Введение к работе
Актуальность темы. Глобальные проблемы XXI-го столетия -ограниченность энергетических, пищевых, сырьевых ресурсов, загрязнение окружающей среды - способствуют тому, что мысль человека все больше обращается к микроорганизмам, как мощным и многообразным каталитическим системам, способным трансформировать вещества различной природы при относительно небольших затратах энергии и «наличии у них могущественной химической силы» (Вернадский, 1987).
Почвенная микробиология на современном этапе развития решает ряд фундаментальных проблем: участие микроорганизмов в круговороте веществ и превращении энергии в биосфере, роль микроорганизмов в почвообразовательных процессах, взаимодействие микроорганизмов и растений, охрана почв, управление микробными популяциями в почве и др. Одно из важнейших фундаментальных направлений почвенной микробиологии - исследование биоразнообразия микроорганизмов. Вопрос об исследовании почвенных микроорганизмов, как жизненно необходимых для функционирования и саморегулирования биосферы Земли, особенно остро был поставлен после проведения в Мексике в 1994г. Международного конгресса почвоведов «Почвы и биоразнообразие» (Добровольский, 1996; Tate, 1997), где почву рассматривали как среду обитания, генератор и хранитель жизни на Земле. «Почвы являются живыми, динамическими, сложными, комплексными системами» (Чернов и др., 2011), обладающими исключительным биологическим разнообразием. Внедрение молекулярных методов исследования в последние десятилетия существенно изменило традиционное представление о микробном разнообразии почв. Было показано, что в 1г почвы может находиться более 10 млрд микробных клеток - от нескольких тысяч до миллиона геномных видов, при том что к настоящему времени охарактеризовано не более 5тыс. видов. Только 0,1 - 1% микроорганизмов почвы представлены культивируемыми видами (Torsvilk et al., 1996). Одним из основных достижений в области изучения биоразнообразия является выявление группы архей как самостоятельного домена живых организмов (Woese et al, 1997; Воробьева, 2007).
В проблеме биоразнообразия определенное место занимают наноформы (НФ) почвенных бактерий. Проблема существования бактерий в почве в виде НФ, размеры которых значительно меньше размеров обычных бактерий и сопоставимы с размерами вирусов, имеет длительную историю (Новогрудский, 1933, 1935; Красильников, 1934, 1954; Никитин, 1964; Ананьева и др., 1979; Baath, 1992; Вае et al., 1972; Bakken, 1985; Casida, 1969; Morita, 1985; Гузев и др., 2003; Panikov, 2005; Дмитриев и др., 2008, Лысак, 2010; Дуда и др., 2012). Однако, до сих пор физиологические особенности, таксономия и экологические функции этих бактерий практически не изучены в связи с определенными
методическими трудностями. Между тем, знание указанных особенностей
необходимо для понимания закономерностей функционирования микробного
сообщества почвы. Кроме того, среди представителей НФ встречаются
возбудители заболеваний растений, животных и человека, например,
микоплазмы или L - формы патогенных бактерий. Эти
ультрамикроскопические бактерии традиционно служат объектом пристального внимания медиков, ветеринаров и фитопатологов, но до сих пор не попадали в поле зрения экологов и почвенных микробиологов. Поэтому, вопросы, связанные с их обитанием в почве и циркуляцией в биоценозе остаются практически не изученными.
В связи с вышеизложенным целью работы было изучение численности и разнообразия НФ бактерий в почве и корневой зоне растений, их участия в почвенных процессах и взаимодействия с растениями. Задачи исследования:
-
Разработка новых методических подходов к изучению НФ бактерий в почве.
-
Исследование динамики численности и разнообразия НФ бактерий в дерново- подзолистой почве и корневой зоне растений люцерны.
-
Изучение влияния железоокисляющих микоплазм на свойства лугово-черноземной почвы под культурой риса.
-
Оценка почвы как возможной среды обитания фитопатогенных микоплазм (на примере Acholeplasma laidlawii).
