Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
ГЛАВА I. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РИЗОСФЕРЫ 7
ГЛАВА II. КОРНЕВЫЕ ВЫДЕЛЕНИЯ 15
ГЛАВА III. КАЧЕСТВЕННЫЕ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МИКРОБНОГО НАСЕЛЕНИЯ В РИЗОСФЕРЕ 25
ГЛАВА ІV. МОДЕЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ С РАСТЕНИЕМ 37
ЧАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 41
ГЛАВА V. МАТЕРИАЛЫ й МЕТОДЫ 41
1. Методика подготовки образцов почвы и корней к микробиологическому анализу 41
2. Методика исследования комплекса почвенных микроорганизмов 45
3. Методы изучения динамики численности популяций, внесенных в дерново-подзолистую
почву 49
4. Методика определения доступной для микроорганизмов поверхности почвы 52
ГЛАВА VІ. ДИНАМИКА КОМПЛЕКСА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В СИСТЕМЕ ГОРОХ(ЯЧМЕНЬ)-ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТАЯ ПОЧВА 53
ГЛАВА VІІ. ДИНАМИКА Rhizobium leguminosarum и Arthrobacter crystallopoiete8 В СИСТЕМЕ ЯЧМЕНЬ-ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТАЯ ПОЧВА 75
ГЛАВА VIII. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОСТУПНОЙ ДЛЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОВЕРХНОСТИ ПОЧВЫ 85
ГЛАВА IX. ХАРАКТЕРИСТИКА РИЗОІШАШ И РИЗОСФЕРЫ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА КАК ГЕТЕРОГЕННЫХ СРЕД ОБИТАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ 94
1. Динамика популяции Hh, leguminosarum на корнях проростков гороха ......... 95
2. Динамика численности комплекса почвенных бактерий на корнях проростков гороха 106
ОБСУЖДЕНИЕ 110
вывода 116
ЛИТЕРАТУРА 118
- МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РИЗОСФЕРЫ
- КОРНЕВЫЕ ВЫДЕЛЕНИЯ
- КАЧЕСТВЕННЫЕ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МИКРОБНОГО НАСЕЛЕНИЯ В РИЗОСФЕРЕ
- МОДЕЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ С РАСТЕНИЕМ
- Методика подготовки образцов почвы и корней к микробиологическому анализу
Методы исследования ризосферы
Согласно определению Ровиры и Дэви [1663 "ризосфера представляет собой недостаточно определенную (плохо очерченную) зону почвы с микробиологическим градиентом, в котором максимальные изменения в микрофлоре происходят в почве, прилегающей к корню, и уменьшаются по мере удаления от корней". В приведенном определении следует подчеркнуть два основных момента: во-первых, отсутствие резких границ у ризосферной зоны; во-вторых, отсутствие указаний на обязательность только положительного влияния поверхности корня растения на количество микроорганизмов в почве. Изменениями мы можем называть и увеличение и уменьшение численности популяций, и вариации в структуре комплексов микроорганизмов без изменения их общей численности. Тем не менее со времен Гильтнера СЮЗИ почвенными микробиологами подразумевается, как правило, существование для любой исследуемой системы почва-растение положительного ризосферного эффекта, то есть возрастания численности микроорганизмов у поверхности корня. В соответствие с этой посылкой сложились методы исследования ризосферы, в частности, методы подготовки образцов к микробиологическому анализу. Они были предназначены в основном для определения ризосферного эффекта по изменению общего количества микроорганизмов, а не отдельных популяций. Изучение отдельных популяций требует, как это показано ниже, некоторых изменений в используемых ныне методах.
Считается, что наиболее удовлетворительными являются приёмы, в которых происходит подразделение образца ризосферы (почва + корень) на несколько подобразцов, чаще всего на два: почва + (почва2 + корень). "Почва- " представляет собой ризосферную почву, отмываемую с корней легким встряхиванием в воде. "Почва2 + корень" представляет образец ризопланы, определенной Кларком в 1949 г., как внешняя поверхность корней растений вместе с любыми тесно прикрепленными частицами почвы или органических остатков (дебриса)" С773.
Между тем, описанный метод анализа не гарантирует получение адекватной информации в силу, по крайней мере, двух причин. Во-первых, ризоплана не является непрерывной зоной, то есть на поверхности корня есть участки свободные от почвы, поэтому часть микроорганизмов ризопланы смывается в образец ризосферы. Во-вторых, полностью отмыть почву от корня не удается к, таким образом, часть образца ризосферы примешивается к образцу ризопланы CI663.
