Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Характеристика действия разных типов излучений на бактериальные клетки 11
1.2. Механизмы действия разных типов излучений на микроорганизмы 22
1.3. Фотосенсибилизаторы и фотодинамическое действие излучений на микроорганизмы 29
1.4. Обоснование выбора микроорганизмов для исследования 34
2. Экспериментальная часть 43
2.1. Материалы и методы 43
2.1.1.Микроорганизмы 43
2.1.2. Источники излучения и фотосенсибилизаторы 44
2.1.3. Микробиологические методы исследования 45
2.1.4. Моделирование влияния излучений на бактерии 49
2.1.5. Подготовка лабораторных животных к исследованию микроциркуляции крови 50
2.1.6. Использование метода спекл-микроскопии 52
2.1.7. Статистическая обработка результатов 61
2.2. Собственные результаты и их обсуждение 62
2.2.1. Изменения морфофизиологических характеристик is. coli Са58 при действии синего и красного низкоинтенсивного светодиодных излучений 62
2.2.2. Изменения численности популяций Е. coli Са58 и S. aureus 209Р при действии низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения 78
2.2.3. Изучение влияния различных штаммов Е. coli и токсин-содержащих материалов на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс методом спекл-микроскопии
Заключение
Выводы
Список использованных источников литературы
- Характеристика действия разных типов излучений на бактериальные клетки
- Фотосенсибилизаторы и фотодинамическое действие излучений на микроорганизмы
- Микробиологические методы исследования
- Изменения морфофизиологических характеристик is. coli Са58 при действии синего и красного низкоинтенсивного светодиодных излучений
Введение к работе
Актуальность темы. Изучение морфофизиологических характеристик условно-патогенных бактерий и их взаимодействия с организмом животных и человека представляет традиционно большой интерес в области прикладной микробиологии, в то же время актуальными задачами являются исследования состояния микробных популяций и их адаптационного потенциала на фоне действия стрессовых факторов различной природы (Шендеров, 1994; 1998; Белобородова, 1998; Митрохин, 2000; Доронин, Шендеров, 2002; Ильин, Воложин, Виха, 2005; Ильина, 2006; Тихомирова, 2007; Shrivastava, 2007).
В настоящее время в медико-биологических исследованиях и в клинической практике для достижения выраженного фотодинамического эффекта по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмов, равно как и с целью терапевтического воздействия на макроорганизм, широко используются электромагнитные излучения с различными длинами волн (Фрайкин и др., 1986; Зорина и др., 1988; Страховская и др., 1998; Тучин, 1998; Страховская и др., 2002а; 2002б; Шумарина и др., 2003; Soukos, Ximenez-Fyvie, Hamblin, 1998; Bliss et al., 2004; Hamblin, Hasan, 2004; Lin, Chen, Huang, 2004; Maisch et al., 2005; Wong, 2005).
Антибактериальная фотодинамическая терапия (ФДТ), основанная на избирательной окислительной деструкции патогенных микроорганизмов при комбинированном воздействии красителя-фотосенсибилизатора и света с определенной длиной волны, рассматривается на настоящий момент как альтернатива антибиотикотерапии (Абрамова, 1978; Готовский, Вышеславцев, Косарева, 2001; Kjedstad, Johnson, 1986; Wainwright, 1998; Strakhovskaya et al., 1999; Wood et al., 1999; Meisel, Kocher, 2005). Представляется возможным использовать эффект действия излучений для коррекции численности определенного вида бактерий в составе нормальной микрофлоры (Журавлева, 2004; Тучина, 2008; Wilson, Dobson, Harvey, 1992; Wilson, 1993; Millson et al., 1996; Zeina et al., 2001; Tuchin et al, 2003). В литературе достаточно широко описаны эффекты действия на микроорганизмы ионизирующих и УФ-излучений (Владимиров и др., 1975; Цзю, Джаманова, Прохорова, 1983; Фрайкин и др., 1986; Беленикина, Фрайкин, 1989); в то время как влияние видимого света и, особенно, длинноволновых (ИК- и радиодиапазона) излучений остаётся практически не исследованным. При этом следует отметить, что изучение эффектов, оказываемых излучениями на бактерии, имеет и фундаментальный характер, поскольку излучения способны оказывать как положительное, так и отрицательное влияние, механизмы которого не ясны до настоящего времени (Рубин, 1973; Тимошин, Бекер, 1990; Тимошин, Данилевич, Рапопорт, 1991; Трушин, 2002). Данных о стрессовых реакциях микроорганизмов на действие этих типов излучений, используемых в ФДТ, и оценке их адаптационного потенциала, недостаточно, а их получение представляет значительный научный интерес и может иметь прикладное значение.
