Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Физико-химические свойства и метаболизм глутатиона
1.1 Распространение GSH среди живых организмов 17
1.2 Химическая структура и реактивность глутатиона 17
1.3 Синтез глутатиона и его регуляция
1.3.1 Ферменты, катализирующие синтез GSH 19
1.3.2 Регуляция синтеза GSH 21
1.4 Катаболизм глутатиона и у-глутамильный цикл
1.4.1 у-глутамильный цикл 23
1.4.2 Свойства и регуляция у-глутамилтранспептидазы 26
1.5 Транспорт глутатиона и его S-конъюгатов 28
1.6 Реакции окисления и восстановления глутатиона, глутатионредуктаза 35
1.7 Статус глутатиона 37
1.8 Редокс-системы клетки
1.8.1 Редокс-система глутатиона 43
1.8.2 Редокс-система тиоредоксина 47
1.8.3 Функциональная связь между редокс-системами глутатиона и тиоредоксина 51
1.8.4 Периплазматические редокс-системы 54
ГЛАВА 2. Окислительный стресс и редокс-регуляция клеточных функций
2.1 Окислительный стресс
2.1.1 Парадокс кислорода 57
2.1.2 Источники АФК 58
2.1.3 Химические реакции АФК 59
2.1.4 Повреждения, вызываемые окислительным стрессом . 60
2.1.5 Механизмы защиты от окислительного стресса 65
2.1.6 Адаптивный ответ на окислительный стресс 70
2.1.7 Редокс-регуляция ответа на окислительный стресс 75
2.2 Редокс-регуляция клеточных функций в клетках эукариот
2.2.1 Роль АФК в регуляции экспрессии генов 81
2.2.2 Роль глутатиона при апоптозе 84
2.3 Роль глутатионирования белков в регуляции клеточных функций 86
2.4 Роль глутатиона при окислительном стрессе 91
2.5 Катаболизм GSH как источник активных форм кислорода. 98
ГЛАВА 3. Другие функции глутатиона
3.1 Роль глутатиона в процессах детоксикации 101
3.1.1 Глутатион-Э-трансферазы 101
3.1.2 Деградация метилглиоксаля и формальдегида 104
3.1.3 Детоксикация тяжелых металлов и металлоидов 106
3.2 Роль глутатиона в активации токсичности и мутагенеза . 107
3.3 Роль GSH в регуляции внутриклеточного уровня ионов К+ . 108
3.4 Глутатион как резервная и транспортная форма цистеина . 113
3.5 Заключение к литературному обзору ' 115
ГЛАВА 4. Объекты, материалы и методы исследований 117
ГЛАВА 5. Редокс-статус глутатиона в культурах е. coli
5.1 Характеристика условий роста периодической культуры . 130
5.2 Изменение уровня глутатиона в растущих культурах Е. coli 132
5.3 Изменение уровня и редокс-статуса глутатиона при переходе клеток Е. coli в стационарную фазу роста после исчерпания глюкозы 136
5.4 Изменение редокс-статуса глутатиона в штаммах Е. coli,дефицитных по различным компонентам клеточных редокс-систем 142
5.5 Выводы к главе 5 146
ГЛАВА 6. Глутатион при окислительном стрессе в клетках e.coli
6.1 Изменения уровня и редокс-статуса глутатиона в аэробно растущих культурах Е. coli при окислительном стрессе
6.1.1 Изменение редокс-статуса глутатиона в культуре Е. coli при действии перекиси водорода 147
6.1.2 Изменение редокс-статуса глутатиона при обработке аэробно растущих клеток Е. coli менадионом 154
6.1.3 Влияние оксидантов на активность некоторых ферментов . 161
6.1.4 Редокс-статус глутатиона в штаммах, дефектных по антиоксидантным генам 165
6.2 Статус глутатиона и экспрессия антиоксидантных генов у Е. coli при действии цистина и перекиси водорода
6.2.1 Изменения уровня и редокс-статуса глутатиона при обработке клеток Е. coli перекисью водорода в присутствии цистина 168
6.2.2 Экспрессия антиоксидантных генов при обработке клеток Е. coli цистином и перекисью водорода 186
6.3 Роль глутатиона при окислительном стрессе у бактерий Е. coli
6.3.1 Влияние глутатиона на рост, выживаемость и мутагенез бактерий Е. coli в условиях окислительного стресса... 196
6.3.2 Роль глутатиона в регуляции каталазы HPI в аэробно растущих клетках Е. coli 205
6.4 Выводы к главе 6 215
ГЛАВА 7. Влияние изменений параметров среды на редокс-статус глутатиона и экспрессию антиоксидантных генов в аэробно растущих культурах Е. coli
7.1 Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Е. coli на температурные стрессы 217
7.1.1 Изменение уровней и редокс-статуса глутатиона при разных температурах в аэробно растущих культурах Е. coli 224
7.1.2 Экспрессия антиоксидантных генов при изменениях температуры в аэробно растущих культурах Е. coli 234
7.2 Изменение уровня и редокс-статуса глутатиона и экспрессии антиоксидантних генов при ответе аэробно растущих клеток Е. coli на осмотический шок 245
7.2.1 Изменение уровня и редокс-статуса глутатиона и его влияние на внутриклеточную концентрацию К+ при ответе клеток Е. coli гиперосмотический шок 248
7.2.2 Роль антиоксидантних систем в ответе клеток Е. coli на гиперосмотический шок 258
7.3 Изменение уровня и редокс-статуса глутатиона и экспрессии антиоксидантних генов при ответе аэробно растущих клеток Е. coli на сдвиг наружного рН и добавление ацетата натрия 264
7.3.1 Изменение удельной скорости роста, редокс-статуса глутатиона и концентрации калия в клетках Е. coli при добавлении ацетата и кислом стрессе 269
7.3.2 Изменение экспрессии антиоксидантних генов при добавлении ацетата и снижении рН среды в аэробно растущих культурах Е. coli 278
7.4 Выводы к главе 7 281
ГЛАВА 8. Турновер глутатиона и его роль в клетках Е. coli 284
8.1 Транспорт глутатиона в клетках Е. coli 284
8.2 Возможные физиологические функции глутатионового цикла в клетках Е. coli 304
8.3 Выводы к главе 8 312
Заключение 314
Выводы 330
Список литературы 333
- Реакции окисления и восстановления глутатиона, глутатионредуктаза
- Повреждения, вызываемые окислительным стрессом
- Роль GSH в регуляции внутриклеточного уровня ионов К+
- Изменение редокс-статуса глутатиона в культуре Е. coli при действии перекиси водорода
Введение к работе
^ Актуальность проблемы. Изучение роли и функций глутатиона
(GSH) в клетках эукариотических организмов давно привлекает внимание исследователей. Хорошо известна его роль как главного редокс-буфера и антиоксиданта, имеющего большое значение в поддержании тиол-дисульфидного равновесия в белках и в защите клеток от окислительного стресса и действия токсических соединений (Meister and Anderson, 1983;
