Введение к работе
Актуальность проблемы. Жизненный цикл большинства бактерий связан с постоянной сменой параметров окружающей среды: рН, температуры, осмотического давления, а так же с воздействием солнечного излучения и химических веществ. Резкие изменения параметров окружающей среды приводят к стрессам, для адаптации к которым бактерии в процессе эволюции развили молекулярные механизмы, регулируемые на разных уровнях, в том числе и генетическом. Одной из важных систем, вовлеченных в защиту бактерий от повреждения ДНК при воздействии УФ-облучения и химических веществ, является SOS-система. Два регуляторных белка LexA и RecA контролируют SOS-ответ, включающий индукцию более 40 генов, продукты которых участвуют в репликации ДНК, репарации и контроле деления клеток (Friedberg et al., 1995; Fernandez de Henestrosa et al, 2000; Walker, 2000). Penpeccop LexA негативно регулирует экспрессию этих генов. При повреждении ДНК белок RecA активируется, связываясь с одноцепочечной ДНК в репликационной вилке, разрезает LexA и снимает репрессию генов SOS-ответа (Walker, 2000; Friedberg et al, 1995). В настоящее время все большее внимание уделяется изучению редокс-регуляции клеточной активности с участием таких тиоловых соединений как глутатион (GSH), тиоредоксин (Тгх) и глутаредоксин (Grx). На возможность редокс-регуляции SOS-ответа указывают опубликованные ранее данные о модуляции экзогенными низкомолекулярными тиолами экспрессии некоторых генов, входящих в SOS-регулон (Claycamp, 1988; Claycamp et al, 1990; Javor et al, 1988; Javor, 1989; Smirnova et al, 1994). Предполагается, что тиолы могут активировать SOS-ответ, участвуя как восстановители в реакциях, приводящих к повышению уровня активных форм кислорода (АФК), способных, в свою очередь, вызывать повреждения ДНК (Park and Imlay, 2003). Другой возможный путь - прямое или косвенное взаимодействие тиолов (в том числе, глутатиона или тиоредоксина) с белком RecA. На последнюю возможность указывает наличие в белке RecA SH-групп, существенных для его активности. Недавно обнаружено, что у Е. coli RecA, как
и ряд других белков, связан с тиоредоксином (Kumar J.K et al., 2004). Однако, в целом, данные по этой проблеме немногочисленны и противоречивы.
Цель настоящего исследования - изучение роли редокс-систем глутатиона и тиоредоксина в SOS-ответе у бактерий Е. coli, индуцированном УФ-облучением и химическими веществами.
Основные задачи исследования:
Изучить влияние мутаций по компонентам редокс-систем в растущих бактериях Е. coli на такие параметры как удельная скорость роста, выживаемость и частота мутаций.
Сравнить уровень индукции SOS-системы у штаммов, мутантных по компонентам редокс-систем, при действии УФ-света, перекиси водорода и митомицина С.
Измерить уровень внутриклеточного и внеклеточного глутатиона у штаммов, мутантных по компонентам редокс-систем, при действии УФ-света и перекиси водорода.
Исследовать влияние экзогенных тиоловых соединений и SH-реагентов на индукцию SOS-системы у растущих бактерий Е. coli.
Научная новизна. Обнаружено, что у бактерий Е. coli тиоловые редокс-системы глутатиона и тиоредоксина играют важную роль в SOS-ответе, индуцируемом облучением дальним УФ-светом или пероксидом. Выраженность изменений и их направленность зависят от вида мутации и экспозиции.
Впервые обнаружено, что при кратковременном облучении дальним УФ-светом (6 минут) бактерии Е. coli, дефицитные по синтезу тиоредоксина 1 и тиоредоксинредуктазы, проявляют более высокий уровень экспрессии гена sulA, входящего в SOS-регулон и более устойчивы к бактерицидному и бактериостатическому действию дальнего УФ-света по сравнению с клетками родительского типа.
Показано, что у бактерий Е. coli, дефицитных по синтезу глутатиона и тиоредоксинредуктазе, наблюдается более высокая частота индуцированных
мутаций при облучении УФ254 в течение 15 минут по сравнению с клетками родительского типа.
Показано, что мутанты по редокс-системам существенно отличались как между собой, так и от клеток родительского типа по своему ответу на окислительный стресс, вызванный действием экзогенной перекиси водорода. Как и в случае с УФ-облучением, из общего ряда мутантов выделяются бактерии, дефицитные по тиоредоксинредуктазе. Эти мутанты показали самый высокий уровень НгОг-индуцируемого мутагенеза и экспрессии генов sulA и katG, а также повышенную каталазную активность и устойчивость к бактериостатическому действию оксиданта. Обнаружено также, что эти мутанты отличаются высоким базовым уровнем внутриклеточного глутатиона и способностью восстанавливать этот уровень после окислительного стресса. Одновременно эти бактерии имели самый низкий базовый уровень внеклеточного глутатиона.
Впервые показано, что существует прямая связь между уровнем внутриклеточного глутатиона и УФ-индуцированной экспрессией гена sulA.
Теоретическое и практическое значение работы. Данные по устойчивости бактерий к действию УФ-света и перекиси водорода могут быть использованы для совершенствования методов стерилизации в медицине и биотехнологии.
Бактерии Е. coli, дефицитные по синтезу тиоредоксинредуктазы и показавшие высокий уровень Н202- и УФ-индуцированных мутаций, могут быть использованы в научных исследованиях и биотехнологии для получения различных мутантов с полезными свойствами.
Бактерии Е. coli, дефицитные по глутаредоксину и обладающие повышенным экспортом глутатиона, могут быть использованы в биотехнологии для получения этого антиоксиданта без разрушения клеток.
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре физиологии растений и микроорганизмов ГОУ ВПО Пермский государственный университет.
Основные положения, выносимые на защиту.
Отсутствие того или иного компонента тиоловых редокс-систем у Е. coli приводит к существенным изменениям в ответе бактерий на облучение дальним УФ-светом, в том числе, в тех параметрах, которые контролируются SOS-системой (экспрессия гена sulA, мутагенез и выживаемость).
Облучение бактерий УФ-светом приводит к повышению уровня внутриклеточного глутатиона во всех испытанных штаммах и снижению внеклеточного глутатиона в клетках родительского типа и у бактерий, дефицитных по тиоредоксинредуктазе.
Существует прямая связь между уровнем внутриклеточного глутатиона и УФ-индуцированной экспрессией гена sulA.
Наибольшие изменения изучаемых параметров характерны для мутантов Е. coli, дефицитных по тиоредоксину 1 и тиоредоксинредуктазе. У этих бактерий при кратковременном облучении дальним УФ-светом наблюдались повышенные уровни экспрессии sulA, а также более высокая устойчивость к бактериостатическому и бактерицидному действию УФ254 по сравнению с клетками родительского типа.
Повышенная устойчивость мутантов Е. coli по тиоредоксинредуктазе к действию перекиси водорода связана с высоким уровнем экспрессии генов sulA и katG, а также с повышенной каталазной активностью.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы были представлены на молодежной конференции УрО РАН «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», г. Пермь (2007); VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет», Пермь - Н.Новгород - Пермь (2008); II конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз 2009», г. Пермь (2009). По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах печатного текста, иллюстрирована 41 рисунком и 5 таблицами; состоит из