Микроорганизмы и биологические препараты, созданные на их основе, могут неоднозначно действовать на макроорганизм, вызывая как местные, так и общие побочные реакции за счёт различных метаболитов (Мельников, 1969; Бондаренко, 1999; Воробьев, 1999; Тихомирова, 2005; Brubaker, 1985; Isenberg, 1988; Finley, Falkow, 1989; Bhakdi, Tranum-Jensen, 1991; Falkow, Isberg, Portnoy, 1992; Dougan, 1994). В общем случае местные патологические реакции приводят к нарушениям лимфо- и гемодинамики, прежде всего в микрососудах. Подобные изменения характеристик и структуры потоков крови несут в себе важную патогенетическую и диагностическую информацию, отражающую характер действия микроорганизма на состояние макроорганизма (Борисов, Дворкина, Корнеева, 1985; Галанжа, 2004; Ульянова, Ганилова, Ульянов, 2007). Для оценки этого влияния в последние годы в биомедицинской практике используется спекл-микроскопия, позволяющая in vivo в режиме реального времени провести наблюдение за изменениями гемодинамики сосудов (Тучин, 1998; Федосов, Ульянов, 2001; Ульянова, 2006; Ульянова, Ганилова, Ульянов, 2007; Aizu et al., 1990; Ulyanov, 1995; 2001; 2002).
В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение реакций популяций бактерий на действие низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов антропогенного происхождения и оценка локального влияния этих бактерий на микроциркуляцию крови макроорганизма методом спекл-микроскопии.
Цель работы – изучить изменения численности популяций, морфологических и физиологических характеристик бактерий Staphylococcus aureus 209Р и
Escherichia coli в условиях in vitro при действии синего и красного низкоинтенсивных светодиодных излучений (НСИ), дециметровых сверхвысокочастотных (СВЧ) радиоволн с разной поляризацией и мощностью, а также влияние разных штаммов E. coli на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс.
Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Оценить численность популяции клеток E. coli Са58 под влиянием синего низкоинтенсивного светодиодного излучения.
-
Изучить культуральные свойства, морфологические характеристики и численность популяции сенсибилизированных метиленовым синим клеток E. coli Са58 при действии красного низкоинтенсивного светодиодного излучения.
-
Определить изменения численности популяций бактериальных клеток
E. coli Са58 и S. aureus 209Р под влиянием низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения с разной поляризацией и мощностью. -
Оценить in vivo влияние бактериальных взвесей различных штаммов E. coli, сенсибилизированных метиленовым синим и подвергнутых фотодинамическому воздействию, и токсинсодержащего материала на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс ex tempore методом спекл-микроскопии.
Научная новизна. Показаны изменения морфологических и физиологических характеристик несенсибилизированных и сенсибилизированных метиленовым синим штаммов E. coli при действии in vitro низкоинтенсивного светодиодного синего
(467 нм) и красного (660 нм) излучений. Определён дозозависимый характер изменения жизнеспособности условно-патогенных штаммов E. coli при действии красного НСИ. Впервые установлено влияние in vitro на численность популяций и культуральные свойства разных штаммов E. coli и S. aureus 209Р дециметровых радиоволн СВЧ-диапазона и показана зависимость численности популяций изученных штаммов от поляризации и мощности СВЧ излучения. Впервые показаны изменения скорости кровотока в брыжейке белых крыс ex tempore in vivo при действии облученных красным НСИ сенсибилизированных клеток E. coli разных штаммов. Обнаружено увеличение скорости кровотока в первые минуты после аппликации на брыжейку белых крыс супернатанта необлученных и несенсибилизированных штаммов E. coli, содержащего экзо- или эндотоксин.
