии), обладающие к тому же высоким деструктивным потенциалом в отношении поллютанта.
Стимуляция роста растений микроорганизмами группы PGPR достигается путем продукции фитогормонов, обеспечения их биодоступным фосфором, фиксированным азотом, депонированием железа в сидерофорах и снижением уровня «стрессового» этилена в растении (Lucy et al., 2004). Все это приводит к улучшению развития растения, что в свою очередь определяет более эффективную и продолжительную жизнедеятельность ассоциированного микробного сообщества, а в совокупности является решающим фактором успешной фиторе-медиации.
Накопленный научно-практический опыт в области исследования и применения фиторемедиации загрязненных нефтяными углеводородами объектов показал, что кроме ряда неоспоримых преимуществ эффективность этого метода пока еще остается недостаточной. Одним из серьезных ограничений этой технологии является чувствительность растений к высоким концентрациям загрязнителя в грунте и неблагоприятным физико-химическим факторам, возникающим в условиях нефтяного загрязнения. Для повышения эффективности фиторемедиации целесообразно использовать комплекс приемов, направленных на повышение устойчивости растений к поллютанту, улучшение их приживаемости и роста на загрязненных участках. Среди таких мероприятий - применение минеральных удобрений и других агротехнических приемов. Кроме того, эффективным является использование PGPR-штаммов, обладающих деструктивной активностью для инокуляции растений-фиторемедиантов. Сочетание фитостимулирующей активности штамма со способностью к деградации поллютанта должно обеспечивать конкурентное выживание PGPR-инокулянта в условиях загрязнения и повышение эффективности фиторемедиации.
Вместе с тем, процессы, которые лежат в основе фиторемедиации, не вполне исследованы. Их изучение позволит сделать технологии ремедиации более предсказуемыми и эффективными. Получение этих знаний имеет боль-
шое фундаментальное значение, поскольку вносит вклад в понимание механизмов самоочищения природы.
Цель работы - выявить и изучить деструктивный потенциал в отношении углеводородов нефти и фито стимулирующую активность представителей отдельных родов ризобактерий и оценить их вклад в процесс фиторемедиации.
Основные задачи исследования:
Охарактеризовать деструктивный потенциал в отношении углеводородов нефти у ассоциативных микроорганизмов рода Azospirillum.
Исследовать деградацию полициклического ароматического углеводорода фенантрена штаммом Sinorhizobium meliloti Р221.
Выделить и изучить природные ризосферные штаммы, обладающие наряду с нефтеокисляющей активностью устойчивостью к тяжелым металлам.
Исследовать у ризосферных штаммов-деструкторов стимулирующую рост растений активность и влияние на нее углеводородов.
Изучить колонизацию ризосфер ными штаммами корней растений -фиторемедиантов.
Оценить возможность использования изученных штаммов в качестве ино-кулянтов растений для повышения эффективности фиторемедиации.
Научная новизна
Впервые представитель ассоциативных бактерий рода Azospirillum штамм A. brasilense SR80 был охарактеризован как деструктор нефтяных углеводородов. Штамм подвергал деградации предельные алифатические углеводороды.
Впервые дана оценка влияния фенантрена на продукцию фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) штаммом Sinorizobium meliloti Р221.
Дана количественная оценка ИУК-синтезирующей активности штамма А. brasilense SR80, установлено отсутствие влияния на нее сырой нефти.
Выделен и изучен ризосферный штамм Rhodococcus sp. N7, устойчивый к тяжелым металлам и способный разрушать дизельное топливо.
Показано существенное влияние карбоновых кислот как компонентов корневых экссудатов на деструктивную активность исследуемых штаммов.
Выявлена стимулирующая рост растений активность ризосферных штаммов микроорганизмов Azospirillum brasilense SR80 и Sinorizobium meliloti Р221 в отношении таких растений как рожь озимая, сорго веничное и люцерна посевная.
Установлено, что инокуляция растений штаммами A. brasilense SR80 и S. meliloti Р221 влияет на степень очистки грунта от углеводородов.
Практическая значимость
Показано, что изученные PGPR-штаммы A. brasilense SR80 - деструктор алканов и S. meliloti Р221 - деструктор полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), являются потенциальными инокулянтами ряда растений для улучшения их роста и повышения эффективности фиторемедиации загрязненных углеводородами объектов. Штамм Rhodococcus sp. N7 может быть использован в качестве интродуцента для очистки почвы, загрязненной нефтепродуктами и тяжелыми металлами.
