Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 10
1.1 Почва как среда обитания микроорганизмов 10
1.2 Особенности процессов почвообразования в городах 11
1.3 Микробные сообщества почв, подвергающихся интенсивной антропогенной нагрузке
1.3.1 Влияние тяжелых металлов и нефтепродуктов на почвенные микроорганизмы 14
1.3.2 Особенности структуры и организации микробных сообществ и их изменения в условиях города 20
1.3.3 Санитарно-показательные микроорганизмы, как компоненты микробных сообществ почв 23
1.3.4 Факторы, способствующие самоочищению почв от патогенных бактерий 26
1.4 Растительно-микробные взаимодействия 28
1.4.1 Особенности растительно-микробных взаимодействий 28
1.4.2 Растения как возможные резервуары патогенных бактерий общих для человека и растений . 31
1.4.3 Роль растений и микроорганизмов в оздоровлении почв подвергшихся усиленной антропогенной на грузке 35
Глава 2. Объекты и методы исследований 41
2.1 Объекты мониторинга почв района «Филевская пойма» 41
2.1.1 Местоположение исследуемой территории 41
2.1.2 Характеристики пробных площадок 42
2.1.3 Характеристики почв пробных площадок 43
2.1.4 Методика определения физических и химических характеристик почв исследуемой территории 45
2.1.5 Методика определения численности микроорганизмов 45
2.1.6 Методика определения респирометрических показателей и микробной биомассы 47
2.2 Объекты и методы модельных экспериментов 48
2.2.1 Объекты модельного эксперимента по изучению возможности проникновения кишечной палочки из почвы в ткани растений различных семейств 48
2.2.2 Методика проведения модельного эксперимента и поверхностной стерилизации растений 48
2.2.3 Объекты и методика модельного эксперимента по изучению динамики численности интродуцированной популяции кишечной палочки в почве и внутри растительных тканей 51
2.2.4 Объекты и методика модельного эксперимента по изучению процесса колонизации растений бактериями Escherichia coli в условиях загрязнения почвы тяжелыми металлами и нефтепродуктами. 51
2.2.5 Объекты и методика модельного эксперимента по изучению возможности применения биопрепарата «Псевдомин» для оздоровления почвы, загрязненной нефтепродуктами и бактериями группы кишечной палочки 52
Глава 3. Результаты и их обсуждение 55
3.1 Динамика численности основных физиологических групп микроорганизмов в почвах пробных площадок района массовой застройки «Филевская пойма» 55
3.2 Изучение разнообразия бацилл и микромицетов в почвах пробных площадок района массовой застройки «Филевская пойма» 69
3.3 Применение респирометрических показателей и микробного метаболического коэффициента для характеристики состояния микробных сообществ почв района массовой застройки Филевская пойма» 73
3.4 Динамика численности СПМ в почвах и грунтах пробных площадок района "Филевская пойма" 76
3.5 Исследование проникновения Escherichia coli в растения различных семейств и длительности ее сохранения в них 88
3.6 Исследования динамики численности интродуцированной популяции кишечной палочки в растениях и почве 93
3.7 Исследование процесса колонизации растений бактериями Escherichia coli в условиях загрязнения почвы тяжелыми металлами и нефтепродуктами 96
3.8 Исследование возможности применения биопрепарата «Псевдомин» для оздоровления почвы, загрязненной нефтепродуктами и бактериями группы кишечной палочки 101
Выводы 112
Список литературы 114
Приложения 142
- Особенности процессов почвообразования в городах
- Растения как возможные резервуары патогенных бактерий общих для человека и растений
- Методика проведения модельного эксперимента и поверхностной стерилизации растений
- Динамика численности основных физиологических групп микроорганизмов в почвах пробных площадок района массовой застройки «Филевская пойма»
Введение к работе
Актуальность. Как известно, интенсивная и многофункциональная деятельность человека в пределах крупных городов преобладает над естественными природными факторами почвообразования, приводя к формированию специфических почв. В Москве только около 6% площади близки к природным экосистемам, на остальных же территориях формируются так называемые урбоэкосистемы, которые создаются в результате деградации, уничтожения или замещения природных экосистем. Новообразованные экосистемы обладают меньшей рекреационной ценностью, нарушением биокруговорота, сокращением биоразнообразия как по составу, так и по структурно-функциональным характеристикам, увеличением числа патогенных микроорганизмов (Герасимова М.И. и др., 2003; «Экология города», 2004). Закономерности экологии патогенных микроорганизмов в пределах урбоэкоси-стем могут быть качественно отличны от тех, которые установлены за многолетнюю историю изучения естественных экосистем. В настоящее время перестала отвергаться сама возможность длительного существования патогенных микроорганизмов в почвах, водоемах или растениях (Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997). Способность микроорганизмов занимать все возможные местообитания и экологические ниши в почве, требует изучения проблем использования патогенными микроорганизмами, в частности энтеробактериями растений в качестве возможного местообитания. Следовательно, изучение особенностей городских почв, растительности, мониторинг их состояния, особенно в районах массовой застройки, необходим для эффективного оздоровления окружающей среды и населения городов.