Практическая значимость. Полученные результаты вносят вклад в разделы микробиологии, связанные с исследованиями процессов адаптации микроорганизмов к действию стрессовых факторов антропогенного происхождения, а также в понимание механизмов действия биологических препаратов на циркуляцию крови в капиллярах макроорганизма.
Выявлены параметры светодиодного и радиоизлучения, способные привести к увеличению или уменьшению численности E. coli Ca58 и S. aureus 209P. Результаты исследований могут быть использованы в практике биомедицинских исследований действия разных видов излучений, а также в клинической практике с целью выбора оптимальных режимов излучения при фотодинамической и микроволновой терапии при лечении и профилактике гнойно-воспалительных заболеваний.
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по общей микробиологии и экологии микроорганизмов, написании курсовых и дипломных работ в Саратовском государственном университете имени Н.Г Чернышевского и Саратовском государственном техническом университете.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Популяционная численность, морфологические и физиологические характеристики бактерий E. coli Ca58 претерпевают дозозависимые изменения под действием светодиодного красного (660 нм) излучения на сенсибилизированную метиленовым синим культуру, и светодиодного синего (467 нм) излучения – на несенсибилизированную культуру.
-
Популяционная численность E. coli Ca58 и S. aureus 209P изменяется под действием низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения различной поляризации и мощности.
-
Аппликация бактериальных взвесей E. coli, подвергнутых фотодинамическому воздействию, и токсинсодержащего материала E. coli приводит к изменениям скорости микроциркуляции крови в капиллярах брыжейки белых крыс, регистрируемых методом спекл-микроскопии.
Работа выполнена в рамках НИР СГТУ «Разработка методических подходов к комплексной оценке состояния живых организмов при действии различных экологических факторов», частично поддержана грантом № 45434 в рамках ведомственной научной программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (СГУ, 2006); а также в рамках НИР Федерального агентства по образованию № 1.4.09. «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и разработка когерентно-оптических и спектральных методов медицинской диагностики и фототерапии» (СГУ, 2009).
Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены на: Международных школах для молодых учёных и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике Saratov Fall Meeting (Саратов, 2003; 2007); научных конференциях биологического факультета СГУ «Исследования молодых учёных и студентов в биологии, секция «Микробиология и паразитология» (Саратов, 2004; 2005; 2008);
IV Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); Заочной электронной конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (2007 г.); XII Всероссийском Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008); 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2009); 1-м этапе молодежного научно-инновационного конкурса «У.М.Н.И.К.» Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (Саратов, 2009).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 9 печатных работах, в том числе 3 – в изданиях из перечня ВАК РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных источников литературы. Работа изложена на 120 страницах, содержит 5 таблиц и 27 рисунков. Список использованных источников литературы включает 157 наименований, в том числе 54 работы зарубежных авторов.
Характеристика действия разных типов излучений на бактериальные клетки
В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение реакций популяций бактерий на действие низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов антропогенного происхождения и оценка локального влияния этих бактерий на микроциркуляцию крови макроорганизма методом спекл-микроскопии.
Цель работы — изучить изменения численности популяций, морфологических и физиологических характеристик бактерий Staphylococcus aureus 209Р и Escherichia coli в условиях in vitro при действии синего и красного низкоинтенсивных светодиодных излучений (НСИ), дециметровых сверхвысокочастотных (СВЧ) радиоволн с разной поляризацией и мощностью, а также влияние разных штаммов Е. coli на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс.
Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи: 1. Оценить численность популяции клеток Е. coli Са58 под влиянием синего низкоинтенсивного светодиодного излучения. 2. Изучить культуральные свойства, морфологические характеристики и численность популяции метиленовым синим клеток Е. coli Са58 при действии красного низкоинтенсивного светодиодного излучения. 3. Определить изменения численности популяций бактериальных клеток Е. coli Са58 и S. aureus 209Р под влиянием низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения с разной поляризацией и мощностью. 4. Оценить in vivo влияние бактериальных взвесей различных штаммов Е. coli, сенсибилизированных метиленовым синим и подвергнутых фотодинамическому воздействию, и токсинсодержащего материала на мик 8 роциркуляцию крови в брыжейке белых крыс ex tempore методом спекл-микроскопии. Научная новизна Показаны изменения морфологических и физиологических характеристик несенсибилизированных и сенсибилизированных метиленовым синим штаммов Е. coli при действии in vitro низкоинтенсивного светодиодного синего (467 нм) и красного (660 нм) излучений. Определён дозозависимый характер изменения жизнеспособности условно-патогенных штаммов Е. coli при действии красного НСИ. Впервые установлено влияние in vitro на численность популяций и культуральные свойства разных штаммов Е. coli и S. aureus 209Р дециметровых радиоволн СВЧ-диапазона и показана зависимость численности популяций изученных штаммов от поляризации и мощности СВЧ излучения. Впервые показаны изменения скорости кровотока в брыжейке белых крыс ex tempore in vivo при действии облученных красным НСИ сенсибилизированных клеток Е. coli разных штаммов. Обнаружено увеличение скорости кровотока в первые минуты после аппликации на брыжейку белых крыс супернатанта необлученных и несенсибилизированных штаммов Е. coli, содержащего экзо- или эндотоксин. Практическая значимость Полученные результаты вносят вклад в разделы микробиологии, связанные с исследованиями процессов адаптации микроорганизмов к действию стрессовых факторов антропогенного происхождения, а также в понимание механизмов действия биологических препаратов на циркуляцию крови в капиллярах макроорганизма. Выявлены параметры светодиодного и радиоизлучения, способные привести к увеличению или уменьшению численности Е. coli Са58 и S. aureus 209Р. Результаты исследований могут быть использованы в практике биомедицинских исследований действия разных видов излучений, а также в клинической практике с целью выбора оптимальных режимов излучения при фото динамической и микроволновой терапии при лечении и профилактике гнойно-воспалительных заболеваний. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по общей микробиологии и экологии микроорганизмов, написании курсовых и дипломных работ в Саратовском государственном университете имени Н.Г Чернышевского и Саратовском государственном техническом университете. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Популяционная численность, морфологические и физиологические характеристики бактерий Е. сої і Са58 претерпевают дозозависимые изменения под действием светодиодного красного (660 нм) излучения на сенсибилизированную метиленовым синим культуру, и светодиодного синего (467 нм) излучения - на несенсибилизированную культуру. 2. Популяционная численность Е. соН Са58 и S. aureus 209Р изменяется под действием низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения различной поляризации и мощности. 3. Аппликация бактериальных взвесей Е. соН, подвергнутых фото ди намическому воздействию, и токсинсодержащего материала Е. coli приводит к изменениям скорости микроциркуляции крови в капиллярах брыжейки бе лых крыс, регистрируемых методом спекл-микроскопии. Работа выполнена в рамках НИР СГТУ «Разработка методических подходов к комплексной оценке состояния живых организмов при действии различных экологических факторов», частично поддержана грантом № 45434 в рамках ведомственной научной программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (СГУ, 2006); а также в рамках НИР Федерального агентства по образованию № 1.4.09. «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и разработка когерентно-оптических и спектральных методов медицинской диагностики и фототерапии» (СГУ, 2009).
Фотосенсибилизаторы и фотодинамическое действие излучений на микроорганизмы
Относительно механизмов действия длинноволновых излучений на биологические объекты существует три группы гипотез: биофизическая, биохимическая и биомеханическая (Позмогова, 1991).
