Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 13
1.1. Бактериальные возбудители хронических инфекционных заболеваний 14
1.1.2. Основные возбудители раневых инфекций Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus 14
1.1.3. Chlamydia trachomatis - внутриклеточный паразит, вызывающий хронические инфекционные болезни 21
1.2. Физико-химические методы воздействия, применяющиеся в медицине 24
1.3. Низкотемпературная плазма и ее использование в медицине 26
1.3.1. Воздействие низкотемпературной плазмы и её компонентов на биологические объекты 29
1.3.2. Плазменные источники для медицинского применения 37
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования 40
2.2. Условия выращивания и методы учета бактериальных биопленок 43
2.3. Условия выращивания и методы учета внутриклеточных бактерий 44
2.4. Культивирование инфузорий и условия их обработки НТП 45
2.5. Условия выращивания эукариотических клеток 47
2.6. Источники НТП, использованные в работе 47
2.6.1. СВЧ-генератор аргоновой плазмы 47
2.6.2. Сегнетоэлектрический реактор воздушной плазмы атмосферного давления 50
2.6.3. Коронный разряд в воздухе атмосферного давления 52
2.7. Условия обработки НТП биологических объектов 54
2.7.1. Условия инактивации индивидуальных микроорганизмов 54
2.7.2. Условия инактивации НТП биопленок 55
2.8. Моделирование раневой инфекции и условия обработки НТП раневых поверхностей 56
2.9. Способы изучения эффекта отдельных компонентов НТП, участвующих в инактивации микроорганизмов 58
2.9.1. СВЧ-источник аргоновой плазмы 58
2.9.2. Коронный разряд 60
2.10. Статистические методы 61
Глава 3. Результаты 63
3.1. Определение бактерицидной активности НТП in vitro 63
3.1.1. Изучение индивидуальной чувствительности патогенных бактерий к НТП 63
3.1.2. Изучение эффекта НТП на бактерии в биопленках 72
3.1.3. Оценка активности НТП в отношении внутриклеточных паразитов на примере С. trachomatis 77
3.1.4. Изучение токсического действия аргоновой плазмы на эукариотические клетки 81
3.1.5. Эффект НТП на внутриклеточный статус эукариотических клеток 84
3.2. Изучение бактерицидного и ранозаживляющего эффекта различных источников низкотемпературной плазмы in vivo 87
3.3. Изучение вклада различных компонентов плазмы в бактерицидный эффект 93
3.3.1. Определение вклада ультрафиолетового облучения в общий бактерицидный эффект аргоновой плазмы 93
3.3.2. Определение чувствительности патогенных бактерий к воздействию различных компонентов плазмы положительного и отрицательного коронного разряда в воздухе 95
3.3.3. Сравнение воздействия положительного и отрицательного коронного разряда на грамположительные и грамотрицательные бактерии 101
Глава 4. Обсуждение 104
4.1. Нетермические антимикробные эффекты НТП в отношении патогенных бактерий в условиях in vitro 104
4.2. Воздействие НТП на эукариотические клетки и бактерицидный эффект НТП в отношении внутриклеточных бактерий 107
4.3. Применение НТП в терапии инфицированных ран 109
4.4. Вклад различных компонентов плазмы в бактерицидный эффект 111
Выводы 115
Список литературы 116
- Основные возбудители раневых инфекций Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus
- Изучение индивидуальной чувствительности патогенных бактерий к НТП
- Определение чувствительности патогенных бактерий к воздействию различных компонентов плазмы положительного и отрицательного коронного разряда в воздухе
- Вклад различных компонентов плазмы в бактерицидный эффект
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Инфекционные заболевания продолжают играть важнейшую роль в структуре патологических состояний здоровья человека, хотя в инфекционной заболеваемости в последние годы наблюдается сдвиг в сторону увеличения доли хронических инфекционных процессов. С одной стороны, это связано со старением популяции, особенно в развитых странах, высокой распространенностью иммунодефицитов различной этиологии, стертым течением ряда заболеваний и отсутствием своевременного адекватного лечения (Руководство по медицинской микробиологии. Под ред. Лабинской А.С., 2013). С другой стороны, за десятилетия использования антибиотиков многие микроорганизмы приобрели устойчивость к этим препаратам, а способность бактерий образовывать биопленки, в том числе на раневых поверхностях и изделиях медицинского назначения, в которых они намного устойчивее к любым воздействиям, еще более усложняет задачу по их уничтожению (Романова Ю.М. и др., 2011, Пушкарева В.И. и др., 2011). В связи с этим остается актуальным поиск новых методов, обладающих бактерицидным эффектом (Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., 2005).