При анализе общей численности микроорганизмов считается, что доля смываемых клеток невелика С 523 и составляет 3-4$ бактерий, находящихся на корне С1673. Зта оценка была получена в результате экспериментов с растениями Lolium CI673. Для удаления избытка почвы корни опускали в стерильную воду (операция I), а затем переносили в колбу с 50 мл стерильной воды и взбалтывали до тех пор, пока они не очистятся от почвы (операция22). Отмытые корни переносили в колбы со 100 мл воды и 5 г стеклянных бус и отмывали 15 мин на качалке для отделения ризоплановой микрофлоры от корня (опера ция 3). Фиксировали только вес свежих корней. Анализ количества бактерий в почвенной суспензии, полученной в результате операции 13 не проводили. В результате операции 2 отмывалось a,tfWoK бактерий на I г веса свежих корней, а после операции 3 отмывалось N2= 90-Ю6 клеток бактерий на I г веса корней. Следовательно, при такой обработке смывается не более 3-4$ бактерий, находящихся на корне
Корневые выделения
Основным стимулом корневых выделений (ёкзоосмоса) является разность концентраций растворенных веществ в тканях корней и снаружи 333. Выделяются следующие вещества: аминокислоты, сахара, органические кислоты, белки, полисахариды, ростовые вещества, ат-трактанты и репелленты С993. Помимо них во внешнюю среду корень выделяет катионы: Са2 , К4" С1453, ын + C64D, а также значительные количества ecu Е 38» 129 3. Эксудация соединений, обладающих биологической активностью (стимуляторов или ингибиторов), часто столь низка по концентрации, что их трудно учесть хиглическими методами. В таких случаях могут быть использованы биологические методы, например индикация перехода цист нематод в активное состояние или передвижение грибных зооспор EI63H. Спектр выделяемых веществ различен у разных растений С 99, 163 3, однако в каждом спектре можно выделить 2 группы веществ: I) водорастворимые вещества; 2) во-донерастворимые вещества, как правило с большим молекулярным весом.
Количество корневых выделений в большой степени определяется методом, которым оно измеряется и возрастом растения. Анализ литературных данных, посвященных изучению водорастворимого эксудата ячменя ( Hordeim vulgare гороха ( Pisum sativum L.) f показывает, что в водной (непроточной) культуре образуется минимальное количество корневых выделений в стерильных условиях (табл. 1-2). Затем следуют: песчаная культура, песчаная культура с иссушением (метод Хатцнельсона с соавт. CIII3), почва нестерильная, почва стерильная. Считая, что вес сухой корневой системы 14-дневных растений ячменя в песчаной культуре составляет около 50 мг CI273, можно вычислить, что водорастворимые корневые выделения растений этого возраста составляют примерно 0,9$ веса корня. Это значение в 15 раз ниже количества корневых выделений 3-недельных растений ячменя, выращенных в стерильной почве.
Поток корневых выделений ослабевает по мере развития растений гороха в стерильных условиях в песчаной или водной культуре без смены питательного раствора. Проростки выделяют по крайней мере в 20 раз больше вещества, чем 2- и 3-недельные растения (табл. 3). Так как интенсивность корневых выделений сильно зависит от их концентрации во внешней среде EI223, то непрерывное удаление субстрата увеличивает его поток из корня. Следовательно, для выяснения разницы между максимально возможной скоростью корневых выделений у проростков и у растений необходимо анализировать результаты ее измерения в системах с постоянным оттоком вещества. Нам не удалось найти в литературе аналогичных работ, выполненных с растениями гороха и ячменя. Однако результаты такого исследования эксудата корней маиса показывают, что поток корневых выделений, отнесенный к единице веса растения, действительно значительно ослабевает по мере развития корневой системы: с 10-ых по 23-и сутки падает в 19 раз, с 23-их по 39-ые сутки - в 2,9 раза С1303.
Качественные и количественные изменения микробного населения в ризосфере
"Ризосферний эффект заключается в изменении баланса между раз-личными группировками микроорганизмов, как бы мы - их не классифицировали (по морфологии, общей физиологической активности, пищевым потребностям и т.д.)" СІ873- Как правило, для любого растения, ризосферний эффект, измеряемый по общей численности микроорганизмов, является положительным. Для отдельной группы (популяции) он может быть и больше и меньше, чем для совокупности организмов. Корни селективно стимулируют рост грамотрицателышх бактерий, которые характеризуются высокими скоростями роста, потребностью в аминокислотах, образованием кислоты из глюкозы и устойчивостью к некоторым антибиотикам ГІ663. В ризоплане клевера и ячменя более 50% бактерий обладают редуктазной активностью, определяемой по способности восстанавливать метиленовий синий СІ593. Анализ ризосферних микрорганизмов по спектру пищевых потребностей ГП8Ппока-зывает, что по сравнению с почвой наблюдается падение доли бактерий, требующих для своего роста неидентифицированных веществ почвенного и дрожжевого экстрата С 119, 158 , 187 3. Вследствие этого, вероятно, в отличие от почвы, где только 10% почвенных бактерий : вырастают на питательной среде, из ризосферы и ризопла-ны Avena sativa удается выделить до .80-бактерий,; учитываемых прямым методом Джонса и Моллисона С 107, 1203 .
Увеличение доли грамотрицателышх палочек в популяции ризосферних микроорганизмов является нестолько распространенным фактом , что используется как критерий "успешности" моделирования ризосферних условий в почве СІ6П .