** Arner and Holmgren, 2000; Ritz and Beckwith, 2001; Schafer and Buettner, 2001).
В последние годы новая волна исследований связана с выяснением роли глутатиона в генной экспрессии, клеточной сигнализации, в регуляции апоптоза и других клеточных процессов, в контроле активности ферментов путем образования смешанных дисульфидов с глутатионом (Voehringer, 1999; Klatt and Lamas, 2000; Filomeni et al., 2002; Paolicchi et al., 2002). Появились данные, указывающие на то, что регуляция всех важнейших биологических процессов, вплоть до решения проблемы жизни и смерти клетки, связана с изменениями редокс-состояния существенных тиоловых групп в белках при участии GSH и другого важнейшего редокс-активного соединения, тиоредоксина. Интенсивно изучаются медицинские и клинические аспекты функций глутатиона, включая канцерогенез и лекарственную устойчивость, нервно-дегенеративные и глазные болезни, болезни сердца, ВИЧ, состояние иммунной системы и старение организма.
Резкий контраст с этим исследовательским бумом представляет состояние изучения роли и функций глутатиона у прокариотических клеток. Такое положение связано с несколькими причинами. Во-первых, GSH содержат далеко не все прокариоты, он встречается преимущественно у грамотрицательных и лишь у некоторых видов грамположительных бактерий
, (Fahey et al., 1978; Newton et al., 1996). Во-вторых, мутантные бактерии,
полностью лишенные глутатиона, сохраняют способность к нормальному росту на богатой и бедной средах (Apontoweil and Berends, 1975b; Fuchs and
8 Warner, 1975; Murata et al., 1981). И, наконец, в-третьих, мутанты, не способные синтезировать глутатион, не проявляют повышенной чувствительности к действию оксидантов и генераторов супероксида (Greenberg and Demple, 1986; Romera and Canada, 1991). Таким образом, складывалось впечатление, что, в отличие от эукариот, GSH не играет существенной роли в бактериальных клетках. Однако дальнейшие исследования показали, что в стационарной фазе и при росте бактерий Е. coli на минимальной среде, отсутствие глутатиона в мутантных клетках приводит
^ к значительному повышению их чувствительности к действию Н2С>2 и
менадиона (Chesney et al., 1996; Vlamis-Gardikas et al., 2002). Глутатион также которых отсутствие отдельных компонентов может в той или иной мере компенсироваться повышенной активностью других. Так, функции редокс-системы глутатиона дублируются редокс-системой тиоредоксина (Ritz and Beckwith, 2001; Vlamis-Gardikas et al., 2002), а мутации по компонентам обеих этих систем активируют антиоксидантные ферменты (Prieto-Alamo et al., 2000). Поэтому слабый эффект отдельной мутации на рост и выживаемость в лабораторных условиях не всегда адекватно отражает функциональную значимость данного гена. Показано также, что система глутаредоксин 1/GSH играет регуляторную роль в активации OxyR, транскрипционного регулятора генов, откликающихся на пероксидный стресс (Zheng and Storz, 2000; Pomposiello ф and Demple, 2001b). Многие виды бактерий, не имеющих GSH, синтезируют другие низкомолекулярные тиолы, по-видимому, заменяющие глутатион в функциональном отношении (Sundquist and Fahey, 1989; Newton et al., 1996). А ряд бактерий, в том числе патогенных, не содержащих глутатиона, способны поглощать GSH из среды, используя его как антиоксидант и источник органической серы (Sherrill and Fahey, 1998; Vergauwen et al., 2003). Совокупность этих данных свидетельствует о том, что GSH может играть важную роль не только в эукариотических, но и в прокариотических клетках, и изучение функций глутатиона у бактерий является актуальной проблемой. В ранних работах нашей исследовательской группы было показано, что различные стрессовые воздействия на бактерии, растущие в аэробных условиях, вызывают быстрые сдвиги редокс-потенциала среды (скачки Eh), которые связаны с изменением количества низкомолекулярных тиолов в среде и внутри клеток (Октябрьский и др., 1981; 1984а,б; Октябрьский, Смирнова, 1986а,б; 1988; Октябрьский, Пшеничнов, 1982; Oktyabrsky, Smiraova, 1989; Смирнова, Октябрьский, 1990). Наблюдалась корреляция между изменениями уровней низкомолекулярных тиолов, калия и внутриклеточного рН, что позволило высказать гипотезу о взаимосвязи этих параметров и их влиянии на редокс-чувствительные элементы клеточного метаболизма (Oktyabrsky, Smirnova, 1993a,b; Oktyabrsky et al., 1993; Smirnova, Oktyabrsky, 1994; 1995). Поскольку в клетках E. coli основным низкомолекулярным тиолом является GSH, представлялось важным изучить изменения статуса внутриклеточного и наружного глутатиона и их роль при различных стрессовых воздействиях. В аэробных условиях многие стрессы в клетках эукариот и прокариот сопровождаются усилением продукции активных форм кислорода (АФК), что диктовало необходимость изучения антиоксидантных функций GSH в комплексе с другими антиоксидантными системами клетки. Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы было изучение статуса и роли глутатиона и его взаимодействия с другими антиоксидантными системами клетки при ответе бактерий Е. coli на различные стрессовые воздействия. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить изменения концентраций восстановленного (GSH) и * снаружи клеток в процессе аэробного роста периодических культур Е. coli. 2. Исследовать зависимость уровней и редокс-статуса глутатиона от 3. Изучить изменения уровней наружного и внутриклеточного связанном с добавлением перекиси водорода или генератора супероксида менадиона, при исчерпании глюкозы, при температурных стрессах, при гиперосмотическом шоке и при быстром снижении рН среды и цитоплазмы. Используя слияния промоторов антиоксидантных генов с геном р-галактозидазы, изучить изменения экспрессии антиоксидантных генов в указанных выше ситуациях и установить их связь со статусом глутатиона. Исследовать процесс выхода GSH из клеток Е. coli и его связь с клеточным метаболизмом и изменениями компонентов электрохимического градиента протонов. Изучить взаимосвязь уровня и редокс-статуса наружного и внутриклеточного глутатиона с трансмембранными потоками К+. Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое растущих культурах Е. coli при различных стрессах. Обнаружено, что снижению GSH и значительному падению редокс-статуса глутатиона внутри и снаружи клеток. Одновременное присутствие в среде цистина и Н202 многократно усиливает гибель бактерий, препятствует разложению Н202 клетками Е. coli, вызывает значительное повышение наружного GSSG и w ингибирует индукцию каталазы HPI и SOS-системы репарации ДНК. Впервые показано, что транспорту цистина в клетки предшествует его внеклеточное восстановление с участием наружного GSH. Бактерии, дефектные по синтезу и восстановлению глутатиона (gshA и gor), медленнее восстанавливают цистин во внеклеточной среде и более устойчивы к действию цистина и Н2О2. w Установлено, что при всех изученных стрессах, не связанных с добавлением экзогенных оксидантов, наблюдаются реакции, характерные для окислительного стресса, и, наряду с изменениями статуса глутатиона, происходит индукция антиоксидантных генов. Впервые показано, что переход культуры Е. coli в стационарную фазу при исчерпании глюкозы сопровождается возрастанием уровня GSSG внутри и снаружи клеток и 10-кратным снижением соотношения GSH/GSSGjn при длительном голодании, что может рассматриваться как прямое доказательство окислительного стресса в стационарной фазе. Обнаружено, что гиперосмотический шок сопровождается повышением экспрессии генов soxS и sod А, кодирующих транскрипционный регулятор SoxRS регулона, отвечающего на супероксидный стресс, и Mn-зависимую супероксиддисмутазу, соответственно. Двойные мутанты sodAsodB по обеим цитоплазматическим супероксиддисмутазам проявляют повышенную чувствительность к гиперосмотическому шоку. Обнаружено, что температурные стрессы в аэробно растущих культурах Е. coli вызывают выход части GSH из клеток в среду. Установлено, что клетки, длительное время растущие при пониженной температуре 20С, имеют низкий уровень GSHin и повышенную экспрессию генов katG, katE и soxS. У бактерий, адаптированных к температуре 42С, Щ возрастает скорость продукции супероксида, повышается уровень внутриклеточного GSH и увеличивается экспрессия генов soxS и gor. Показано, что резкое снижение рН среды или закисление цитоплазмы при 12 уровнем экспрессии антиоксидантных генов. Впервые установлено, что мутации в генах, продукты которых являются компонентами клеточных редокс-систем или участвуют в деструкции АФК, вызывают значительные изменения уровня и редокс-статуса глутатиона внутри и снаружи клеток. Показано, что снижение концентрации и редокс-статуса внутриклеточного # глутатиона у Е. coli вызывает возрастание каталазной активности в результате активации транскрипции генов katG и katE. Установлено, что одной из причин повышенной экспрессии katG в мутантах Е. coli (gshA) может быть более высокая, чем у родительских клеток, внутриклеточная концентрация Н2О2, которая достаточна для активации транскрипционного фактора OxyR, контролирующего экспрессию katG. Впервые показано, что выход GSH из клеток Е. coli является редокс-чувствительным процессом, происходит с использованием энергии ДдН+, прекращается при ингибировании дыхания и ускоряется при дефиците АТФ. Обнаружена корреляция между физиологическими изменениями статуса глутатиона при стрессах и концентрацией калия в клетках. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные позволяют создать целостную картину, отражающую взаимосвязанные изменения редокс-статуса глутатиона и других № антиоксидантных систем в бактериальных клетках при различных стрессовых воздействиях, что значительно расширяет представления о роли и Способность GSH или его редокс-статуса оказывать регуляторное влияние на экспрессию OxyR и RpoS-контролируемых генов может иметь очень важное 13 физиологическое значение для адаптации бактериальных клеток к стрессовым условиям, когда наблюдаются значительные сдвиги уровня и редокс-статуса глутатиона. Изучение причин, вызывающих изменения концентрации внутриклеточного GSH, позволило получить доказательства того, что эти изменения являются следствием резкого нарушения ионных потоков на цитоплазматической мембране. Предложена гипотеза, согласно которой непрерывная трансмембранная циркуляция GSH в аэробно растущих клетках Е. coli представляет собой элемент сенсорного и регуляторного механизма, откликающегося на изменение параметров внешней среды и осуществляющего тонкую координацию между потоками протонов и калия и уровнем внутриклеточного АТФ. Эта принципиально новая функция GSH может быть характерной для энергосопрягающих мембран, к числу которых принадлежат цитоплазматическая мембрана бактерий и внутренняя мембрана митохондрий. Полученные результаты могут служить теоретической основой для разработки и совершенствования методов и приемов, позволяющих подавлять развитие патогенной и другой микрофлоры при хранении и консервации пищевых продуктов и обеззараживании различных сред. В биотехнологической промышленности эти данные могут быть использованы для оптимизации процессов культивирования различных генно-инженерных штаммов. Кроме того, на основе выполненных исследований могут быть разработаны оптимальные условия для промышленного получения глутатиона в целях изготовления косметических средств, пищевых добавок и лекарственных препаратов. Основные положения, выносимые на защиту. 1. В процессе аэробного роста в периодической культуре клетки Е. coli поддерживают постоянную концентрацию внутриклеточного и наружного глутатиона. Мутации по генам, продукты которых являются компонентами клеточных редокс-систем или участвуют в деструкции активных форм 14 температурные стрессы, гиперосмотический шок, снижение наружного и внутриклеточного рН и исчерпание глюкозы) сопровождаются изменениями уровней и редокс-статуса глутатиона внутри и снаружи клеток. 