Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Характеристика нефти и продуктов ее переработки. 11
1.1.1. Нефти Чеченской Республики. 17
1.2. Источники загрязнения природной среды. 19
1.3. Влияние нефти и нефтепродуктов на природные системы. 26
1.3.1. Влияние нефти и нефтепродуктов на почву. 26
1.3.2. Влияние нефти и нефтепродуктов на растения. 30
Глава 2. Характеристика условий, материал и методика исследований.
2.1. Природно-климатическая характеристика ЧР. 37
2.2. Экологическая характеристика районов исследования ЧР. 42
2.3. Методики определения загрязнения почв. 48
2.4. Характеристика тест-систем. 51
2.4.1. Исследование морфологических признаков растений природной флоры.
2.4.2. Методика исследования мутабильности растений природной флоры.
2.4.3. Растительная тест-система соя Glycine max. (L.)Merill. 61
2.4.4. Тестирование исследуемых образцов почв на мутагенность с использованием теста Эймса.
Глава 3. Результаты исследований.
3.1. Уровень загрязнения почвы в изучаемых населенных пунктах Чеченской Республики.
3 2Влияние нефтезагрязнений на морфологические признаки растений природной флоры. растений природной флоры.
3.3. Изучение мутационного влияния загрязнения почв с использованием растительной тест-системы Glycine max. (L.) 80 Merill
3-4. Исследование образцов почв на мутагенность в тесте Эймса 90
3.5. Исследование уровня мутаций растений из районов
92 загрязнения.
Обсуждение результатов и выводы 91
Использованная литература 103
- Характеристика нефти и продуктов ее переработки.
- Характеристика тест-систем.
- Изучение мутационного влияния загрязнения почв с использованием растительной тест-системы Glycine max. (L.) 80 Merill
Введение к работе
Развитие промышленности и сельского хозяйства, добыча и транспортировка полезных ископаемых, а так же последствия военной деятельности государств, не смотря на систему мер по охране окружающей среды, приводят к все возрастающему поступлению в экосистемы различных токсикантов. Среди множества загрязнителей окружающей среды необходимо выделить нефть и нефтепродукты, поступление которых в окружающую среду постоянно возрастает и оказывает негативное влияние на воду, почвенный покров, растительный и животный мир.
Нефть и нефтепродукты рассеиваются в окружающей среде повсеместно, так как в современном мире практически нет такой области хозяйственной деятельности человека, где бы они ни использовались. В области, свободной от хозяйственной деятельности человека (заповедники, труднодоступные территории), углеводороды транспортируются с воздушными и водными потоками. Глобальное или региональное рассеяние углеводородов происходит, как правило, из суммы источников, находящихся иногда на значительных расстояниях и мало связанных между собой (Техногенные потоки...., 1981).
Среди комплекса экологических проблем особое место занимает прогноз возможных генетических последствий загрязнения окружающей среды. Важное значение этой проблемы предопределено тем, что многие вещества, введенные в окружающую среду, обладают мутагенным, канцерогенным и тератогенным действием. Генотоксические вещества, поступающие в окружающую среду, представляют для человека реальную онкогенную опасность, которая многократно возрастает в силу того обстоятельства, что действию мутагенных химических соединений подвергаются не отдельные индивидуумы, а целые популяции (Белицкий и др., 1989). Н.А. Киреева и ее коллеги (2004) из Башкирского государственного университета считают, что не всегда удается установить прямую зависимость между содержанием загрязнителя в среде и ее пригодностью для обитания живых организмов. В качестве метода определения генотоксичности загрязнителей исследователями предложено биотестирование, т.е. набор специальных тест-систем, по изменению маркерных признаков которых можно судить о степени загрязнения окружающей среды. Вместе с тем авторы указывают, что подобрать единый универсальный набор биотестов для всех случаев оценки степени загрязнения почвы и ее токсичности практически невозможно, т.к. в зависимости от химической природы загрязнителя реакция организмов может быть разная (Киреева и др., 2004).