-
Изучение особенностей взаимодействия микоплазм (A. laidlawii) и растений.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение численности мелких и крупных форм бактерий в почве, ризосфере и ризоплане растений. Экспериментально показано, что значительная часть бактерий в дерново-подзолистой почве и корневой зоне растений люцерны имеет ультрамикроскопически малые размеры - средний диаметр клеток составляет 0,31±0,22мкм, длина - 0,55±0,27мкм. Доля НФ от общего числа бактерий в почве в среднем за исследуемый период составляет 65%, в ризосфере и ризоплане - 37% и 43% соответственно. Численность НФ в почве, их процентное содержание от общего числа бактерий, увеличивается в летнее время и снижается в зимний период. Обнаружено, что за время вегетации растений численность НФ и их количественная доля в составе популяций всех изученных групп бактерий (кроме олиготрофов) возрастает в ризосфере и снижается в ризоплане. Впервые методом трансмиссионной электронной микроскопии выявлен микроколониальный характер распространения НФ в почве, адгезированное состояние на поверхности почвенных частиц, наличие в клетках запасных веществ, что свидетельствует об их физиологической активности.
Из лугово-черноземной почвы под культурой риса выделены 8 новых штаммов микоплазм, отнесенных на основе проведенной идентификации к p. Siderococcus. Установлено, что бактерии интенсивно окисляют железо, которое откладывается на поверхности их клеток в капсулах, и служат «центрами осадкообразования» этого элемента в почве, повышают эффективную растворимость его гидроокиси, не вызывая при этом значительных изменений окислительно-восстановительного состояния окружающей среды. Выявлена способность изученных бактерий к образованию комплексных соединений с железом.
Впервые предложены селективные приемы выделения микоплазм из почвы, заключающиеся в ее механической обработке, использовании селективной среды и повышенной температуры инкубации посевов. Впервые охарактеризовано поведение интродуцированной популяции микоплазмы А. laidlawii в различных типах почв. Показано двумя параллельными методами (микробиологическим посевом и ПЦР), что интродуцированная популяция микоплазмы A. laidlawii сохраняется в черноземной почве в течение 15 суток, а в дерново-подзолистой - 1 сутки. Численность интродуцированной популяции не стабилизируется. Время выживания определяется исходным уровнем обилия популяции и факторами окружающей среды.
Впервые экспериментально установлено, что почва может играть роль естественного резерватора и источника фитопатогенных микоплазм. Показано, что A. laidlawii способна проникать из почвы в растения через неповрежденную корневую систему, мигрировать в наземные органы, длительно персистировать в них и вызывать специфические морфологические изменения.
Впервые изучено влияние микоплазм на формирование и эффективность бобово-ризобиального симбиоза. Разработана лабораторная модель взаимодействия растений, микоплазм и клубеньковых бактерий Установлено, что влияние A laidlawii на гомеостатичную симбиотическую систему Medicago sativa - Rhizobium meliloti выражается в задержке инфицирования ризобиями растения-хозяина и стимулирующем действии на нитрогеназную активность сформировавшейся системы.
Практическая значимость работы. Разработаны методические подходы для выявления и количественного учета микоплазм в почве, заключающиеся в способе десорбции микробных клеток с поверхности почвенных частиц, использовании селективных сред, режиме инкубации, проведении ПЦР. Показано, что для проведения ПЦР в черноземной почве целесообразно использовать непрямой способ выделения ДНК, так как при непосредственном ее экстрагировании происходит ингибирование реакции. Разработанные методы могут быть использованы в экологических исследованиях микоплазм в почве, что расширит имеющиеся представления об этой малоизученной группе бактерий.
Полученные экспериментальные доказательства того, что почва может играть роль естественного резерватора и источника фитопатогенных микоплазм, обнаружение ранее неизвестного пути проникновения бактерий через корневую систему обозначает направление поиска новых подходов к решению проблемы борьбы с микоплазмозами растений и предотвращения эпифитотий.