Физико-химические методы воздействия давно и успешно применяются в медицине. Хорошо известные кварцевые лампы, испускающие ультрафиолетовый свет, используются для стерилизации помещений и обработки органов ротоглотки, являются весьма эффективными, однако чрезмерные дозы ультрафиолета опасны для человека, т.к. увеличивают вероятность развития злокачественных опухолей (информационный бюллетень ВОЗ, 2009). Другим широко применяемым методом является использование озона, обладающего высокой бактерицидной активностью, однако в высоких концентрациях озон токсичен для человека. Использование электромагнитных полей стимулирует заживление, снимает воспаление (Kubasova T. et al., 1995), однако антибактериальным действием не обладает. Таким образом, используемые методы физико-химического воздействия, обладающие микробицидным эффектом, в высоких дозах токсичны для человека, а неопасные иммуностимулирующие физические методы не обладают антибактериальной активностью (Улащик В.С., 2006).
Одним из сравнительно новых физико-химических методов, объединяющим в себе одновременно и действие УФ, и обработку поверхностей озоном и оксидом азота, и воздействие электромагнитым полем, является неравновесная низкотемпературная плазма (НТП) (Akyshev Y. et al., 2008, Laroussi M. et al., 2012). При этом НТП лишена основного недостатка других методов физического воздействия – высоких концентраций токсических компонентов.
НТП - это поток газа, ионизированного с помощью электромагнитного излучения при атмосферном давлении и температуре окружающей среды. Основной вклад в бактерицидную активность НТП вносят ионы, свободные радикалы и возбужденные молекулы, а также ультрафиолет (Morfill G. et al., 2009). Применение холодной плазмы в медицине связано с ее нетермическими эффектами, изучение которых в приложении к медицинским мишеням насчитывает порядка десяти лет. До настоящего времени являются предметом изучения эффекты НТП на различные биологические мишени, а также значение компонентов НТП и синергизма между ними в этих эффектах. До конца неясны сферы применимости НТП. Так, был показан микробицидный эффект НТП на ряде условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (Lee et al., 2006; Venencia et al., 2009), однако до начала наших исследований задачи сравнения чувствительности к НТП разных штаммов одного вида микроорганизмов не ставилось. Первая работа, продемонстрировавшая чувствительность к НТП бактерий в составе биопленок, была опубликована в 2009 г. (Joshi et al., 2009), однако детали процесса уничтожения бактерий в биопленках не были изучены. Низкие концентрации токсических компонентов (УФ, озона и свободных радикалов) позволяют предположить возможность применения НТП для непосредственной деконтаминации биологических объектов, в том числе кожных покровов и ран (Isbary et al., 2010), однако информации, дающей возможность оценить безопасность воздействия НТП в отношении эукариотических клеток и макроорганизма в целом, было недостаточно.
Для получения более полной картины воздействия НТП на биологические объекты было необходимо провести комплексные исследования, сравнивающие эффекты различных источников на одни и те же модели, поскольку НТП, генерируемая разными источниками, сильно отличается по своим характеристикам. В целом, можно выделить два типа источников НТП: прямого и непрямого действия, отличающихся по наличию/отсутствию УФ, концентрации незаряженных активных частиц, концентрации заряженных атомов и ионов, воздействию электромагнитными полями (Friedman et al., 2009). Биологические эффекты для источников прямого и непрямого действия значительно разнятся, однако механизмы, лежащие в основе такой разницы, до конца не поняты.