Многие биологически активные вещества, в том числе содержащиеся в нефти и нефтепродуктах, нестабильны и после взаимодействия с биологической мишенью в короткие сроки распадаются, что затрудняет их химический анализ. Таким образом, желательно знать не только какие загрязнители и по каким механизмам аккумулируются в компонентах окружающей среды, но изучать и прогнозировать отклик экосистем на антропогенные воздействия.
Данные по биотестированию почв имеют практическое значение, так как они дают возможность прогнозировать характер влияния загрязненных почв в хозяйственной деятельности человека, например, в растениеводстве и других отраслях сельского хозяйства.
Из всех отраслей промышленности на протяжении многих лет отрицательное воздействие на природную среду Чеченской Республики оказывает нефтедобывающая и нефтеперерабатывающая промышленность. Несмотря на то, что крупные промышленные предприятия разрушены и не функционируют, за последние 10 лет количество выбрасываемых вредных веществ не уменьшилось, а скорей всего увеличилось за счет десятков горевших нефтяных скважин и продолжающих функционировать множества кустарных установок по первичной переработке нефти. При горении нефти усиливается опасность загрязнения окружающей среды веществами, которые по своей токсичности могут во много раз превосходить продукты самих химических производств. Так, образующийся при низкотемпературном горении нефтепродуктов бенз(а)пирен, является сильнейшим канцерогеном и мутагеном.
Следует особо подчеркнуть, что в настоящее время исследования по влиянию загрязнений окружающей среды продуктами переработки нефти на территории Чеченской Республики крайне ограничены, а эффективная защита окружающей среды от опасных химических загрязнителей невозможна без достоверной информации о степени влияния загрязнения почв на живые системы.
Актуальность работы определяется тем, что впервые в Чеченской республике проведены исследования по влиянию загрязнения почвы на растительный покров в районах, насыщенных продуктами добычи, переработки и горения нефти. Цель и задачи. Основной целью наших исследований являлось:
- установление характера и уровня загрязнения почв нефтепродуктами и продуктами горения нефти, поступающими в окружающую среду;
- определение экологического и цитогенетического эффекта данного типа загрязнения на некоторые виды природной флоры;
- исследование степени его генетической опасности на тест-системах с использованием различных образцов почвы, отобранных на территории Чеченской Республики.
Выполнение поставленной цели определило следующие задачи:
1. Выделить районы с одинаковым почвенным покровом, сходными микроклиматическими условиями, характеризующиеся различной степенью загрязнения почв нефтепродуктами. 2. Провести химический анализ образцов почв из выбранных районов.
3. Подобрать виды растений природной флоры, которые встречаются не только в исследуемых районах, но и распространены повсеместно, и выявить их индивидуальную чувствительность к загрязнению по показателям их роста и развития.
2. Провести цитогенетический анализ на корешках проростков выбранных видов растений и дать оценку генотоксичности загрязнителей.
3. Для оценки характера возникающих соматических мутаций использовать широко применяемую в генетических исследованиях растительную тест-систему сою Glycine max (L.) Merill. линии T 219.
4. Изучить экстракты почв из районов с разным уровнем загрязнения на их мутагенную активность с использованием теста Эймса на штаммах Salmonella typhimurium ТА 98 и ТА 100.
5. Провести анализ полученных данных определяющих степень влияния загрязнений почвенной среды нефтепродуктами как важнейшего негативного экологического фактора
6. На основании полученных данных установить возможность использования дикорастущих растений и лабораторных тест-систем для экологического и генетического мониторинга загрязнения почв нефтепродуктами.
Научная новизна работы.
Впервые проведено изучение влияния почвенного загрязнения нефтепродуктами на рост, развитие и семенную продуктивность четырех видов высших растений: ромашки непахучей (Matricaria recutita L.), щавеля конского (Rumex confertus Willd.), одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.s.l.), подорожника большого (Plantago major L.), широко распространенных в природной флоре предгорной лесостепной зоны ЧР, и установлена различная степень их реакции на исследуемый экологический фактор. Впервые установлено генотоксическое влияние загрязненной почвы продуктами переработки нефти, и выявлено значительное повышение уровня хромосомных аберраций в корешках проростков исследуемых видов растений. Мутагенная активность данного вида загрязнений подтверждена с использованием растительной тест-системы сои Glycine max. (L.) Merill. линии T 219. При этом отмечено преобладание генных мутаций над хромосомными. Оценка мутагенных свойств нефтезагрязнений в исследуемых районах также проведена с использованием теста Эймса Salmonella/микросома.