Конкретный состав микрофлоры корня и ризосферы определяется в значительной степени наличием соответствующих видов бактерии в почве, так как заселение корня происходит в основном из почвы С 4, 68 1. По этой причине, вероятно, искусственное внесение некоторых видов бактерий рода Azotobacter в почву повышало численность популяций в ризосфере в большей степени, .чем инокуляция бактериями семян L 72, 73 3. Предполагается, что заселение корня происходит при соприкосновении его поверхности с участками почвы, содержащими органические остатки С683. Последние занимают в песчаной дюновой почве, например, менее 15$ всей поверхности, но несут 57-64$ почвенных бактерий C68D. Возможно, что именно из-за небольшого количества точек инокуляции площадь бактериального покрытия корня низка и составляет менее 10$ CI653. Следует отметить, что в соответствии с разработанной в 1977 г. Ньюменом и Уотсоном математической моделью С1403, численность микроорганизмов в ризоплане не должна зависеть от числа точек инокуляции. Однако, по нашему мнению, это утверждение справедливо только для тех микроорганизмов, которые активно или пассивно способны осваивать новые участки корневой поверхности.
Модель взаимодействия микроорганизмов с растением
Т.Д.Боуэн в 1980 г. С663 предложил простую модель взаимодействия микроорганизмов с растением (рис. І). В соответствии с этой моделью растение является ведущей силой для системы и, таким образом, факторы, влияющие на его рост, будут также влиять на микробный рост. Распределение корней и движение микроорганизмов к ним являются существенными вопросами в понимании состава почвенной микрофлоры. Микробный рост на поверхности корня сам по себе влияет на потери вещества из корня. Этот рост, следовательно, может влиять на доступность субстрата для микроорганизмов, не расположенных на поверхности корня. Последнее положение было детально разработано в модели Ньюмена - Уотсона СІ403. Одним из основных следствий этой модели является представление о ризосфере как очень непротяженной зоне интенсивной микробной жизни, ограниченной практически только поверхностью корня.
Чистая ассимиляция фотосинтетического продукта расходуется в трех основных направлениях: на рост стебля, рост корня и корневые выделения (рис. I). Между ростом стебля и корня существует система обратной связи, регулирующая постоянство отношения Вбса сухого стебля к весу сухого корня.С 70, 168, 188 3. Каким образом участвуют в этой системе корневые выделения? Существует ли постоянство отношения между весом растения и количеством корневых выделений? Ответить на эти вопросы в настоящее время трудно, так как работ, посвященных изучению динамики корневых выделений с одновременным измерением параметров роста растения, практически нет. Существуют, однако, многочисленные факты, указывающие на наличие тесной взаимосвязи между скоростью роста
Методика подготовки образцов почвы и корней к микробиологическому анализу
ДЛЯ количественного учета A. crystallopoietes, Rh. leguminosacrum и почвенных бактерий в опытах с внесением популяций отмывания корней ячменя от почвы не производили (рис. 2). По мере развития ячменя в нужные сроки отбирали 7-8 растений в стерильную чашку Петри. Пространство вблизи корня делилось на три зоны. Наиболее удаленная от корней зона (эдафосфера) была представлена почвой, которую собирали после легкого встряхивания корней. Почва, которая прочно удерживалась на корнях, удаляясь стерильным скальпелем так, чтобы оставшийся слой не превышал 0,3 см толщины; этот оставшийся слой затем счищали и рассматривали в качестве ризосферы, а оставшиеся на корнях микроорганизмы - в качестве микробов ризопланы.
В опытах с ячменем без внесения популяций, а также во всех вариантах опытов с горохом проводили отмывание корней от почвы (рис.З). Для этого корни с прилипшей к ним почвой помещали в 100 мл стерильной водопроводной воды и встряхивали на качалке при 180 об/мин в течение 3-х минут. Отмытая почва представляла образец ризосферы. После первой обработки не удается целиком отмыть почву с поверхности корня, поэтому в ряде экспериментов с проростками гороха мы проводили анализ количества примеси почвы в образце ризопланы (отмытых в течение 3-х мин корней). Для этого корень обрабатывали на низкочастотном дезинтеграторе УЗДН-І (22 кГц, 0,4А) в течение 10 сек, что соответствовало минимальному времени, необходимому для десорбции почвы с корня. При этом не происходит мацерации тканей корня и примешивания растительного материала к десорбированной почве. Количество отмытой и десорбированной с корней почвы определяли гравиметрическим методом после фильтрования суспензии через бумажный фильтр с синей лентой. Измеряли вес воздушно-сухих фильров с почвой и без нее. Во всех вариантах опытов измеряли также вес свежих корней;
При изучении ризопланы и ризосферы проростков гороха проводили дифференциальный учет численности микроорганизмов на различных участках корня и прилежащей почвы. Для этого в стерильную чашку Петри отбирали 5-Ю проростков на 2, 3, 4, 5, 6-ые сутки после посева семян. Первый листок на растениях появлялся на 4-ые сутки, боковые корни - на 6-ые.