Биофизическая гипотеза связывает влияние ДИ с взаимодействием электромагнитных волн с электрическими полями клеток, фотоэффект обуславливается первичным поглощением квантов излучения молекулой-акцептором и переходом её в возбуждённое состояние. При этом возникает разность потенциалов между участками облучаемого объекта, а возникающая электродвижущая сила активизирует физиологические процессы.
Биохимическая гипотеза акцентирует внимание в первую очередь на фотоакцепции квантов ДИ ферментами, либо веществами, имеющими в составе ионы металлов. Возможным механизмом действия считается активация дыхательной цепи, что в конечном итоге отражается на клеточном метаболизме, изменяет трансмембранный потенциал и обусловливает повышение антиоксидантной активности организма.
Биомеханическая гипотеза не исключает и конформационных преобразований макромолекул мембран. В результате их структурно-функциональных перестроек создаётся физико-химическая основа для формирования неспецифических адаптационных реакций клеток, что стимулирует биоэнергетические и биосинтетические процессы в организме. В целом, воздействие ДИ на клеточную мембрану выступает как пусковой фактор каскада молекулярных и морфологических процессов.
Сложные внутриклеточные преобразования невозможны без участия генетического аппарата клетки. В настоящее время доказано, что ДИ влияет на генетический аппарат клетки без грубых структурных нарушений.
Влияние УФ, так же, как и ВИ, может быть опосредовано фотосенсибилизатором - веществом, способным трансформировать световую энергию в энергию физико-химических и химических реакций. Способность поглощать свет обусловлена наличием в их молекулах хромофорных группировок, содержащих обычно циклические ядра. Известно более 400 веществ, обладающих свойствами фотосенсибилизаторов. В этом качестве могут выступать вещества как экзогенного (хлорин Єб и его производные, метиленовый синий), так и эндогенного (соединения порфиринового ряда) происхождения. Среди природных веществ фотосенсибилизаторами являются хлорофиллы, фикобилины, порфирины и промежуточные продукты их синтеза, ряд антибиотиков, хинин, рибофлавин и др. (Dougherty, 1988; Henderson, Dougherty, 1992; Wainwright, 1998; Demidova, Hamblin, 2004; Hamblin, Hasan, 2004). В настоящее время также проводится направленный поиск искуственных фотосенсибилизаторов среди производных хлоринов, бактериохлоринов, пурпуринов, бензопорфиринов, тексафиринов, этиопурпуринов, нафтало- и фтало-цианинов (Странадко, 2002; Bezman et al., 1978; Demidova, Hamblin, 2004).
Одними из самых распространённых фотосенсибилизаторов являются вещества фенотиазинового ряда. Это такие вещества как бенгальский розовый, индоцианин зеленый, толуидиновый синий, метиленовый синий и различные металлопроизводные (рис. 5). Фенотиазины не обладают токсичностью по отношению к клеткам макроорганизма, но способны активно генерировать синглетный кислород под действием излучения. Вещества имеют широкое медицинское применение и просты в использовании (Bezman et al., 1978; Minnok, Vernon, 1996; Bhatti et al., 1998; Abels et al., 2000).