Новизна работы.
Впервые установлена возможность использования сои Glycine max. (L.) Merill. линии T 219 в качестве растительной тест-системы на нефтяное загрязнение почвы.
Установлена возможность использования природных популяций растений на примере Matricaria recutita L., Rumex confertus Willd., Taraxacum officinale Wigg. s.l. и Plantago major L. для экологического и генетического мониторинга загрязнения почв нефтепродуктами. Практическая значимость полученных результатов.
Результаты эксперимента вошли в материалы комплексных исследований лаборатории экологии АН ЧР.
Полученные данные используются в учебном процессе в рамках дисциплины «Техногенные системы и экологический риск».
Апробация работы.
Результаты исследований были доложены на Региональной межвузовской научно-практической конференции «Вузовская наука -народному хозяйству» (Грозный, апрель, 2002); на Региональной научно-практической конференции, посвященной к 15-летию кафедры геоэкологии ЧТУ «Актуальные проблемы экологии и природопользования в условиях посткризисного восстановления экономики и социальной сферы ЧР», (Грозный, 12 ноября 2003г); на заседании кафедры общей генетики, селекции и семеноводства биологического факультета Кабардино-Балкарского госуниверситета (Нальчик, 19. мая 2004); на
Объединенном научном семинаре лабораторий «Флоры и фауны ЧР» АН ЧР и «Экологии» Комплексного НИИ РАН «Проблемы экологического, рационального использования и охраны природы ЧР» (Грозный, 9. июня 2004).
Публикации.
Содержание работы опубликовано в 5 статьях и 2 тезисах докладов.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, выводов, заключения, списка литературы.
Характеристика нефти и продуктов ее переработки
Нефть - результат лизогенеза - представляет собой горючую со специфическим запахом жидкую в основном гидрофобную фазу продуктов фоссилизации (захоронения) органического вещества (керогена) в водно-осадочных отложениях; является важнейшим полезным ископаемым.
Нефтеобразование - стадийный и весьма длительный (много млн. лет) процесс. Основным исходным веществом нефти является планктон (Леворсен, 1970). Нефть образуется вместе с газообразными углеводородами обычно на глубинах более 1,2 - 2,0 км, вблизи земной поверхности преобразуется в густую мальту и полутвердый асфальт.
Нефть в природе довольно разнообразна. Соотношение компонентов, входящих в состав нефти, определяет ее тип, физические свойства, состав. Тип нефти зависит от многих условий, связанных с формированием и существованием ее скоплений.
Нефть представляет собой сложную смесь различных углеводородов (алканов, циклоалканов, аренов), их гибридов и соединений, содержащих помимо С и Н, О, S, N и другие элементы.
Велико количество растворенных газов в нефти, находящейся в залежи. В основном газы представлены углеводородами (СН4, С2И5, СзНв, С5Н12), сероводородом и углекислым газом. Многокомпонентный и сложный состав нефти отражается в чрезвычайно больших диапазонах колебаний ее средней относительной молекулярной массы. Нефть сильно варьирует по цвету (от светло-коричневого, почти бесцветного, до темно-бурого, почти черного) и по плотности - от легкой (0,65 -0,70 г/см ) до тяжелой (0,98-1,05 г/см3). Нефть, находящаяся в залежах, в различной степени насыщена углеводородами. По химическому составу нефти также отличаются. Менее всего колеблется их элементный состав: 82,5-87,0% - С; 11,5-14,5% - Н; 0,05-0,35(редко 0,7)% - О; 0,001-5,3 - S; 0,001-1,8 - N. (Карцев, 1969). Именно соотношение С : Н является отличительным признаком нефти от других видов горючих ископаемых. Характерной особенностью нефти является ее оптическая активность. Большинство нефтей вращают плоскость поляризации вправо.
По плотности нефти делят на три группы: на долю легких нефтей (плотность до 0,80 г/см3) приходится около 60%; на долю средних нефтей - (0,87-0,91 г/см ) - около 30%; на долю тяжелых нефтей (больше 0,91 г/см3) - около 10%.