В связи с вышеизложенным, в данной работе была поставлена следующая цель: оценить бактерицидные свойства низкотемпературной плазмы прямого и непрямого действия в условиях in vitro, а также на моделях бактериальных биопленок и инфицированных ран.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
определить в условиях in vitro бактерицидную активность низкотемпературной плазмы (НТП) прямого и непрямого действия в отношении спектра патогенных микроорганизмов, вызывающих хронические инфекционные заболевания;
определить бактерицидный эффект НТП на бактерии, находящиеся в биопленках;
определить возможность использования НТП для воздействия на внутриклеточных инфекционных агентов на модели Chlamydia trachomatis;
оценить токсичность плазменного воздействия на эукариотические клетки, а также оценить изменения в физиологии эукариотических клеток;
в эксперименте на лабораторных животных определить эффективность применения НТП как средства терапевтического воздействия на инфицированные раны;
установить вклад отдельных компонентов плазмы и их комбинаций в бактерицидный эффект.
Научная новизна:
В представленной работе впервые:
Установлены различия в чувствительности к низкотемпературной плазме для микроорганизмов, относящихся к разным систематическим группам, и выявлены различия в чувствительности к НТП между различными штаммами, принадлежащими к одному виду;
Показано, что бактерицидный эффект НТП на бактерий, находящихся в составе биопленок, зависит от толщины биопленки и уменьшается по мере глубины залегания бактерий;
Установлено, что НТП обладает бактерицидным действием в отношении внутриклеточного паразита С. trachomatis на разных этапах его жизненного цикла, воздействуя как на метаболически неактивные элементарные тельца, так и делящиеся ретикулярные тельца внутри хламидийных включений, при этом НТП не оказывает выраженного токсического эффекта на эукариотические клетки-хозяева;
Показано на модели инфицированных ран лабораторных мышей, что однократная обработка низкотемпературной плазмой снижает обсемененность раневых поверхностей в 10-100 раз, а курс из 2-3 обработок ускоряет заживление ран;
Разделены компоненты плазменного факела и экспериментально доказан синергизм их действия.
Практическое значение работы:
На основании полученных в ходе выполнения диссертационной работы результатов написаны и одобрены на Совете по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» методические рекомендации:
1 - «Оценка физических воздействий (электромагнитного излучения, низкотемпературной плазмы) на жизнеспособность внутриклеточных паразитов и клетки-хозяина» (протокол №15 от 14 июля 2011г).
2 – «Применение неизотермической «холодной» плазмы атмосферного давления в отношении патогенных бактерий» (протокол №17 от 27 октября 2011г).
Доработана программа тематического цикла усовершенствования врачей "Молекулярно-генетические методы в диагностике инфекционных заболеваний" путем включения пяти дополнительных лекций по темам: глобальные сигнальные и метаболические пути, активизирующиеся в процессе хронической инфекции: новые находки и принципы контроля; новые подходы к элиминации биопленок: новые физические и химические методы и их сочетание; контролируемые свободно-радикальные механизмы и их применение для деконтаминации биологических тканей; принципы воздействия низкотемпературной газовой плазмы на биологические структуры; использование физических подходов в терапии инфекционных заболеваний и контроле распространения инфекционных агентов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Низкотемпературная плазма обладает неспецифическим бактерицидным действием в отношении патогенных бактерий, в том числе, в отношении бактерий, входящих в состав биопленок.
2. Воздействие низкотемпературной плазмы на внеклеточные и внутриклеточные формы C. trachomatis нарушает способность облигатного паразита инфицировать эукариотические клетки и прерывает нормальное течение цикла внутриклеточного размножения.
3. Низкотемпературная плазма не вызывает некроза эукариотических клеток in vitro
4. Низкотемпературная плазма позволяет деконтаминировать раневые поверхности и ускоряет заживление ран на модели инфицированных ран лабораторных мышей.
5. Бактерицидный эффект плазмы обусловлен синергизмом действия её компонентов (УФ, заряженных и нейтральных частиц, электрических полей).
Апробация работы:
Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на международных конференциях: 3d International Conference for Plasma Medicine (ICPM-3, Грайсвальд, Германия, 2010), NATO Science Advanced Research Workshop on Plasma for Bio-Decontamination, Medicine and Food security (Ясно, Словакия, 2011), 39th International Conference on Plasma Science (Эдинбург, Великобритания, 2012), 1st and 2nd Young Professional Workshops on Plasma Medicine (Германия, 2012, 2013), Plasma Medicine Workshop (Ринберг, Германия, 2010,2011, 2012).