В присутствии акридина у Е. coli ближний УФ вызывает нарушения как ДНК, так и ЦПМ, в результате чего клетки становятся чувствительными к лизоциму, детергентам, осмотическому шоку (Громов, Павленко, 1989). Изучение воздействия видимого излучения на бактериальные клетки в присутствии хлорина Єб (рис. 6) и его глюкозаминовой соли фотодитазина (Зорина и др., 1988; Фомичев и др., 1991, Страховская и др., 1998, Страховская и др., 2002; Алексеев и др., 2005) выявило деструктивное действие света на гуаниновые и тиминовые основания ДНК, что проявляется в большем угнетении мутантов с повреждениями систем репарации, подавлении биолю-минисценции генноинженерного штамма Е. coli и уменьшении жизнеспособности С. guilliermondii. При этом действие фотодитазина сильнее действия хлорина Єб, а действие эндогенных порфиринов сильнее действия экзогенных. Было показано также, что при больших временных экспозициях облучения процесс фотоповреждения Е. coli и В. subtilis подчиняется экспоненциальному закону. Тем не менее, следует отметить, что хлорин Єб и фотодита-зин локализуются на клеточных мембранах, это подтверждается ослаблением инактивирующего действия света после однократного отмывания клеток путём осаждения и ресуспендирования клеток в свежей минеральной среде (Страховская и др., 2002). Данный факт подтверждает взаимосвязанность потенциальных мишеней фотовоздействия.
Микробиологические методы исследования
Моделирование влияния видимого светодиодного излучения на бактерии. Для проведения экспериментов нами была разработана схема опытной установки для облучения бактериальных взвесей, состоящая из источника постоянного тока, светодиодного излучателя и 18-ти ячеистой кюветы. Установка накрывалась стеклянным конусом-воронкой для создания асептических условий (рис. 9).
Несенсибилизированную или сенсибилизированную МС бактериальную взвесь в объеме 0,2 мл вносили в ячейки кюветы и подвергали действию видимого НСИ, последовательно увеличивая экспозицию с1до4сис10до 100 с в случае синего НСИ, а также с 1 до 14 мин и с 6 до 84 с в случае красного НСИ. Контролем служили взвеси бактерий, не подвергнутые облучению.
Моделирование влияния радиоволн на бактерии. Для проведения экспериментов по воздействию низкоинтенсивного СВЧ-излучения дециметрового диапазона бактериальные взвеси предварительно высевали на МЛА в чашки Петри и затем подвергали облучению. Во всех случаях излучатель аппарата Акватон — 01 помещали на расстоянии 10 см над поверхностью питательной среды и проводили воздействие поляризованным и неполяризованным радиоизлучением на бактерии в течение 10 мин. Учёт результатов проводили через двое суток для Е. coli Са58 и через сутки — для S. aureus 209Р.
В качестве экспериментальных животных использовали 46 беспородных белых крыс двух-, трёхмесячного возраста массой 180 - 200 г, без различия пола. Для наркоза применяли натриевую соль 5-этил-5-(1-метилбутил)-2,4,6-триокси-пиримидина (нембутал) из расчёта 0,5 мг на 1 г массы тела, вводимую внутримышечно. При проведении острых опытов на брыжейке крысы данная доза и способ введения анестетика позволили свести к минимуму изменения микроциркуляции, вызываемые барбитуратами. Эксперимент проводился во время глубокого наркоза, адекватность анестезии оценивалась по частоте дыхания и зрачковому рефлексу (Чернух и др., 1984).