3. При всех изученных стрессовых воздействиях, не связанных с it$ для окислительного стресса и происходят изменения экспрессии антиоксидантных генов. Наблюдается связь между уровнем и редокс-статусом глутатиона и экспрессией генов katG и katE, кодирующих каталазы HPI и НРИ. Выход глутатиона из клеток Е. coli является редокс-чувствительным процессом, он прекращается при ингибировании дыхания и усиливается при дефиците АТФ. Движущей силой транспорта является электрохимический градиент протонов. При аэробном росте бактерий скорость выхода GSH из клеток через неидентифицированную систему транспорта равна скорости его входа в клетки с участием у-глутамилтранспептидазы. Существует корреляция между физиологическими изменениями уровня внутриклеточного GSH и концентрацией калия в клетках Е. coli. Апробация работы и публикации. Материалы диссертационных Петербург, 1995; Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды-98" (ISEP^), Москва, 1998; V Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды-2001" (ISEP-2001), Пермь-Волгоград, 2001; II Съезде биохимического общества, Москва, 1997; Международной конференции "Биоантиоксидант", Москва, 2002; III Съезде биохимического общества, С.-Петербург, 2002. 15 По материалам диссертации опубликовано 62 работы, из них 11 статей в международных журналах, 18 статей в журналах РАН, 9 статей в ^ научных сборниках и 24 тезиса. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 399 страницах машинописного текста, включая 82 рисунка и 12 таблиц. Список " литературы содержит 743 источника, из них 29 отечественных и 714 зарубежных авторов. Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение неспецифического отклика и адаптивных реакций клеток на различные стрессовые воздействия» (индекс приоритетного направления 4.1.13, номер госрегистрации 01910055305). Исследования поддержаны пятью грантами РФФИ: № 94-04-11327-а; № 95-04- 11182-а; № 98-04-49053; № 01-04-48129 и № 03-04-49137, грантом Президиума РАН (физико-химическая биология) и грантом Президиума РАН (молекулярная и клеточная биология). (# Щ- 16 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Изучение функций глутатиона (GSH), открытого еще в конце 19 века, токсикологических, а также медицинских и клинических аспектов глутатиона, включая канцерогенез, лекарственную устойчивость, нервно-дегенеративные болезни, болезни сердца, ВИЧ, состояние иммунной системы и старение организма. В научных и научно-популярных изданиях глутатион называют самым мощным природным антиоксидантом, лучшим средством клеточной защиты и одним из гарантов здоровья индивида, а достижения последних двух десятилетий в изучении роли GSH в медицине приравнивают к настоящей «глутатионовой революции». Эти успехи относятся, в основном, к изучению функций глутатиона в клетках эукариот. Роль GSH у бактерий исследована в значительно меньшей степени. В большинстве живых клеток GSH выступает как важнейший антиоксидант при защите от окислительного стресса. В связи с этим окислительный стресс, антиоксидантные системы и редокс-регуляция клеточных функций также являются предметами данного обзора. GSH окисляется неэнзиматически в реакциях с дисульфидами, металлами и реактивными видами кислорода, а также в ходе реакций, катализируемых пероксидазами. Образующийся при этом дисульфид глутатиона (GSSG) очень токсичен для биологических молекул, поскольку легко реагирует со свободными сульфгидрильными группами. Поэтому в большинстве эукариотических и прокариотических клеток поддерживается высокое соотношение GSH/GSSG (Meister and Anderson, 1983). Восстановление GSSG в GSH катализируется ферментом глутатионредуктазой (КФ 1.6.4.2.) (GOR). GOR, по-видимому, играла критическую роль при эволюционной адаптации живых организмов к атмосферному кислороду. Она принадлежит к семейству флавоферментов пиридиннуклеотид-дисульфидоксидоредуктаз (Schirmer et al., 1989) и катализирует реакцию переноса восстановительных эквивалентов от НАДФН на GSSG. NADPH + GSSG + 1-1+-+ 2GSH + NADP Реакция является практически необратимой. К числу субстратов фермента относятся сам GSSG и смешанные дисульфиды GSH с у-глутамилцистеином и с коэнзимом А. GOR очень широко распространена среди бактерий, грибов, растений, простейших и животных. Все глутатионредуктазы, выделенные из различных источников, проявляют большое сходство молекулярной структуры и кинетических свойств, что свидетельствует о высокой эволюционной консервативности этого белка. Интересно, что аминокислотная последовательность GOR из цианобактерии Anabaena проявляет больше сходства с глутатионредуктазой растительного, а не бактериального чт происхождения, что может служить подтверждением эндосимбиотической теории, рассматривающей цианобактерии в качестве предшественников хлоропластов (Jiang et al., 1995). Некоторые эубактерии и архебактерии не содержат GOR, у трипаносом она замещена трипанотионредуктазой, ряд бактерий имеют редуктазы для низкомолекулярных дисульфидов, отличных от GSSG (Sundquist and Fahey, 1988; Schirmer et al., 1989). В клетках E. coli глутатионредуктаза кодируется геном gor. Бактерии, мутантные по этому гену, сохраняют нормальную способность к росту на богатых и бедных средах в жидкой культуре и на чашках (Davis et al., 1982; Tuggle and Fuchs, 1985). Кроме того, мутанты no gor поддерживают высокий пул восстановленного глутатиона, что указывает на возможность альтернативного пути для восстановления GSSG, независимого от GOR (Taggle and Fuchs, 1985). Эту функцию могут осуществлять ы глутаредоксиновая или тиоредоксиновая системы (Russel and Holmgren, 1988). В отличие от Е. coli, клетки S. cerevisiae, мутантные по GOR(g/r7), накапливают высокий уровень дисульфида глутатиона (в 200 раз выше обычного) и могут расти только при условии нормального функционирования одного из двух тиоредоксинов (Muller, 1996). GOR, выделенная из клеток Е. coli, является димером, состоящим из двух одинаковых субъединиц с молекулярным весом 55000 и имеет высокую гомологию с ферментом из клеток человека (Mata et al., 1984; Greer and Perham, 1986). Основное отличие между первичными структурами этих белков состоит в размерах и некоторых аминокислотных заменах в составе активного центра (Greer and Perham, 1986; Perham, 1987). Фермент имеет оптимум рН при 7,5 и ингибируется низкими концентрациями -гидроксимеркурибензоата. В клетках S. typhimurium и Е. coli активность глутатионредуктазы регулируется транскрипционным фактором OxyR (Christman et al., 