Исследования последних лет показывают, что динамику энтеробакте-рий, в частности Е.соїі, в почвах не всегда можно объяснить фекальным загрязнением. Подобное положение подчиняется целому ряду закономерностей, которые в настоящее время только начинают изучаться. Так, установлено, что целый ряд патогенных и условно - патогенных микроорганизмов способен длительное время сохраняться в почвах (Поздеев O.K., 2001). Мно-
гие микроорганизмы способны переходить в так называемое «некультиви-руемое состояние» (Литвин В.Ю., 1999; Литвин В.Ю. и др., 2000). Механизмы перехода в данное состояние и его обратимость только начинают изучаться. Исследования последних лет показывают, что в почвах может находиться аборигенная популяция кишечной палочки, генетически не отличимая от штаммов характерных для микрофлоры человека и животных (Ishii S. et al., 2006). Многие микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae способны проникать внутрь растительных тканей и сохраняться там длительное время. Подобные данные показаны для иерсиний (Гордейко В.А., 1991), клебсиелл (Бирюкова О.В., 2001; Соколова А.Я., 2006) и кишечной палочки (Solomon Е.В. et al.,2002; Cooley М.В. et al.,2003; Ingham S.C. et al.,2004; Johannessen G. S. et al.,2004; Markova Yu.A., et al., 2006).
В свете изложенных фактов представляет интерес изучение популяций энтеробактерий в системе почва - растение при загрязнении почвы нефтепродуктами и тяжелыми металлами, являющимися одними из основных загрязнителей городской среды.
Все это обуславливает необходимость разработки методов, способствующих оздоровлению почв города.
Целью исследования являлось изучение микробных сообществ городских почв, поведения интродуцированной популяции энтеробактерий в системе почва-растение, а также определение действия поллютантов на взаимодействие растений и микроорганизмов.
Задачи исследования
Изучить динамику численности основных групп микроорганизмов, в том числе и санитарно-показательных, почв района «Филевская пойма» г. Москвы;
Изучить особенности динамики популяции Escherichia coli в системе почва-растение в условиях антропогенной нагрузки;
3.Определить влияние загрязнения тяжелыми металлами и нефтепродуктами на взаимодействие энтеробактерий и растений;
4. Определить возможности использования микробных биопрепаратов с целью подавления активности энтеробактерий и снижения антропогенного воздействия на окружающую среду.
Научная новизна. Впервые проведен комплексный многолетний микробиологический мониторинг почв района массовой застройки «Филевская пойма». Дана количественная характеристика основных групп микроорганизмов, в том числе санитарно-показательных, и оценена биологическая активность почв. Показана персистенция клеток Е.соН в растения различных семейств из почвы через корневую систему и оценена длительность присутствия кишечной палочки внутри растительных тканей. Впервые установлено, что в условиях интенсивного загрязнения почвы нефтепродуктами и тяжелыми металлами на фоне общего снижения численности интродуцированной популяции Е.соН в почве и растениях, наблюдается увеличение доли кишечной палочки в растениях. Подобное поведение бактерии в системе почва-растение свидетельствует о возможности превращения растений в резервуар патогенных бактерий в условиях интенсивной антропогенной нагрузки, что может являться дополнительным источником загрязнения окружающей среды энтеробактериями. Выявлена способность биопрепарата «Псевдомин», на основе штамма Pseudomonas putida 91-96, подавлять рост Е. coli в почве и внутри растительных тканей.