Исследования микроциркуляции крови методом спекл-микроскопии проводили на сосудах брыжейки. Вследствие своего уникального строения брыжейка различных мелких лабораторных животных - крыс, лягушек, мышей - успешно используется в экспериментах для изучения функции микро-циркуляторной системы в условиях in vivo (Гамбарян, Дукельская, 1955; Ай-сон, 1984; Александров, Федоров, 1986, Беднов, 1996; 1997; Борисов и др., 1985; Брилль и др., 1992). Брыжейка представляет собой тонкую прозрачную пленку, состоящую из двухслойной соединительной ткани с одним слоем лимфатических и кровеносных сосудов. Брыжейка разделена на прозрачные «оконца», имеющие наибольшие размеры в области тонкого кишечника, ра-диально идущими в слое жировой клетчатке относительно крупными артериями (400 - 500 мкм) и собирающими венами (600 - 700 мкм). Вдоль некоторых кровеносных сосудов проходят лимфатические сосуды. Отходящие от этого сосудистого пучка мелкие сосуды образуют в прозрачных оконцах хорошо развитое собственно микроциркуляторное русло брыжейки, которое хорошо визуализируется под микроскопом в проходящем свете (Чернух и др., 1984). Брыжейка белой крысы была выбрана вследствие доступности, небольшой стоимости, удобных размеров объекта для микроско-пирования, притом, что структурно-функциональная организация микроцир-куляторного русла близка к таковой у человека (Гамбарян, Дукельская, 1955). Лапаротомию выполняли по средней линии тела на протяжении 1 -1,5 см, после чего животное помещали на специальный термостабилизиро-ванный столик (t = 38 С) и извлекали петлю тонкого кишечника с брыжейкой. Прозрачный участок брыжейки (оконце) со свободными от жировой клетчатки микрососудами осторожно расправляли на прозрачном окне столика для наблюдения микроциркуляции. Брыжейку на протяжении всего эксперимента постоянно смачивали физиологическим раствором Рингера для теплокровных (37С, рН=7,4) во избежание высыхания. Извлеченный участок тонкого кишечника покрывался тонкой марлевой салфеткой, также смоченной теплым физиологическим раствором (рис. 10). Наблюдение и регистрацию параметров микроциркуляции осуществляли через 10-15 минут после вскрытия брюшной полости для уменьшения постоперационных изменений микроциркуляции. Данные подготовительные процедуры позволили выполнить эксперименты с минимальной болью и стрессом для животного.
Принципы спекл-микроскопии. При наблюдении в когерентном свете диффузно отражающего или пропускающего объекта структура регистрируемого излучения будет выглядеть зернистой. Иными словами, при прохождении когерентного луча через неравномерно рассеивающую среду или его отражении от неравномерно рассеивающей поверхности, и последующем проецировании создаётся впечатление, что, вследствие случайной модуляции лазерного излучения, экран покрыт множеством небольших, хаотически расположенных светлых и тёмных пятен - так называемых спеклов (от англ. speckle - пятнышко, крапинка). Физическая природа спеклов очень проста. Они являются результатом интерференции многих световых волн от различных точек объекта (рис. 11). Размеры пятен зависят от длины волны излучения X, расстояния от объекта до плоскости наблюдения z и от диаметра освещенной области D. Поля с подобной структурой называют спекл-полями (Кузьмин, Романов, 1996; Ульянов, 1999).
Следует заметить, что большинство природных сред являются в той или иной степени случайными. Поверхности, как правило, шероховаты, объемные среды содержат случайные вкрапления или являются мутными с точки зрения оптики. Таким образом, спекл-поле несёт информацию о свойствах объекта, на котором рассеялся свет лазера, например, если объектом исследования является шероховатая поверхность, то о параметрах ее неоднородно-стей можно судить по характеристикам образующихся спеклов (Ульянов, 1999; Рябухо, 2001).
На рисунке Па спекл-структура формируется в свободном пространстве и называется объективной спекл-картиной. Такие картины легко наблюдать с использованием лазерного излучения. Субъективные спекл-картины наблюдаются в изображающих оптических системах, что представлено на рисунках 116 и Ив (Джоунс, Уайкс, 1986; Ринкевичюс, 1990; Briers et al., 1999; Briers, 2001).
Изменения морфофизиологических характеристик is. coli Са58 при действии синего и красного низкоинтенсивного светодиодных излучений
Для оценки действия in vivo бактериальных клеток, сенсибилизированных МС и подвергнутых действию красного НСИ, на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс ex tempore использовали метод спекл-микроскопии. В этих опытах исследовали штаммы Е. coli с разными характеристиками: Е. coli В (дикий тип, представитель нормальной микрофлоры кишечника); Е. coli Са58 (лактозопозитивный, продуцент колицина Н, представитель нормальной микрофлоры кишечника); Е. coli К12 (лактозонегатив-ный, продуцент колицина I) и Е. coli Ol - лактозонегативный, зоопатоген-ный. При сенсибилизации бактерий концентрация МС была уменьшена до 0,005% в связи с полученными предварительно данными о фотодинамическом повреждении наблюдаемых сосудов при нанесении бактериальных взвесей, сенсибилизированных МС в концентрации 0,15%, как в предыдущих экспериментах.