1985; Michan et al., 1999). OxyR регулон отвечает на окислительный стресс, вызванный действием перекиси водорода и, таким образом, GOR можно отнести к антиоксидантным ферментам. Кроме того, показано, что в клетках Е. соН глутатионредуктаза находится под OxyR-независимым контролем альтернативной субъединицы РНК-полимеразы os (RpoS) (Becker-Hapak and Eisenstark, 1995). GOR не индуцируется в клетках, несущих двойную мутацию oxyR rpoS. GS является регулятором генерального ответа на стрессы, под ее контролем находится более 70 генов, обеспечивающих устойчивость к окислительному стрессу, ближнему ультрафиолету, тепловому шоку, повышенной осмолярности, низкому рН, этанолу и другим воздействиям (Hengge-Aronis, 2002). Таким образом, GOR в клетках Е. соН включена в глобальную регуляторную сеть, обеспечивающую адаптацию бактерий к различным стрессовым условиям. В клетках эукариот регуляция глутатионредуктазы также находится под контролем транскрипционных факторов, отвечающих на стрессы. Количество матричной РНК глутатионредуктаз, выделенных из хлоропластов и цитоплазмы листьев гороха (GOR1 и GOR2), возрастает при засухе и воздействии отрицательных температур (Stevens et al., 1997). В присутствии оксидантов в 2-3 раза повышается экспрессия глутатионредуктазы у дрожжей S. cerevisiae, эта регуляция зависит от транскрипционного фактора Yaplp (Grant et al., 1996). В клетках дрожжей S. pombe уровень транскриптов гена pgrl+, кодирующего глутатионредуктазу, возрастает при обработке менадионом, кумен гидропероксидом и диамидом, а также в условиях высокой осмолярности, теплового шока или стационарной фазы роста (Lee et al., 1997). Статус глутатиона определяется как общая концентрация глутатиона и количественное соотношение между различными формами, в которых он существует в клетке (Kosower, Kosower, 1978). Важнейшими из форм глутатиона являются восстановленный глутатион GSH, дисульфид глутатиона GSSG и смешанные дисульфиды, главным образом, GSS-белок, а также смешанные дисульфиды с низкомолекулярными SH-соединениями, такими как цистеин, а-пантотеин и коэнзим А (СоА). Среди других форм глутатиона могут быть тиоловые эфиры и производные глутатиона, которые образуются без участия SH-группы. В нормальных условиях основной формой, в которой глутатион присутствует в клетке, является свободный - восстановленный глутатион. Его концентрация варьирует в разных клетках, и приводимые обычно уровни укладываются в диапазон от 0,5 до 10 мМ. GSSG присутствует в клетке в гораздо более низких концентрациях (5-50 мкМ). Приводимые в литературе значения для уровня смешанных дисульфидов колеблются от 1% до 50% от общего содержания GSH в клетке. Минорная фракция смешанных дисульфидов представлена соединениями между GSH и ферментами. Основная часть GSS-белка, по-видимому, представляет собой «слабо» доступный пул GSH (Kosower, Kosower, 1978). Для того чтобы противостоять повреждающему действию окислительного стресса, клетки обладают целым рядом антиоксидантных систем и репаративных ферментов, большинство из которых при нормальном росте экспрессируется на низком уровне. Главную роль среди низкомолекулярных антиоксидантов играет глутатион. GSH взаимодействует с Н2Ог, Ог ", ОН- и НОО", образуя стабильный радикал GS", который димеризуется с образованием GSSG. GSSG затем восстанавливается глутатионредуктазой (Sies, 1986). Кроме глутатиона к низкомолекулярным антиоксидантам относятся аскорбат (витамин С), а-токоферол, витамины А и К, липоат, урат, убихинон, каротиноиды (Sies, 1997). К этой группе антиоксидантов, по-видимому, можно отнести видоспецифичные и gk постоянно образующиеся в клетках многих бактерий органические нитроксильные радикалы (Островский и др., 1990; Шумаев и др., 1992) и индуцируемый окислительным стрессом циклопирофосфат метилэритрита (Островский и др., 1997; Ostrovsky et al., 1992). Нитроксилы известны своей способностью катализировать реакцию дисмутации супероксида в перекись водорода и кислород (Krishna and Samuni, 1994), а наиболее вероятной функцией циклопирофосфата метилэритрита является связывание ионов переменной валентности, участвующих в развитии окислительного стресса. Наряду с низкомолекулярными антиоксидантами, в клетках практически всех организмов присутствуют ферменты, осуществляющие деструкцию АФК. К ним относятся супероксиддисмутазы (SOD), каталазы и пероксидазы. Супероксиддисмутазы катализируют дисмутацию 02 с образованием Н2О2 и Ог и играют центральную роль в защите клеток от окислительного стресса (Fridovich, 1995; Touati, 1997). Удаляя супероксид, SOD защищают клетки от прямого повреждающего действия Ог , а также предохраняют их от непрямой токсичности Ог ", предотвращая повышение внутриклеточного пула свободного железа и образование опасного ОН-. Бактерии Е. coli имеют три различных супероксиддисмутазы, кодируемые генами sodA, sodB и sodC и отличающиеся природой металлов в их активном центре (Imlay and Imlay, 1996). SodA содержит марганец (Mn-SOD), SodB имеет железо (Fe-SOD), a SodC - медь и цинк (Cu,Zn-SOD). Разные супероксиддисмутазы у Е. coli отличаются по способу регуляции и по внутриклеточной локализации и, по-видимому, выполняют несколько различные функции (Benov et al., 1995; Touati, 1997). Fe-SOD присутствует как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Она локализована в непосредственной близости от цитоплазматической мембраны, которая продуцирует около 2/3 всего 02 при аэробном росте Е. coli, и, вероятно, ее основная задача состоит в дисмутации Ог"-, образуемого при дыхании. Mn-SOD индуцируется в условиях окислительного стресса и ассоциирована с ДНК, что свидетельствует о ее роли в защите ДНК от окислительных повреждений (Steinman et al., 1994). Периплазматическая Cu,Zn-SOD индуцируется кислородом и при переходе в стационарную фазу роста (Imlay and Imlay, 1996). В ее функции входит дисмутация Ог ", образуемого неизвестным источником в периплазме или на наружной мембране, а также защита клетки от супероксида во внешней среде (Benov et al., 1995). Фенотип штаммов Е. coli, мутантных по индивидуальным супероксиддисмутазам, неотличим от клеток дикого типа (Carlioz and Touati, 1986). Штаммы, несущие двойную мутацию sodA sodB, проявляют ауксотрофность при росте на минимальных средах, имеют повышенную чувствительность к окислительному стрессу и высокую частоту спонтанного мутагенеза, что свидетельствует о значительных окислительных повреждениях метаболических ферментов, мембран и ДНК (см. раздел 2.1.4.). Регуляция экспрессии sodA носит сложный характер. Ген sodA находится под контролем нескольких глобальных транскрипционных регуляторов, вклад каждого из которых определяется условиями окружающей среды (Compan and Touati, 1993). В анаэробных условиях ген sodA репрессируется двумя регуляторными белками Fnr и АгсАВ. Репрессия, связанная с действием Fnr и АгсАВ, снимается при переходе к аэробным условиям. Дальнейшая активация транскрипции sodA в аэробных условиях происходит под действием окислительного стресса, вызванного добавлением редокс-циклических генераторов супероксида, и регулируется системой SoxRS. Экспрессия sodA активируется также в ответ на обработку клеток Е. coli различными ксенобиотиками и антибиотиками под контролем транскрипционного активатора МагА (компонент оперона MarRAB, обеспечивающего множественную устойчивость к антибиотикам). Наконец, sodA репрессируется белками Fur (регулятор генов, участвующих в ассимиляции железа) и IHF (фактор интеграции хозяина) (Compan and Touati, 1993). Наряду с транскрипционной регуляцией, может происходить посттранскрипционная регуляция sodA (Schrum and Hassan, 1994). Синтез Fe-SOD находится под положительным контролем Fur Ш (Niederhoffer et al., 1990). Гистоноподобные факторы H-NS и IHF репрессируют транскрипцию sodB (Dubrac and Touati, 2000). Таким образом, sodA и sodB регулируются Fur противоположным образом. Множественный регуляторный контроль генов sodA и sodB, по-видимому, необходим для точной координации внутриклеточного уровня супероксиддисмутаз с меняющимся в зависимости от условий культивирования уровнем продукции 02" и поддержания внутриклеточной концентрации Ог и, как следствие, свободного железа на уровне, безопасном для клетки. Перекись водорода, в том числе образуемая при дисмутации CV супероксиддисмутазами, разлагается каталазами с образованием кислорода и воды. Каталазы содержатся в клетках большинства живых организмов. Наиболее обычной формой каталазы про- и эукариот является тетрамер, каждая из субъединиц которого связывает один протогем IX группы. На первом этапе реакции одна молекула Н2О2 конвертируется в воду, при этом гем окисляется. На втором этапе электроны с другой молекулы Н2С 2 передаются на окисленный гем с образованием молекулярного кислорода. Реакция не требует энергии в виде восстановительных эквивалентов или АТФ, поэтому может протекать даже в энергетически истощенных клетках (Gilbert and Colton, 1999). Бактерии Е. coli имеют две каталазы: бифункциональную каталазу-пероксидазу (гидропероксидаза I, HPI ), кодируемую геном katG, и монофункциональную каталазу (НРП), кодируемую геном katE (Schellhorn, 1995). Оба фермента значительно отличаются друг от друга и от типичной каталазы. HPI содержит четыре субъединицы с молекулярным весом 81000 и два протогема IX группы. НРП имеет в своем составе шесть субъединиц с молекулярным весом 93000 и шесть гемов d-подобной группы (Loewen and Switala, 1986; Loewen, 1996). Обе каталазы локализованы в цитоплазме (Hillar et al., 1999). Благодаря своим нуклеофильным свойствам, глутатион участвует в детоксикации тяжелых металлов путем их хелатирования (Penninckx and Jaspers, 1982). Показано, что штаммы Е. coli, дефицитные по биосинтезу глутатиона, обладают повышенной чувствительностью к солям ртути, серебра, кадмия и мышьяка (Apontoweil and Berends, 1975b; Owens and Hartman, 1986b; Latinwo et al., 1998). Добавление экзогенного глутатиона способствует возобновлению нормального роста. Воздействие токсичных металлов на клетки часто сопровождается снижением уровня тиолов. Показано, например, что обработка бактериальных клеток хлоридом ртути приводит к снижению уровня восстановленных тиолов, в частности глутатиона (Gachhui et al., 1991; Turner et al., 1999). Такой же эффект оказывает воздействие теллурита на клетки Е. coli (Turner et al., 1999; Turner et al., 2001). Способность клеток к поддержанию высокого уровня глутатиона во многом определяет их устойчивость к действию токсичных металлов. Бактерии, устойчивые к хлориду ртути, вдвое повышают активность глутатионредуктазы и скорость синтеза глутатиона в ответ на добавление HgCl2 (Gachhui et al., 1991). В случае теллурита, присутствие детерминантов устойчивости kilA и ter защищает клетки от потери 60% восстановленного глутатиона, и, по-видимому, эти детерминанты являются ключевыми факторами, с помощью которых обеспечивается устойчивость Е. coli к теллуриту (Turner et al., 2001). Воздействие кадмия на клетки растений, также как ртути и теллурита на клетки бактерий, вызывает снижение уровня восстановленного глутатиона (Foyer and Rennenberg, 2000). При обработке кадмием происходит активация обоих ферментов синтеза глутатиона. Причем повышение активности у-глутамилцистеинсинтетазы коррелирует с устойчивостью к кадмию, а ее ингибирование усиливает токсическое действие кадмия (Chen and Goldsbrough, 1994; Gussarson et al., 1996). Однако даже 5-8 кратное повышение биосинтеза глутатиона не предотвращает снижение уровня GSH в ответ на обработку Cd. Таким образом, активация синтеза и редукции глутатиона может быть общим ответом на стресс, вызванный тяжелыми металлами, как в клетках прокариот, так и в клетках эукариот. В клетках дрожжей экспрессия гена gshl, кодирующего у-глутамилцистеинсинтетазу, регулируется тяжелыми металлами на уровне транскрипции при посредстве транскрипционного фактора Yapl (Stephen et al., 1995). В клетках млекопитающих промоторная область гена, кодирующего у-глутамилцистеинсинтетазу, содержит элементы ответа на действие металлов (MRE) (Lu, 1999). Наряду с системой биосинтеза, действие тяжелых металлов может индуцировать и другие пути, связанные с метаболизмом и турновером глутатиона. Например, кадмиевый фактор 1 (YCF1) в клетках дрожжей S. cerevisiae