Практическая значимость. Показана возможность использования микробного метаболического коэффициента (qCC>2), для определения степени нарушения состояния микробных сообществ почв урбанизированных территорий. Оптимизирована методика определения динамики Е.соН в системе почва-растение. Рекомендуется использовать биопрепарат «Псевдомин» для ускорения очищения почв от энтеробактерий, в том числе Е. coli.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной научной конференции, посвященной 140-летию РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева (Москва, 2005), на V Всероссийской научно-практической конференции «Экология и ресурсо- и энергосберегающие тех-
нологии на предприятиях народного хозяйства (промышленность, транспорт, сельское хозяйство)» (Пенза, 2005), на Международной научной конференции посвященной 190-летию со дня рождения первого директора Петровской земледельческой и лесной академии Н.И. Железнова (Москва, 2006), на IV Международной научно-практической конференции «Природноресурсный потенциал, экология и устойчивое развитие регионов России» (Пенза, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Объем работы. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы, включающий 296 наименований, в том числе 93 зарубежных авторов, приложения. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 18 рисунками.
Работа выполнена в 2003 - 2006 гг. на кафедре микробиологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автор выражает признательность и благодарность научному руководителю, доценту, к.б.н. О.В. Селицкой, профессору, д.б.н. В.Т. Емцеву, сотрудникам кафедры микробиологии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, за помощь в проведении исследований. Автор благодарит руководителя Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, к.б.н. Г.И. Карлова и м.н.с. М.Ю. Куклева за помощь в проведении серии ПЦР. Особую благодарность автор хотел бы выразить руководителю Лаборатории почвенной биологии ИФХиБПП РАН, д.б.н. Н.Д. Ананьевой, за помощь в определении респирометрических показателей микробиологической активности почв. Также автор выражает благодарность студентам РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева Е.В. Столышковой и Ю.В. Коровиной за помощь, оказанную при отборе почвенных образцов и проведении опытов.
Особенности процессов почвообразования в городах
Деятельность человека в пределах крупных городов приводит к существенному изменению окружающей природной среды: изменяется рельеф, естественная растительность сменяется созданными человеком фитоценоза-ми, формируется специфический тип городского микроклимата, за счет увеличения площадей застройки и искусственных покрытий уничтожается или сильно изменяется почвенный покров. Все это приводит к образованию на территории городов специфических почв и почвоподобных тел (Строганова М.Н. и др., 1997; Герасимова М.И. и др.,2003). Почва во многом определяет качество городской среды. Почвы в городе образуются под воздействием тех же факторов почвообразования, что и естественные, но главным среди них выступает антропогенная деятельность, что и влечет за собой значительное изменение всех факторов почвообразования (Строганова М.Н. и др., 1990; Stroganova М., Prokofieva Т., 2000). Городские почвы имеют существенные отличия от природных почв, главными из которых являются: формирование на насыпных, намывных илах, перемешанных грунтах и культурном слое; наличие включений строительного и бытового мусора в верхних горизонтах; изменение кислотно-щелочного баланса с переходом в сторону подщелачи-вания; повышенное содержание солей; высокая загрязненность тяжелыми металлами и нефтепродуктами; изменение физико-механических свойств почв, выражающееся в понижении влагоемкости, повышением уплотненности по сравнению с зональными почвами; рост профиля за счет интенсивных атмосферных выпадений и эоловых перемещений (Строганова М.Н. и др., 1997). Хотя все перечисленные свойства в отдельности характерны и для не городских почв, специфика городских почв состоит именно в сочетании перечисленных свойств. Основным отличием городских почв от природных принято считать наличие диагностического горизонта "урбик". Это поверхностный насыпной, перемешанный горизонт, часть культурного слоя с примесью антропогенных включений (строительно-бытового мусора, промышленных отходов) более 5% и мощностью более 50 см; его верхняя часть гу-мусирована, наблюдается нарастание горизонта вверх за счет пылевых атмосферных выпадений и эоловых перемещений.