Рекомендовано использование ассоциации Lolium perrene (райграс пастбищный) Azospirillum brasilense SR80 для фиторемедиации почвы, загрязненной нефтешламом, и ассоциации Sorghum bicolor (сорго веничное) Sinorhizo-bium meliloti Р221 - для фиторемедиации грунта, загрязненного ПАУ.
Полученные результаты включены в заявку на патент № 2009118275 «Способ фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами (варианты)» (Муратова А.Ю., Бондаренкова А.Д., Голубев С.Н., Панченко Л.В., Турковская О.В.). Дата приоритета 15.05.2009.
Основные положения, выносимые на защиту
Среди представителей ризосферных микроорганизмов выявлены штаммы, обладающие деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти: Azospirillum brasilense SR80 разрушает предельные алифатические углеводороды нефти; Sinorhizobium meliloti Р221 способен подвергать деградации ПАУ (фенантрен); Rhodococcus sp. N7 разрушает дизельное топливо и обладает высокой устойчивостью к тяжелым металлам.
Деструктивная активность штаммов проявляется или существенно увеличивается в присутствии мажорных компонентов корневых экссудатов растений - карбоновых кислот, которые используются бактериями в качестве косубстратов в процессах соокисления углеводородов. При этом микробная деградация углеводородного субстрата зависит от вида и концентрации карбоновой кислоты в среде.
Штамм A. brasilense SR80 способен продуцировать ИУК в концентрации 24 мкг/мл среды. Присутствие сырой нефти не влияет на количество продуцируемого фитогормона. Штамм S. meliloti Р221 продуцирует ИУК в количестве 39 мкг/мл, влияние фенантрена на этот процесс зависит от его концентрации в среде. У штамма Rhodococcus sp. N7 ИУК-продуцирующая активность отсутствует.
Инокуляция штаммами A. brasilense SR80 и S. meliloti Р221 стимулирует развитие ржи, райграса и люцерны в условиях углеводородного загрязнения.
Штаммы A. brasilense SR80 и S. meliloti Р221 колонизируют корни ряда растений и селективно поддерживаются в их ризосфере в условиях загрязнения.
Для повышения эффективности фиторемедиации целесообразно использовать ассоциацию Lolium perrene (райграс пастбищный) Azospirillum brasilense SR80 в случае загрязнения нефтешламом, и ассоциацию Sorghum Ы-color (сорго веничное) Sinorhizobium meliloti Р221 в случае загрязнения ПАУ.
Связь работы с научными программами
Работа выполнена в лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН в рамках планов госбюджетных тем НИР: «Исследование взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (2002-2006) № гос.регистрации 01.9.90003293, «Роль растительно-микробных сообществ и грибов в процессах деградации углеводородов и их производных в окружающей среде» (2007-2009) № гос.регистрации 01200712168, «Роль растительно-микробных сообществ и грибов в процессах трансформации и деградации поллютантов в окружающей среде» (2009-2012) № ГР 01200904387; а также при поддержке гранта в рамках программы Леонарда Ойлера немецкой службы академических обменов (DAAD Leonhard-Euler-Stipendienprogramm 2003/2004) для студентов и аспирантов российских вузов; гранта Президента РФ НШ-6177.2006.4 (2006-2007); Госконтракта № 02.512.11.2210 Федерального агентства по науке и инновациям. Личное участие автора
Личный вклад автора работы составляет не менее 85 %. Все исследования проведены при участии автора. Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на следующих научных мероприятиях: 2 Московский международный Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), 2 Региональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004), Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 117-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Саратов, 2004), Международная Пущинская школа конференция молодых ученых (Пущино, 2005), Первый Балтийский симпозиум и школа для аспирантов по аг-
робиотехнологии, сфокусированной на микробно-корневой системе (Каунас, Литва, 2005), Всероссийская конференция «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, 2005), 13th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Madrid, 2005), Международная конференция по проблеме биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды (Саратов,2005), Международная конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), International Symposium on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB (Leipzig, 2006), Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 162 с. печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 201 источник, (из них 154 - на иностранных языках), содержит 24 таблицы и 27 рисунков.