представляет собой АТФ-зависимую помпу глутатион-Б-конъюгатов (Li et al., 1996). Среди продуктов ars оперона (arsRDABC), обеспечивающих устойчивость бактерий к арсенату, по крайней мере, один, арсенатредуктаза (ArsC), нуждается в GSH для своей активности (Xu et al., 1998). Арсенатредуктаза катализирует конверсию Ars(V) в Ars(III), окисленный фермент затем восстанавливается системой глутаредоксин/глутатион (Shi et al., 1999). В подавляющем большинстве случаев конъюгация различных ксенобиотиков с GSH приводит к их детоксикации, однако известно несколько примеров, когда взаимодействие электрофильных веществ с глутатионом и их последующий метаболизм сопровождаются появлением токсичных и мутагенных производных. В частности показано, что алкилнитрозогуанидины, такие как Л -метил-Л -нитро-ІУ-нитрозогуанидин (MNNG) и его аналог Л зтил-Л -нитро-ІУ-нитрозогуанидин (ENNG), могут активироваться GSH, давая продукты с повышенной способностью к алкилированию ДНК и, соответственно, с высокой мутагенной активностью (Lawley and Thatcher, 1970). Вследствие этого, мутанты Е. coli и S. typhimurium, дефицитные по глутатиону, имеют более высокую устойчивость к мутагенному действию этих соединений, чем клетки родительских штаммов (Sedgwick and Robins, 1980; Kerklaan et al., 1985; Mohn et al., 1988). Предобработка мутантных бактерий глутатионом повышает их чувствительность к MNNG и ENNG до уровня, характерного для родительских клеток. Активация глутатионом мутагенного и канцерогенного действия ряда ксенобиотиков, таких как галоалканы, тригалометаны, галоалкены, дихлорометан, 1,2-дихлороэтан и 1,2-дибромо-З-хлоропропан может происходить при участии глутатион-Б-трансфераз (Van Bladeren et al., 1980; Perham et al., 1997; Tsuchida, 1997). Галоалкены, включая гексахлоро-1,3-бутадиен, в отличие от галоалканов, образуют конъюгаты с GSH, которые не имеют мутагенных свойств сами по себе, но их дальнейший метаболизм приводит к образованию реактивных тиолов, обладающих цитотоксическим и мутагенным действием (Tsuchida, 1997). Следует подчеркнуть, что активация токсинов, прямо или косвенно связанная с глутатионом, является редким событием и многократно перекрывается его защитным действием от различных токсических веществ. К числу важных функций глутатиона у грамотрицательных бактерий относится его участие в регуляции внутриклеточного уровня ионов К+. Транспорт и аккумуляция К+ в клетках бактерий играют центральную роль в жизненно важных процессах поддержания клеточного тургора и гомеостаза внутриклеточного рН (Booth, 1985; Epstein, 1986). Вход К+ в клетки является первичным ответом на осмотический стресс, а высокий уровень внутриклеточного К+ генерирует сигнал для индукции последующих механизмов осмотической адаптации (Booth and Higgins, 1990). Регуляция внутриклеточного рН, поддерживаемого клетками в узких пределах, также требует транспорта К+, который вызывает движение протонов в противоположном направлении. При этом поглощение калия клетками приводит к защелачиванию цитоплазмы, а выход К+, напротив, сопровождается ее закислением (Kroll and Booth, 1981; Kroll and Booth, 1983; Booth, 1985). Таким образом, поддержание клеточного тургора, гомеостаз внутриклеточного рН и контроль калиевого транспорта тесно взаимосвязаны друг с другом. Характер изменения концентрации глутатиона при переходе в стационарную фазу роста в значительной мере зависел от условий культивирования, прежде всего, от уровня аэрации культуры. Интересно, что если бактерии Е. coli К12 росли в условиях слабой аэрации (без перемешивания), концентрация GSHjn поддерживалась на уровне в 2,5 раза более низком, чем при перемешивании, и начинала снижаться сразу после исчерпания глюкозы в среде. Через двое суток голодания количество GSH в клетках падало до уровня, находящегося в пределах ошибки измерения. Другими авторами было показано, что в отмытых клетках Е. coli АВ1157, инкубируемых при интенсивной аэрации в 0,9% NaCl, уровень внутриклеточного глутатиона падал в 8 раз в течение 24 часов голодания, что сопровождалось также увеличением доли окисленных форм глутатиона, измеряемых как суммарное количество GSSG и смешанных дисульфидов (Saby et al., 1999). В наших ранних экспериментах при выращивании культуры Е. coli К12 в ферментерах АНКУМ или в термостатируемых ячейках при интенсивном перемешивании и продувке воздухом через 25 минут после остановки роста вследствие исчерпания глюкозы в среде М9 наблюдалось повышение уровня внутриклеточных небелковых тиолов (Oktyabrsky and Smirnova, 1993). В этих опытах количество тиолов в наружной среде возрастало сразу после остановки роста, а затем постепенно падало в процессе голодания. В анаэробных условиях увеличения концентрации тиолов в среде не наблюдалось, напротив, остановка роста Е. coli К12 сопровождалась снижением количества внеклеточных тиолов (Смирнова, Октябрьский, 1990). Таким образом, в наших экспериментах при переходе бактерий Е. coli в стационарную фазу роста вследствие исчерпания глюкозы наблюдалось повышение уровня GSSG как внутри, так и снаружи клеток. Если культура выращивалась в аэробных условиях, то в течение первых суток голодания повышение концентрации окисленной формы глутатиона компенсировалось увеличением уровня внутриклеточного GSH как за счет его аккумуляции из наружной среды, так и, главным образом, за счет синтеза de novo. Снижение содержания восстановленного глутатиона на фоне нарастания концентрации его дисульфида в последующий период голодания может быть результатом исчерпания энергетических ресурсов клетки, таких как АТФ, необходимого для биосинтеза GSH, и НАДФН, являющегося донором восстановительных эквивалентов при восстановлении GSSG глутатионредуктазой. Десятикратное падение редокс-статуса глутатиона в условиях длительного голодания клеток Е. coli К12 можно рассматривать как прямое доказательство сдвига редокс-статуса цитоплазмы в сторону окисленных значений. Ранее было показано, что в течение двух дней голодания в. стационарной культуре Е. coli в 4-5 раз возрастает содержание карбонильных групп в белках, что свидетельствует об их окислительном повреждении (Dukan and Nystrom, 1999). Одной из причин этого может быть наблюдаемое в наших экспериментах снижение редокс-статуса глутатиона, поскольку известно, что GSH и глутаредоксин 2 играют важную роль в защите белков от карбонилирования, индуцируемого Н2Ог (Vlamis-Gardikas et al., 2002). Показано также, что переход клеток Е. coli в стационарную фазу роста сопровождается индукцией ряда антиоксидантных генов, в частности katE, кодирующего гидропероксидазу 2 и находящегося под регуляторным контролем GS субъединицы РНК-полимеразы, и sodA, кодирующего супероксиддисмутазу (Loewen et al., 1985; Dukan and Nystrom, 1999; Michan et al., 1999). В наших экспериментах экспрессия sodA, измеряемая по уровню Р-галактозидазной активности в штамме Е. coli QC772, несущем слияние sodA-lacZ, возрастала в 1,9 раза по сравнению с растущей культурой в течение двух часов голодания. Индукция антиоксидантных генов во время стационарной фазы роста может вносить вклад в устойчивость голодающих бактерий к последующему окислительному и другим стрессам (McDougald et al., 2002), а мутации по этим генам снижают выживаемость клеток Е. coli в стационарной культуре (Dukan and Nystrom, 1999). Неизвестно, играет ли глутатион какую-то роль в регуляции экспрессии генов, индуцируемых при голодании, однако клетки Е. coli JTG10, дефицитные по синтезу GSH, в отличие от бактерий дикого типа, не приобретали устойчивости к оксиданту хлору после 24-часового голодания (Saby et al., 1999). В наших экспериментах выживаемость стационарной культуры Е. coli JTG10 была на 20% ниже, чем у родительского штамма Е. coli АВ1157 на протяжении 6 суток голодания. В последующие 8 суток выживаемость обоих штаммов имела близкие значения. Е. coli имеет две редокс-системы, которые обеспечивают поддержание восстановительных условий в цитоплазме, - это редокс-системы глутатиона и тиоредоксина (см. раздел 1.8). В настоящее время получены одинарные и множественные мутанты практически по всем компонентам цитоплазматических редокс-систем, что позволяет изучать функции и регуляцию отдельных генов (Potamitou et al., 2002а; Vlamis-Gardikas et al., 2002). Однако в литературе имеются лишь единичные данные по прямому измерению уровня и редокс-статуса глутатиона у этих мутантов. Изменения тиол-дисульфидного статуса, как правило, оценивались косвенно по уровню активности цитоплазматической щелочной фосфатазы (Ritz and Beckwith, 2001). Также отсутствуют данные об изменении редокс-статуса глутатиона в клетках, мутантных по периплазматическим редокс-белкам Dsb. Результаты наших экспериментов по определению внутриклеточного и наружного глутатиона у штаммов Е. coli, дефектных по некоторым компонентам клеточных редокс-систем, представлены в табл. 3. Измерения уровня глутатиона проводились в середине фазы логарифмического роста при OD670 = 0,4. Концентрации внутриклеточного GSH и GSSG и соотношение GSH/GSSGin в штамме Е. coli АЕ1319, несущем мутацию по гену gor, существенно не отличались от этих параметров у клеток Е. coli дикого типа. Ранее уже отмечалась способность бактерий Е. coli, мутантных по гену gor, поддерживать высокий пул восстановленного глутатиона (Tuggle and Fuchs, 1985). По мнению авторов, это указывает на возможность альтернативного пути для восстановления GSSG, независимого от глутатионредуктазы. В отличие от данных, полученных нами для растущей культуры, отсутствие глутатионредуктазы в стационарной фазе приводило к смещению глутатионового статуса в сторону окисленных форм и снижению соотношения GSH/GSSG почти в два раза по сравнению с родительским штаммом (Alonso-Moraga et al., 1987). В наших экспериментах концентрация GSH в наружной среде у бактерий, мутантных по gor, практически не отличалась от его уровня у клеток дикого типа.
защищал клетки Е. coli от повреждающего воздействия радиации в
присутствии кислорода (Harrop et al., 1991). Лишенные глутатиона мутанты
имели более низкое значение внутриклеточного рН и были более
чувствительны к резким изменениям рН и осмолярности среды (McLaggan et
al., 1990; Riccillo et al., 2000). Кроме того, накапливается все больше данных
окисленного (GSSG) глутатиона, а также соотношения GSH/GSSG внутри и
наличия мутаций в генах, продукты которых являются компонентами
клеточных редокс-систем или участвуют в детоксикации активных форм
кислорода.
'$ глутатиона и соотношения GSH/GSSG при окислительном стрессе,
^ исследование изменений уровней и редокс-статуса глутатиона в аэробно
окислительный стресс, связанный с воздействием низких и средних доз Н202,
не вызывает повышения концентрации внутриклеточного GSSG и
сопровождается увеличением соотношения GSH/GSSGm. Генератор
^ супероксида менадион, напротив, приводит к возрастанию уровня GSSG,
добавлении ацетата натрия сопровождаются снижением уровня
внутриклеточного GSH.
Обнаружено существование взаимосвязи между статусом глутатиона и
функциях глутатиона у прокариот. Обнаружено существование связи между
концентрацией GSHln и редокс-статусом глутатиона, с одной стороны, и
экспрессией генов, находящихся под контролем глобальных
я транскрипционных регуляторов OxyR и RpoS, с другой стороны.
кислорода, значительно модифицируют уровень и редокс-статус глутатиона
внутри и снаружи клеток.
її* 2. Резкие изменения условий культивирования (окислительный и
добавлением экзогенных оксидантов, наблюдаются реакции, характерные
исследований докладывались и обсуждались на Международной
Ф конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды-95" (ISEP'95), С.-
продолжает привлекать внимание многих исследователей. В базе данных
«Медлайн» содержится более 40000 работ, относящихся к изучению роли и
функций глутатиона. В их числе оригинальные статьи, обзоры и книги,
посвященные исследованию биохимических, физиологических,Реакции окисления и восстановления глутатиона, глутатионредуктаза
Повреждения, вызываемые окислительным стрессом
Роль GSH в регуляции внутриклеточного уровня ионов К+
Изменение редокс-статуса глутатиона в культуре Е. coli при действии перекиси водорода
Похожие диссертации на Роль глутатиона и других антиоксидантных систем при стрессах у Escherichia Coli