Предлагаемая М.И. Герасимовой с соавторами (2003) систематика поверхностных природных образований, распространенных на городской территории, основана на том, что вся территория города представлена: 1) открытыми, частично озелененными территориями; 2) закрытыми застроенными и заасфальтированными. Поверхностные тела первого типа территорий разделяются на группы почв естественных ненарушенных, естественно-антропогенных поверхностно-преобразованных (естественных нарушенных), антропогенных глубокопреобразованных почв - урбаноземов и искусственно созданных почвоподобных образований - техноземов, кроме того, на открытых поверхностях города залегают непочвенные образования - насыпные, перемешанные, намывные, техногенные и природные грунты. На заасфальтированных территориях второго типа под асфальтобетоном или другим дорожным покрытием формируется особая группа тел - почвы «экраноземы» и запечатанные грунты. Естественные ненарушенные почвы - сохраняют нормальное залегание горизонтов и приурочены к городским лесам и лесопарковым территориям, расположенных в черте города. Такие почвы определяются согласно принятым классификациям. Антропогенно-поверхностно-преобразованные естественные почвы - сочетают горизонт «урбик» мощностью менее 50 см и ненарушенную срединную и нижнюю части профиля. Почвы сохраняют типовое название с добавлением «урбо». Антропогенно-глубоко-преобразованные почвы образуют группу собственно городских почв - урбаноземов, в которых урбиковый горизонт имеет мощность более 50 см. Почвы этого типа формируются на культурном слое или на насыпных, намывных и перемешанных грунтах. По сравнению с зональными почвами урбаноземы характеризуются нарушенностью генетических горизонтов, уплотнением, более щелочной реакцией среды, снижением буферности, загрязненностью строительным мусором, токсичными ксенобиотиками (Строганова М.Н. и др., 1997). Урбаноземы подразделяются на две подгруппы:
1) Механически (или физически) преобразованные почвы, в которых произошла физико-механическая перестройка профиля: урбаноземы (собственно); культуроземы (агроурбаноземы); некроземы;
2) Химически-преобразованные почвы, в которых произошли значительные хемогенные изменения свойств и строении профиля за счет интен- , сивного химического загрязнения как воздушным, так и жидкостным путем: индустриземы («поллютоземы»); интруземы (нефтеземы, петролеумные почвы, ПАУ-почвы). На территории городов формируются почвоподобные техногенные поверхностные образования - техноземы. Подобные почвы ранее назывались «почво-грунт», «плодородный грунт». Техноземы подразделяются на реплантоземы и конструктоземы. Кроме этих почвоподобных поверхностных образований, в городах распространены участки с безгумусными природными и техногенными открытыми грунтами, а также территории муниципальных мусорных свалок. Большая часть почв территорий крупных городов представлена урбаноземами, а районы новостроек и строительных площадок урбо-техноземами.
Таким образом, на территории города формируются специфические почвы, в которых наряду с естественными факторами почвообразования наблюдаются и специфические. Так, значительную роль в формировании городских почв начинают играть разнообразные загрязняющие вещества, побочные продукты производственной деятельности человека.
Растения как возможные резервуары патогенных бактерий общих для человека и растений
О возможности растений служить резервуарами патогенных бактерий говорят данные эпидемиологии (заражение людей при употреблении овощей и фруктов) и эпизоотологии (сельскохозяйственные животные заражаются, поедая растительные корма). В растительных продуктах регулярно обнаруживаются различные бактерии, патогенные для человека и животных, и поэтому особенное значение приобретает вопрос об источнике и механизме инфицирования высших растений (Ingham S.C. et al., 2004;).
Постановка вопроса о патогенных бактериях, общих для человека и растений, по мнению В.Ю. Литвина с соавторами (1997) имеет несомненную эпидемиологическую и эпизоотологическую актуальность, учитывая растущую роль овощных культур в заболеваемости иерсиниозом, листериозом и прочими инфекциями, равно как и роль кормов в инфицировании скота. В работах Литвина с соавторами (Литвин В.Ю. и др., 1996; Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997; Литвин В.Ю. и др., 1997) был очерчен примерный круг бактерий, обитающих в растениях и способных вызывать патологию у человека, обсуждены возможные причины и эпидемиологические следствия такой общности.