Апробация работы состоялась 17.10.2013 на научной конференции отдела природноочаговых инфекций и отдела медицинской микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России.
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 4 статьи, 2 из них в зарубежных изданиях, рекомендованных ВАК, а также 4 тезисов. Результаты использовались для написания главы в книге Plasma Decontamination, Medicine and Food Security (Springer, 2012).
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, главу результатов исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы, включающий 22 работы отечественных и 76 зарубежных авторов. Работа содержит 30 рисунков и 6 таблиц.
Бактериальные штаммы и культуры клеток. Объектами исследований служили штаммы бактериальных культур из коллекции лаборатории молекулярных основ эпидемиологии госпитальных инфекций ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ: Pseudomonas aeruginosa Pa103, Pa12, Pa14, Staphylococcus aureus ATCC Sa 6538 P, Sa78, Sa85, Burkholderia cenocepacia BC46, Staphylococcus epidermidis SE14990, Streptococcus pyogenes Str861, Enterococcus faescium Ef42 и лаборатории экологии возбудителей инфекций: Escherichia coli JM109, Listeria monocytogenes EGD.
Бактерии рутинно культивировали на чашках с кровяным агаром при 28С (P.aeruginosa, B.cenocepacia) или 37С (другие виды). Для получения ночной культуры все микроорганизмы, кроме Escherichia coli JM109, культивировали в жидкой питательной среде BHI (Brain Heart Infusion, Difco). Для выращивания E.coli использовали LB (Luria – Bertani Broth, Miller).
Биопленки, сформированные грамотрицательными бактериями B.cenocepacia штамм Вс46 или P.aeruginosa штамм РА 103, выращивали на поверхности стекла, вертикально опущенного в кюветы с питательной средой LB(Luria – Bertani Broth, Miller) при 28С в течение 72 часов без шутелирования (Каменская А.А., автореф.дис., 2005)
Для качественной оценки биопленки окрашивали с использованием тест-системы Live/Dead (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Цифровые изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss Axiovert 200M LSM 510 META), как описано ранее (Kaminskaya et al., 2007).
Эукариотические клетки линий McCoy и HCT-116 выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FCS HiClone, 2 мМ глютамина, 4,0 мг / мл гентамицина и 5,0 мг / мл амфотерицина в 5% СО2 атмосфере.
Источники низкотемпературной плазмы. В работе использовали 3 различных источника низкотемпературной плазмы, предоставленные разработчиками. В том числе, были использованы два источника плазмы непрямого воздействия: СВЧ-генератор Microplaster (Adteko Inc, Япония), сегнетоэлектрический реактор (ОИВТ РАН), и источник плазмы прямого действия - коронный разряд (ГНЦ РФ ТРИНИТИ). Их характеристики приведены в Табл.1.
Табл. 1. Характеристики источников НТП
Условия выращивания и методы учета внутриклеточных бактерий. C. trachomatis выращивали в клетках линии McCoy по стандартной методике: 70-80 % монослой, выращеный на покровных стеклах в 24-луночных планшетах, заражали хламидийными ЭТ с множественностью заражения 2:1 и культивировали при 37С в течение 48 ч.
Для визуализации внутриклеточной хламидийной инфекции клетки фиксировали и окрашивали моноклональными антителами, коньюгированными с FITC. Клетки, содержащие флуоресцирующие включения, визуализировались с помощью флуоресцентного микроскопа.
Культивирование инфузорий и условия их обработки плазмой. Аксеническую культуру свободноживущих инфузорий Tetrahymena pyriformis штамм GL (коллекция ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи») в концентрации 103 особей/мл облучали аргоновой плазмой в течение 2 и 5 мин. Подсчет клеток производили по общепринятой методике в камере Горяева, для изучения морфологии использовали флуоресцентную и микроскопию и фазовый контраст.