Было показано, что изменения гемодинамики в микрососудах брыжейки белых крыс происходили в течение первых секунд после аппликации сенсибилизированных и облучённых бактериальных взвесей штаммов Е. coli В, Е. coli Са58, Е. coli К12, Е. coli 01 (рис. 26) и отличались шириной полосы спектра флуктуации интенсивности сигнала для каждого штамма.
При нанесении взвесей Е. coli Ви. coli Са58, облучённых красным НСИ, отмечалось незначительное увеличение скорости кровотока. Динамика кровотока восстановилась на 15 мин наблюдения в обоих случаях. Более значительное повышение скорости кровотока было вызвано аппликацией на брыжейку взвеси Е. coli К12 после воздействия на неё красного НСИ. Установлено, что через 20 мин после нанесения бактериальной взвеси скорость кровотока стабилизировалась, оставаясь, однако, выше, чем в контроле; а сам кровоток принимал упорядоченный характер без резких колебаний интенсивности (рис.27).
В отличие от этого, аппликация облученной взвеси Е. coli 01 приводила к значительному (более, чем в 3 раза) и продолжительному (свыше 30 мин) замедлению по сравнению с контролем.
Таким образом, было показано, что аппликация взвесей штаммов Е. coli, являющихся типичными представителями микрофлоры кишечника человека и животных, приводит лишь к незначительным изменениям скорости кровотока в капиллярах брыжейки, даже если апплицированные бактерии обладают колициногенной активностью. Параметры микроциркуляции крови в данном случае нормализуются в течение 15 минут. В то же время, при аппликации бактериальной взвеси штамма Е. coli К12, продуцирующего коли-цин I, но не входящего в состав нормальной микрофлоры, приводит к небольшому, но устойчивому ускорению кровотока, не возвращавшемуся к норме за время наблюдения.
Кроме того, было установлено, что аппликация взвеси зоопатогенного штамма Е. coli Ol приводит к резкому замедлению кровотока, причём параметры движения крови значительно отличались от контрольных на всём протяжении эксперимента; а также характеризовались относительной нестабаль-ностью, что выражалось в резком (в 1,5 раза) ускорении кровотока на 25 - 30 мин наблюдения.
Затем исследовали в аналогичных условиях in vivo ex tempore действие супернатантов культур Е. coli А5 и Е. coli В6, продуцирующих экзо- и эндотоксин соответственно (Волкова, 2006) на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс. Показано, что аппликация экзотоксинсодержащего супер-натанта приводила к значительному ускорению микроциркуляции крови в капиллярах, отмечено достоверное динамическое увеличение ширины полосы спектра (ШПС) флуктуации интенсивности сигнала со среднего значения 75,97 Гц в контроле до среднего значения 135,87 Гц на 5 мин наблюдения (рис. 28а). При нанесении эндотоксинсодержащего материала изменения скорости кровотока были менее выражены, наблюдались колебания значения ШПС относительно контроля (рис. 286).
Поскольку желудочно-кишечный тракт и брыжейка отличаются, наряду с общими миопаралитическими эффектами, собственной своеобразной гуморальной регуляцией гастроинтестинальными гормонами (Зайчик, Чури-лов, 1999), подобные местные реакции микрогемоциркуляции на воздействие бактериальных взвесей и токсинсодержащего материала можно рассматривать со стороны микроорганизма как приспособительную реакцию, повышающую шанс успешной колонизации; а со стороны макроорганизма — как защитный механизм, регулирующий дальнейшее распространение биологически активных агентов. В таком случае воздействие бактериальных взвесей вызывает ответ, который на тканевом уровне обуславливается реакциями межклеточного вещества и координированными взаимодействиями различных групп клеток, а на органном - прежде всего связан с реакциями стромы, в т.ч. и с кровеносными сосудами микроциркуляторного русла.