Патологию человека вызывают около 16 видов псевдомонад, считающихся истинными сапротрофами или фитопатогенами. Из дыхательного тракта больных кистозным фиброзом выделены Pseudomonas серасеа и даже Pseudo-monas gladioli - типичный фитопатоген (Christenson J. С. et al., 1989). Псевдомонады, патогенные для человека {P. aeruginosa, Р. серасеа. P. fluorescens) уже давно известны как фитопатогены, способные поражать до 60 видов высших растений (Гвоздяк Р.И., Яковлева Л.М., 1987; Беляков В. Д., Литвин В.Ю., 1994; Scher, F. М. et al., 1985; Delden C.V., Iglewski B.H., 1998; Plotnik-ova J.M et al., 2000). Показано, что псевдомонады могут иметь симбиотиче-ские связи с зелеными водорослями (Вольберг М.М. и др., 1988).
Эрвинии известны в фитопатологии как возбудители болезней капусты, салата, томатов, огурцов, подсолнечника, бахчевых культур и т.д. (Матвеева Е.В., Тихонова Т.П., 1991; Cortes-Monllor А., 1990). Однако значительную роль эрвинии играют и в патологии человека, вызывая пищевые ток-сикоинфекции и септицемии, которые обусловлены токсическим фактором возбудителя (Гвоздяк Р.И. и др., 1972).
Листерии, играющие важную роль в патологии человека, широко распространены как в почвах, так и в растениях (Поманская А.А., 1963; Гершун В.И.,1979; Weiss J., Seeliger Н., 1975). Доказан рост концентрации листерии в нестерильной растительной массе и в силосе в течение 30 суток при низких температурах (Гершун В.И., 1988). Активно размножаясь, листерии неопределенно долго, до 12 лет, существовали в этих растительных субстратах. Доказан переход листерии из почвы в растения, длительное существование и активное размножение листерии в вегетативных органах растений, а также изменение их патогенных свойств при обитании в растении. Листерии способны существовать и в ассоциации с водорослями и донными отложениями (Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997; Faber J.M., Peterkin P.I., 1991).
Вибрионы (Vibrio cholerae) при обитании в воде имеют биоценотиче-ские связи с водными организмами, в том числе и с растениями (Марамович А.С., Наркевич М.И., 1993). Показано (Islam М. S. et al., 1990), что водный гиацинт и ряска могут служить природным резервуаром вибрионов, обеспечивая их существование в межэпидемические периоды и способствуя водному пути передачи возбудителя. Кроме того, выявлена связь заболеваний людей при вспышке холеры в Узбекистане с арбузами и дынями, инфицированными холерными вибрионами, попадавшими в эти растения при поливе с водой из открытых источников (Мухаммедов СМ. и др., 1992).
Микоплазмы имеют широкое распространение в природе, а отдельные виды, например Acholeplasma laidlawii, могут быть патогенными как для растений, так и для человека или теплокровных животных (Прозоровский СВ., 1993; Baseman J., Tully J., 1997). Acholeplasma laidlawii способны проникать из почвы через корневую систему в вегетативные органы люцерны, вызывая патологические изменения в клетках мезофилла, нарушающие фотосинтез (Мидянник Г.А., 1995).
Есть мнение, что бруцеллы произошли от фитопатогенов, которые при поедании зараженных растений передавались травоядным животным, становившимися новыми хозяевами возбудителя (Cherwonogrodzky J., 1993).