Начало кипения нефти обычно выше 28С. Температура застывания колеблется от +30С до - 60С, и зависит в основном от содержания парафина (чем его больше, тем выше температура застывания). Теплоемкость нефти 1,7-2,1 кДж/кг, теплота сгорания 43,7-46,3 МДж/кг, диэлектрическая проницаемость 2,0-2,5, электропроводность 2,0 10-0,3 10 1/Ом см. Вязкость изменяется в широких пределах (при 50С - 1,2-55,0 ест) и зависит от химического и фракционного состава нефти и смолистости (содержание в ней асфальто-смолистых веществ). Температура вспышки нефти колеблется так же в широких пределах (от 35С до 120С), в зависимости от фракционного состава и давления насыщенных паров (Карцев , 1969).
Хотя вода и нефть представляют собой несмешивающиеся жидкости, в нефти содержится значительное количество связанной воды. Растворимость нефти в воде составляет сотые доли процента. Но уже этого достаточно, чтобы резко ухудшить качество воды. Обычно нефтяные компоненты образуют с водой эмульсию, которую трудно разрушить. Чаще всего нефть плавает на поверхности воды в виде пленки, обволакивает взвешенные частицы и оседает с ними на дно. Из отдельных классов углеводородов лучше в воде растворяются ароматические углеводороды, хуже метановые. Растворимость углеводородов в воде снижается от низкомолекулярных соединений к высокомолекулярным.
Нефть и нефтепродукты хорошо растворяются в малополярных органических растворителях. Практически все нефтяные компоненты полностью растворимы в бензоле, хлороформе, диэтиловом эфире, сероуглероде, четыреххлористом углероде. Все эти вещества токсичны, менее других опасен хлороформ.
Неполярные органические растворители - петролейный эфир, гексан -растворяют всю углеводородную часть нефти, но не растворяют входящие в ее состав асфальтены и низкомолекулярные смолы. Поскольку асфальтенов в неизмененной нефти мало (1-2%), то этими растворителями часто пользуются для диагностики загрязнений: они не растворяют полярные органические соединения, не имеющие отношения к нефти и нефтепродуктам.
Составляющие нефть углеводороды принадлежат к различным рядам и отличаются друг от друга по составу и строению. Природные нефти и продукты их перегонки содержат парафиновые (метановые), циклические (насыщенные) и ароматические углеводороды. В незначительных количествах иногда встречаются ненасыщенные углеводороды. По характеру преобладания той или иной группы углеводородов нефти подразделяются на метановые, нафтеновые и ароматические. Возможны и сложные классы нефтей (табл.1)(Добрянский А.Ф., 1961).
Углеводороды нефти вскипают в очень широком интервале температур. Метановые углеводороды исчезают из фракций, кипящих при температуре более 50С, моноциклические полимеры - около 300-350С, ароматические углеводороды присутствуют во всех высококипящих фракциях, полициклические полимеры находятся во фракции, кипящей при температуре свыше 400С (Эрих, 1969).
Последняя группа углеводородов в составе нефти - ароматические. Их содержание в нефти может доходить до 35%. Ароматические углеводороды имеют более высокую температуру кипения, чем нафтеновые компоненты нефти. Этот класс соединений особенно беден водородом и обладает более высокой термической устойчивостью. Ароматические углеводороды представлены в нефти моно- и полициклическими соединениями. В их цикле содержатся двойные ненасыщенные связи. Бензолу и его гомологам присуще особое качество, которое придает ему чередующийся характер двойных связей в кольце.
Характеристика углеводородной части нефти будет неполной, если не упомянуть о предельных углеводородах линейного строения - этиленовых. Они в природных нефтях содержатся в крайне малых количествах. Их присутствие является скорее следствием превращений, претерпеваемых нефтью, нежели их генетической связью с ее происхождением (Карцев, 1969). Так же невелико содержание в нефти кислородсодержащих соединений. Основное количество кислородсодержащих соединений нефти приходится на органические кислоты, фенолы. Большинство кислот, встречающихся в нефти, являются производными циклопентана. Это циклические одноосновные карбоновые кислоты. Но в нефтях обнаружены и бициклические соединения. Кроме того, в них могут встречаться предельные кислоты, например, миристиновая, пальмитиновая, стеариновая, арахисовая. Фенолы в составе нефтей встречаются крайне редко (фенолы, крезолы), образуя в основном примесь к циклическим кислотам.