Для совместного культивирования растений и микоплазм в лабораторных условиях и выделения железоокисляющих микоплазм из почвы предложена питательная среда на основе растительного отвара.
Установлена устойчивость томатов сорта Золотая Капля к A. laidlawii.
Количественная оценка процесса окисления железа микоплазмами, их комплексообразующей способности дает основание для разработки биотехнологических способов регулирования подвижности питательных элементов в корневой зоне растений как приема повышения их пр одуктивно сти.
Результаты проведенных исследований используются в лекционных курсах по почвенной микробиологии, биологии почв, читаемых на факультете почвоведения, агрохимии и экологии РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева.
Проведение исследований было поддержано проектами ГКНТ СССР «Интербиоазот-2000», Ф-503-35-2А, ФЦНТП «Интеграция», грантом правительства г. Москвы «Земля Москвы», ЗАО ФЦСР. Основные защищаемые положения диссертации
-
Значительная часть бактерий в почве и корневой зоне растений представлена НФ. Динамика численности НФ в почве, ризосфере и ризоплане, их доля в бактериальном сообществе существенно различаются, отражая экологическую специализацию местообитаний.
-
В структуре бактериального комплекса лугово-черноземной почвы рисовников функционирует группа железоокисляющих микоплазм p. Siderococcus. Окисление железа приводит к увеличению его подвижности, миграции к бактериальной клетке как к «центру осадкообразования» и локальному накоплению в почве.
-
Почва является естественным резерватором и источником фитопатогенных микоплазм (A. laidlawii). Длительность выживания интродуцированной в почву популяции определяется факторами среды и исходным уровнем обилия.
-
Микоплазмы (A. laidlawii) способны проникать из почвы в растения через неповрежденную корневую систему, мигрировать в надземные органы, длительно персистировать в них, вызывать специфические морфологические изменения.
-
При инфицировании растений (Medicago sativa и Lycopersicum esculentum) микоплазмами (A. laidlawii) происходят деградация
ультраструктуры клеток листовой ткани, изменения морфогенеза, характерные для микоплазмозов растений в природных условиях,в то же время более интенсивный рост и развитие, стимулирующий (протективный) эффект на нитрогеназную активность. Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были доложены на Международной конференции по быстрой диагностике микоплазм (Иерусалим, Израиль, 1991), 4-ой Всесоюзной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» (Пущино, 1992), 9-ом (Эймс, США, 1992) и 12-ом (Сидней, Австралия, 1998) Конгрессах Международного общества микоплазмологов, 6-ом Международном Симпозиуме по микробной экологии (Барселона, Испания, 1992), 1-ой Международной конференции «Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность» (Днепропетровск, 1995), Всероссийской конференции «Микробиология почв и земледелие» (Санкт-Петербург, 1998), 2-ой Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), Всероссийской конференции «Сельскохозяйственная микробиология в 19-21вв.» (Санкт-Петербург, 2001), 11-ом Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям между растениями и микроорганизмами (Санкт-Петербург, 2003), 13-ой Всероссийской школе «Экология и почвы» (Пущино, 2005), Международной научной конференции «СП. Костычев и современная сельскохозяйственная микробиология» (Ялта, 2007), 6-ой Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность» (Санкт-Петербург, 2008), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологии и вирусологии» (Алматы, 2009), Международной научно-практической конференции «Люцерна в кормопроизводстве» (Лобня, 2013), научных конференциях РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева (2004,2007,2008), заседаниях кафедры микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА им.К.А. Тимирязева (2009, 2013).
Личный вклад автора в работу. Автор принимал личное участие во всех этапах исследования, ему принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач, планирование экспериментов. Он участвовал в выполнении экспериментальной работы, обобщении и интерпретации полученных результатов, подготовке научных публикаций. В работе использованы материалы, полученные аспирантами и студентами, выполнявшими свои исследования под руководством автора.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, в том числе 10 - в изданиях, рекомендуемых ВАК, 7 статей в сборниках, 15 тезисов докладов на конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6