Особый интерес вызывает связь с растениями представителей семейства Enterobacteriaceae, к которому относится большинство санитарно-показательных микроорганизмов, а также возбудитель такого опасного заболевания как чума. Показано (Ю.А. Маркова и др., 2002, 2004,2005), что многие представители семейства Enterobacteriaceae обладают способностью колонизировать ризосферу растений и являются эндофитными ризобактериями. Иерсинии (Ypseudotuberculosis, Y. enter ocolitica), обитая в почве полей, неоднократно регистрировались в овощах и корнеплодах (особенно в ризосфере), выращенных на этих полях (Сомов ГЛ., 1976; Кузнецов В.Г. и др., 1983; Шустова Н.И. и др., 1991). Целенаправленное изучение связи иерсиний с высшими растениями и о путях циркуляции иерсиний в агроценозе, было проведено В. А. Гордейко (1990, 1991). Размножение и существование иерсиний на овощах и в капустном соке, их обладание активным хемотаксисом к сокам ряда овощей (Беседнова Н.Н., Венедиктов B.C., 1986), эксперименты на культурах растительных клеток (Венедиктов B.C. и др., 1989) свидетельствуют о возможности растений служить средой обитания иерсиний. Поедание инфицированных растений может вызывать высокую зараженность крупного рогатого скота (Гордейко В.А., 1990, 1991). Экспериментально доказана возможность проникновения иерсиний из почвы или воды через корневую систему внутрь растений и их существование в вегетативных органах (Литвин В.Ю. и др., 1991; Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997). Существует гипотеза "фитозоонозной" чумы (Ривкус Ю.З., Митропольский О.В., 1990). Предполагается, что "фитофаза" является основной и первичной в экологии возбудителя чумы (Yersinia pestis), который локализуется в корневой системе растений, а "териофаза" или эпизоотия признается вторичной, обусловленной передачей возбудителя грызунам с растениями. К сожалению, пока прямых экспериментальных доказательств этой гипотезы нет.
Методика проведения модельного эксперимента и поверхностной стерилизации растений
Для изучения возможности проникновения кишечной палочки из почвы внутрь растительных тканей растений различных семейств, длительности ее сохранения в них, а также выбора наиболее подходящих для последующих исследований видов растений нами были поставлены вегетационные опыты. Объектом исследований служили бактерии Escherichia coli непатогенного штамма, полученные из коллекции кафедры микробиологии РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева. В опытах использовали следующие декоративные и сельскохозяйственные растения - класс Двудольных (Dicotyledones): Астра однолетняя (Callistephus chinensis), Календула лекарственная (Calendula officinalis), Салат латук (Lactuca sativa), Тыква крупноплодная (Сисиг-bita maxima), Огурец (Cucumis sativus), Капуста (Brassica oleraceae), Редис (Raphanus sativus), Свекла (Beta vulgaris), Томат (Licopersicon esculentum); класс Однодольных (Monocotyledones): Пшеница (Triticum durum), Рожь (Se-cale cereale), Овес (Avena sativa), Ямень (Hordeum sativum).
В опытах использовалась дерново-подзолистая среднесуглинистая окультуренная почва (рН (НгО) - 5,6; рН (КС1) - 4,9; гумус (по Тюрину) - 3,2 %; сумма обменных оснований - 20,2 мг-экв/100 г почвы; гидролитическая кислотность - 3,2 мг-экв/100 г почвы; насыщенность основаниями - 86,3 %). Перед закладкой опыта в почве и на семенах растений определяли наличие клеток БГКП. Из приготовленной к посеву порции почвы отбирали среднюю пробу, которую исследовали на наличие БГКП путем высева почвенных разведений на среду Кесслера-Свенертона с последующим пересевом на среду Эндо из тех пробирок, где был обнаружен рост. Из порции семян, подготовленных к посеву, отбирали среднюю пробу и исследовали на наличие БГКП на поверхности и внутри семян. Для определения наличия БГКП на поверхности семян навеску семян массой 5 г. помещали в колбу со стерильной водой объемом 45 мл и взбалтывали на шейкере в течение 15 минут, после чего делали посев на среду Кесслера-Свенертона по общепринятой методике. Для определения наличия БГКП внутри семян их навеску массой 2 г промывали мыльным раствором, затем споласкивали дистиллированной водой и на 2 минуты помещали в спирт, после чего стерилизовали 10 % раствором гипо-хлорита натрия в течение 15 мин. После этого семена многократно промывали стерильной водой и разрушали в стерильной ступке со стерильным кварцевым песком при добавлении 18 мл стерильной воды. Из полученной суспензии проводили высев на среду Кесслера - Свенертона с последующим пересевом на среду Эндо из тех пробирок, где был обнаружен рост. Анализы не показали наличия БГКП в почве и в (на) семенах. До момента инокуляции растения выращивали в течение 10 суток в горшочках с почвой объёмом 500 мл (масса почвы 450 г). Для приготовления инокулята использовали культуру E.coli, выращенную на МПБ в течение 