Характеристика тест-систем
В последние годы, в связи с быстрыми темпами развития промышленности и техники, особенно остро встал вопрос о влиянии деятельности человека на окружающую его среду. Довольно часто необдуманное и неразумное использование достижений науки наносит весьма ощутимый вред всей экосистеме. В связи с этим первостепенное значение сейчас приобретает необходимость оценить опасность разнообразных загрязнителей и выработать соответствующие эффективные мероприятия в целях охраны наследственности человека и других биологических видов.
Актуальная проблема выявления канцерогенных и мутагенных факторов может быть решена путем создания краткосрочных тестов, основным компонентом которых является тесты на генотоксичность исследуемых соединений. Генотоксические факторы загрязнения окружающей среды представляют для человека реальную онкогенную опасность (Белицкий и др., 1989)
Для оценки мутагенного воздействия загрязнителей окружающей среды в различных лабораториях мира предложено более 100 тест-систем (Абилев и др. 1989). Однако, до сих пор не создано единой идеальной тест-системы, что вынуждает производить оценку мутагенности факторов окружающей среды с помощью набора тест систем. Успешное применение биотестирования для диагностики состояния экосистем во многом зависит от подбора тест-систем.
В качестве биоиндикаторов могут быть использованы организмы практически всех таксономических групп: животные, растения, грибы, микроорганизмы. Применение единственного биотеста ненадежно из-за разнообразных . механизмов отклика тест-организма на различные антропогенные загрязнения (Киреева и др., 2004). Оценить воздействие загрязнения окружающей среды можно с помощью биоиндикаторов, способными накапливать в тканях определённые вещества и реагировать на их воздействие изменением тех или иных признаков и свойств Наилучшими биоиндикаторами в данном случае являются растения, в силу своей прикреплённости к субстрату. Это удобный и доступный материал для выяснения возможных изменений в структуре кариотипов под влиянием антропогенных факторов. Растения быстро реагируют даже на малые дозы загрязнителей, попавших в почву, причём их реакцию можно легко зарегистрировать.
Растения многими исследователями рекомендуется использовать в качестве первого этапа в системе определения генетической опасности различных загрязнителей среды. Растительные тест-системы отвечают основным требованиям к тест-системам - это быстрота, экономичность и высокая чувствительность. А также обладают целым рядом преимуществ - короткий жизненный цикл, возможность исследовать как гаплоидные, так и диплоидные клетки, возможность проводить исследования in situ, относительная дешевизна.
Растительные тест-системы незаменимы при проверке различных антропогенных факторов на генотоксичность, что подтверждается многочисленными исследованиями с их использованием (Лембик и др., 1979; Lower et al, 1983; Kan et al, 1990; Реутова, 1992; Grant, 1998; Kong et al, 1999; Ma, 1999, Аниськина и др., 2001; Зимонина, 2001; Бакаева и др., 2001; Гогуа, 2001; Фединяк и др., 2002; Хандохов, 2004 и др.).
Растительные тест-системы доступны и просты в исполнении, их преимущество заключается еще и в том, что исследования ведутся с объектами, типичными для данной экосистемы, т.е. с их естественной средой обитания.
Несмотря на устойчивость дикорастущей флоры к различным загрязнителям (Киреева и др., 2004), растения, произрастающие на нефтезагрязненных землях, накапливают сильнодействующие мутагены и канцерогены (в частности, бенз(а) пирен) в больших количествах.
В проведенных исследованиях на токсичность и мутагенность загрязнений почвы нефтью, продуктами ее переработки и горения использовались растения природной флоры. Непосредственное токсическое воздействие нефти на растительный покров проявляется в том, что замедляется развитие растений, нарушаются функции фотосинтеза и дыхания, отмечаются различные морфологические нарушения, страдают корневая система, листья, стебли и репродуктивные органы. Наиболее информативным в получении данных является количество семян, их всхожесть, и высота растений. В данной работе использованы: четыре вида растений природной флоры для морфологических исследований и выявления хромосомных аберраций; растительная тест-система соя Glycine max. (L.) Merill. линии T219 для определения геноспецифичности влияния нефтепродуктов; тест Эймса Salmonella/микросома.