Условия воздействия НТП на микроорганизмы in vitro. Для бактерицидной обработки серийные разведения ночной культуры бактерий в концентрациях 103, 104, 105 КОЕ/мл высевали в объеме 30 мкл на чашки Петри диаметром 36 мм с твердой питательной средой ГРМ-1 (Оболенск) и облучали в течение 10-600с. Расстояние от поверхности плазменной горелки до образца составляло 20мм в случае использования СВЧ-генератора, 5мм для сегнетоэлектрического источника и 15мм для коронного разряда
Для оценки бактерицидного эффекта НТП на внеклеточные неактивные формы хламидий суспензию ЭТ, расположенную слоем 1 мм на поверхности пластиковой чашки, обрабатывали плазмой СВЧ-генератора, как указано выше. Обработанные ЭТ использовали для инфекции свежих клеток McCoy. В качестве контроля использовали модель хламидийной инфекции с необработанными ЭТ.
Условия воздействия НТП на биопленки. Стекла со сформированными на них биопленками помещали на агар и подвергали воздействию аргоновой плазмы в течение 2 или 5 мин, после чего инкубировали при комнатной температуре 2 ч в стерильном PBS и окрашивали витальным красителем Life/Dead по инструкции производителя.
Для количественной оценки бактерицидного эффекта сформированные на стекле биопленки соскребали стерильным скальпелем, помещали в PBS и частично разрушали пипетированием. Суспензию наносили на поверхность стерильной чашки Петри слоем в 1 мм и подвергали воздействию плазмой в течение 5 мин, , затем дисперсировали интенсивным перемешиванием в ультразвуковом измельчителе, серийные десятикратные разведения высевали на кровяной агар. Разрушение биопленок контролировалось методом визуализации бактерий с помощью окрашивания по Граму.
Условия воздействия НТП на эукариотические клетки, в том числе инфицированные
Монослой клеток, покрытый слоем среды около 1 мм, обрабатывали НТП, производимой СВЧ-генератором, после чего среду заменяли на свежую в стандартном объеме. Количество жизнеспособных клеток определяли через 24 часа окрашиванием метиленовым синим. Для оценки эффекта плазмы на внутриклеточных хламидий инфицированные клетки обрабатывали НТП, производимой СВЧ-источником, через 24 часа после инфекции, клетки инкубировали при 37С в течение 24 ч, затем визуализировали бактерий с помощью флуоресцентной микроскопии.
Моделирование раневой инфекции и условия обработки НТП раневых поверхностей. Использовали модель раневой инфекции мышей линии BALB/c. За 3 и 1 день до нанесения ран животным вводили циклофосфамид внутрибрюшинно для развития Т- и В-клеточной иммуносупрессии. Раны инфицировали S.aureus 78 в концентрации 108 КОЕ/рану. Через 72ч раны обрабатывали разными типами плазмы (аргоновой и воздушной), а также их комбинацией. До и после обработки с поверхности ран делали смывы стерильным ватным тампоном. Серийные разведения рассевали на чашки с селективной питательной средой. Для оценки бактерицидного эффекта НТП и скорости заживления ран были использованы мыши линии BALB/c (самки, 16-18 граммов).
Для оценки заживляющего эффекта в группах проводили измерение площади раневой поверхности на 1,2,3,4,5,6,7,8,12 и 14 день начала эксперимента. Для этого делали фотоснимки ран в едином разрешении и с единым фокусным расстоянием над объектом. По полученным фотографиям был произведен подсчет площади раневой поверхности.
Животные были разделены на 4 группы по 10 штук в каждой. Первая группа была контрольной. Во второй группе животные подвергались 10-минутной обработке сегнетоэлектрическим генератором, расстояние до поверхности раны составляло 5 мм. Животных в третьей группе помещали под плазменный факел СВЧ-генератора на расстояние 2см, время экспозиции составляло 5 мин. В четвертой группе проводили комбинированную обработку раневой поверхности: вначале с использованием СВЧ-генератора в течение 5 мин, затем сегнетоэлектрического реактора в течение 10 мин. Сеансы обработки проводили в течение 7 дней ежедневно.
Способы изучения эффекта отдельных компонентов НТП, участвующих в инактивации микроорганизмов.
СВЧ-источник аргоновой плазмы. Для оценки вклада УФ образец накрывали стеклом из фтористого магния (MgF2), пропускающего свет с длиной волны от 160 нм до 3 мкм, в том числе УФ-А, УФ-В и УФ-С. Таким образом обеспечивалось ультрафиолетовое облучение образца и отсекался поток заряженных частиц, входящих в состав плазменного факела. Контролем служили образцы, обработанные аргоновой плазмой и не подвергнувшиеся ее воздействию.