24 часов при температуре 37С и разведенную стерильной водой в пропорции 1:10. Титр инокулята составлял 7,0-108 КОЕ/мл. Инокулят вносили в ризосферу растений через стерильную стеклянную Г-образную трубочку стерильным шприцем. Численность ин-тродуцированных популяций бактерий определяли на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки после инокуляции в 4-х кратной повторности. Динамику численности E.coli изучали: 1) в растениях (корни и надземная часть); 2) в почве, в которой выращивались данные растения; 3) в инокулированной (и не инокулированной) почве без растений. Для поверхностной стерилизации растительного материала его извлекали из почвы и промывали мыльным раствором до полного очищения от частичек почвы и споласкивали стерильной водой. После этого растение разделяли на 2 части (корни и надземную часть) и определяли их массу. Затем растения на 5-Ю секунд погружали в 70% этанол. Кроме собственного стерилизующего действия спирта обработка растений этанолом перед помещением в основной стерилизующий раствор повышает стерилизующий эффект последнего. Стерилизацию поверхности растений осуществляли гипохлоритом натрия, выпускаемым под маркой "Белизна", разведен- v ным стерильной водой в пропорции 1:3, в течение 3 минут. После стерилизации растительный материал тщательно промывали в стерильной воде. Стерилизованное растение помещали в стерильную ступку со стерильным кварцевым песком, после чего туда добавляли стерильную воду пропорционально массе растительного материала (1:10). Растительный материал растирали до получения однородной суспензии. На более поздних стадиях опыта, когда масса растений значительно возрастала, стерилизованный растительный материал растирали в ступке без воды, после чего его навеску массой Юг переносили в колбу со стерильной водой в пропорции 1:10 и взбалтывали в течение 15 минут, после чего из колбы (или ступки) пипеткой отбирали порции объёмом 1 мл для приготовления разведений и высева на среду Кесслера-Свенертона. Для подтверждения наличия E.coli из пробирок со средой Кесс-лера-Свенертона, где был обнаружен рост бактерий, делали пересев на среду Эндо, затем проводили оксидазную реакцию и микроскопирование с окраской по Граму. Навеску почвы массой 10 г переносили в колбу со стерильной водой объёмом 90 мл, взбалтывали в течение 15 минут, после чего из колбы пипеткой отбирали порции 1 мл для приготовления разведений и высева на среду Кесслера-Свенертона. Наиболее вероятное количество клеток в единице объёма рассчитывали по таблице Мак-Креди. Повторность 4-х кратная. Кроме того, на Грам- и оксидазо- отрицательных колониях со среды Эндо, проводилась полимеразная цепная реакция (ПНР). Это позволило достоверно отличить E.coli от других энтеробактерий. В качестве праймера использовалась нуклеотидная последовательность, фланкирующая ген ответственный за синтез универсального стрессового белка специфичного для кишечной палочки (uspA) (Chen J., Griffiths M.W., 1998). ПЦР проводилась в Центре молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева.
Динамика численности основных физиологических групп микроорганизмов в почвах пробных площадок района массовой застройки «Филевская пойма»
Это связано как с относительно постоянной влажностью почвы, вследствие близости реки, так и с меньшей по сравнению с остальными пробными площадками антропогенной нагрузкой и меньшей нарушенностью почвенного покрова и травостоя, а также с наибольшей удаленностью данной площадки от источников загрязнения. Численность актиномицетов на пробных площадках №№3 и 4 за годы наблюдений оставалась приблизительно одинаковой (кроме пробной площадки №3, на которой численность этих микроорганизмов в 2004-2005 гг. была вдвое больше, по сравнению с 2003 г.), достигая в 2004 г. значений полученных для контрольной пробной площадки, при этом процентное содержание их также изменилось мало. Подобную динамику можно связать как с удаленностью данных площадок от вероятного источника загрязнения, так и с проводившейся рекультивацией почв на территориях данных площадок. Известно, что актиномицеты предпочитают почвы с повышенным рН, каковы 63 ми являются почвы и грунты городов (Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., 2001; Антоненко A.M., 2006). Почвы исследуемой территории характеризуются нейтральной реакцией среды, но в некоторых случаях наблюдается смещение кислотно-щелочного баланса в сторону подщелачивания. Гидролитическая кислотность небольшая, что также обусловлено влиянием антропогенного фактора. Такие показатели не характерны для зональных почв. Исследуемые почвы отличаются высоким содержанием обменных оснований, что не характерно для почв данной зоны. Это можно объяснить высоким уровнем минерализации грунтовых вод и их сульфатным загрязнением, а также широким использованием в строительстве извести, гипса и цемента.