Изучение мутационного влияния загрязнения почв с использованием растительной тест-системы Glycine max. (L.) Merill
Поскольку в результате морфологического изучения растений, произрастающих в загрязненных районах, мы обнаружили своеобразное токсическое влияние, проявляющееся в нарушении процессов развития (уменьшение количества цветков, количества семян, снижение всхожести семян), но стимуляции роста (увеличение высоты всех изученных растений), то встал вопрос о возможном генетическом влиянии данного вида загрязнений. Тем более что процесс формирования семян зависит от процесса мейоза. Следовательно, уменьшение их количества может быть связано и с нарушениями гаметогенеза вследствие мутагенного воздействия.
Определение токсического влияния загрязнителей окружающей среды особой трудности не составляет. Определение же мутагенного влияния требует наличия специальных тест-систем.
Первой тест-системой, на которой нами было проверено мутагенное действие загрязненных почв, была соя Glycine max. (L.) Merrill, линии T-219.
Имеется много свидетельств о высокой чувствительности данной тест-системы к воздействию различных мутагенов (Vig, Paddock, 1968; Vig, 1973; Vig, 1975;). Но наряду с этим есть данные и о нечувствительности этой тест-системы в частности к бенз(а)пирену (Fujii, Inoue, 1985) и некоторым тяжелым металлам (Vig, Mandeville, 1972).Тем не менее, исследования с использованием сои в качестве тест-системы для определения мутагенного воздействия ряда тяжелых металлов (W, Mo, Ag, Использование сои в данных исследованиях позволило сделать выводы о мутагенном влиянии комплекса веществ, попадающих в почву при переработке нефти на кустарных установках. Проведенные химические анализы почв с загрязненных территорий показали, что в основном загрязняющими веществами являются нефтепродукты и полициклические ароматические углеводороды (табл.7,8).
Для проведения экспериментов семена сои проращивали в почвах, привезенных из загрязненных зон. Полученные результаты приведены в таблицах 13 и 14 и на рис. 2 и 3.
В проведенных экспериментах не было отмечено нарушений в процессе формирования проростков и дальнейшем росте и развитии растений сои, несмотря на то, что корни проростков ряда растений способны поглощать бенз(а)пирен и другие ПАУ из почвы (Норкина, Слепян, 1979).
В представленной таблице 13 приведены общие данные, полученные при проведении опытов. Всхожесть семян показана для того, чтобы можно было судить о токсическом влиянии загрязнителей. Как видно из представленных данных в табл. 13 и рис. 2 загрязнение почвы нефтепродуктами приводит к снижению всхожести семян. Вместе с тем следует отметить, что во всех загрязненных пунктах всхожесть семян снижается в 1,2 -1,4 раза по сравнению с условно чистой зоной (с. Гойты), где процент прорастания семян составил 96%.
Данная растительная тест-система позволяет выявить возможную специфичность мутагенного влияния загрязнений, поскольку появление разного типа пятен на листьях обусловлено разными типами мутаций (Фото 1,2,3,4). При сопоставлении отдельных типов пятен можно сделать выводы о специфичности действия загрязнителей, поступающих в почву при переработке нефти, а так же судить о механизмах их генотоксического действия. Изучение генетического эффекта от загрязнения среды нефтепродуктами, проведенное на сое показало, что во всех условно загрязненных зонах общее количество пятен на лист возрастает в несколько раз. Как видно из данных, приведенных в таблице 13, пятикратное увеличение общего числа пятен на листьях проростков загрязненных участков по сравнению с условно чистой зоной наблюдается в с. Долинск. В остальных населенных пунктах общее число пятен так же увеличивается в 3,7-4,9 раза. Для удобства сравнения полученные результаты приведены на рисунке 4. Таблица 13 Влияние нефтезагрязнений на сою Glycine max. (L.) Merrill, (общие данные).