В то же время на пробных площадках №№1 и 2 численность и процентное отношение актиномицетов или не изменилось (площадка №1) или несколько выросло (площадка № 2), однако в обоих случаях и численность и процентное отношение осталось ниже, чем на пробных площадках №№ 0,3,4. Это можно связать с тем, что почвы на пробных площадках №№ 1,2 переуплотнены, газоны не разбивались до 2005 года, содержание органического вещества было низким. А.Л. Степанов с соавторами (2005) также отмечает снижение содержания актиномицетов на участках с переуплотненной почвой.
Вообще, динамика численности актиномицетов не так показательна, как динамика бацилл, вследствие большей устойчивости актиномицетов к антропогенному воздействию, которое, как правило, влияет в первую очередь на структуру, а не на численность актиномицетного комплекса почвы (Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., 2001; Полянская Л.М. и др., 1997). На стройплощадке (пробная площадка №5) за годы наблюдений численность актиномицетов снизилась почти в полтора раза, но при этом их доля среди бактерий, использующих минеральные формы азота, увеличилась в 2 раза. На этой площадке полностью был уничтожен верхний горизонт почвы, снизилось количество органических веществ, кроме того, на почвах, образованных вывороченными породами легкого механического состава создался неблагоприятный водный режим. Подобные изменения динамики популяции актиномице-тов на строительных выворотах отмечает и ряд других исследователей (Степанов А.Л. и др.,2005). Имеется тенденция к осеннему уменьшению доли ак-тиномицетов. В летний период численность и процентное содержание акти-номицетов в почвах пробных площадок, как правило, несколько выше, чем в осенний период. Это вполне логично, так как в более сухие периоды доля ак-тиномицетов среди других бактерий возрастает, равно как и их численность («Регуляторная роль...»,2002; Зенова Г. М., Вустина Т. П. 1979).
В природе микромицеты преобладают над бактериями в средах с более высокой концентрацией ионов водорода, например, в слабокислых лесных почвах (рН=6,5-3,5) (Мюллер Э., Лёффлер В., 1995). В почвах встречаются разнообразные грибы, отличающиеся циклами развития, систематическим положением, биотическими связями (Великанов Л.Л., 1997; Томилин Б.А., 1977; Garret S. D., 195!). Динамика численности микроскопических грибов в почвах пробных площадок района Филевской поймы за 2003-2005 гг. представлена на рисунке 3.1.7. и в приложении 9. Относительно стабильная численность микроскопических грибов за годы наблюдения отмечалась на контрольной пробной площадке, наблюдавшиеся колебания были незначительны. На пробной площадке № 2 численность микромицетов в 1-й сезон наблюдений была ниже на 2 порядка, чем на остальных площадках, но за годы наблюдений восстановилась. Относительно стабильной за годы наблюдения оставалась численность микроскопических грибов на контрольной пробной площадке. Высокая численность микромицетов на пробных площадках 3 и 4 связана вероятнее всего с их удаленностью от вероятного источника загрязнения, так и с уходом за газонами на данных площадках. На пробной площадке № 5 численность микромицетов упала на порядок, что связано, вероятно, с прекращением поступления свежей органики, в частности листового опада. Вообще, растительные сообщества играют значительную роль в формировании сообществ микроскопических грибов почв (Римкевич О.В., 2006; Buyer J. S. et al., 2002; Kennedy N., et al., 2006). Отмечается некоторое увеличение числа микромицетов в осенний сезон по сравнению с летним, что, во-первых, можно связать с недостаточным увлажнением в летний сезон, во-вторых, с поступлением свежего растительного опада осенью, который активно используется как питательный субстрат и, в-третьих, в связи с тем, что вместе со свежим растительным опадом в почву попадают многочисленные эпифитные грибы («Регуляторная роль...»,2002; Добровольская Т.Г., 2002; Kennedy N., et al., 2006).