Для оценки вклада заряженных и метастабильных частиц аргона в общий бактерицидный эффект НТП использовали специальную насадку, позволяющую предотвратить попадание воздушной смеси в поток плазменного факела и на поверхность образца. Таким образом, как минимум, частично, исключалось образование NO и озона, образующихся при смешивании потока плазмы с окружающим воздухом.
Коронный разряд. Экспериментальная установка была сконструирована таким образом, что заряженные частицы действовали только на область поверхности агара, расположенную над электродом. Таким образом, область над электродом подвергалась воздействию заряженных частиц и электрического поля (Е), а также незаряженных частиц (R) и УФ (UV), в то время как область вне электрода подвергалась воздействию только незаряженных частиц (R) и УФ (UV). Инактивация микроорганизмов проводилась в положительной и отрицательной короне в воздухе атмосферного давления в двух режимах. В первом из них камера изолировалась от окружающего воздуха. В этом случае незаряженные активные агенты (радикалы, атомы, метастабильные молекулы, и др.), создаваемые короной, распространялись по всей камере и равномерно обрабатывали всю поверхность агара. Бактерии, расположенные над электродом, подвергались воздействию заряженных частиц и электрического поля, а также незаряженных частиц и УФ (E+R+UV), в то время как бактерии на агаре вне электрода подвергались воздействию только незаряженных частиц и УФ (R+UV). Во втором режиме камера непрерывно продувалась окружающим воздухом, всасываемым через отверстия в боковой стенке. В этом случае все нейтральные активные агенты выносились из камеры и бактерии на агаре обрабатывались только заряженными частицами, электрическим полем и УФ излучением. В этом случае бактерии, расположенные над электродом, подвергались воздействию заряженных частиц и электрического поля, а также УФ (E+UV), в то время как бактерии на агаре вне электрода подвергались воздействию только УФ (UV). Таким образом, выбранная совмещенная конструкция электрод + агар в сочетании с системой продувки камеры позволяла реализовывать на разных участках агара разные комбинации агентов инактивации: UV, UV+Е, UV+R, R, UV+Е+R, что дает возможность оценить вклад разных компонентов в бактерицидный эффект и установить наличие синергизма.
Статистические методы
Все in vitro эксперименты проводили в дубликате и повторяли не менее 3х раз. Средние значения и стандартные ошибки подсчитывались в программе Excel, входящей в программное обеспечение Microsoft Office 2007. Для оценки статистической значимости использовали Ttest, включенный в то же программное обеспечение.
Основные возбудители раневых инфекций Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus
Род Pseudomonas объединяет около 200 видов, все представители -прямые или изогнутые грамотрицательные палочки, средние размеры которых колеблются в пределах 0,5-1,0 х 1,5-5,0мкм. (Kiska D.L., 2003). Аэробы, подвижны, спор не образуют. Клинические изоляты являются оксидазоположительными (за исключением P.luteola, P.oryzihabitans) и каталазоположительными, а также растут на агаре МакКонки как лактозонегативные колонии. Большинство видов разлагают глюкозу окислением и переводят нитраты в нитриты или в нитрогенный газ. Отдельные виды имеют характерную морфологию колоний или пигментацию. Что касается источников питания, то псевдомонады -универсалы, различные виды псевдомонад способны утилизировать различные простые и сложные карбонгидраты, спирты и аминокислоты, как источники углерода. Определённые виды могут делиться при 4С, но большинство являются мезофильными с оптимальной температурой выращивания между 30 -37 С.
Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) - основной возбудитель инфекционных поражений человека, вызываемых псевдомонадами. Распространена повсеместно, в воде может выживать до года при температуре 37С. Иногда входит в состав нормальной микрофлоры человека. Риск развития инфекции, вызванной синегнойной палочкой, существенно возрастает у больных с нарушениями барьерных систем и факторов резистентности. Инфицирование P.aeruginosa вызывает до 15-20% всех внутрибольничных инфекций, считается причиной 20-25% гнойных хирургических инфекций и первичных грамотрицательных бактериемии. Часто синегнойную инфекцию наблюдают у больных с ожогами, заболеваниями мочевого пузыря, особенно у пациентов, длительно получающих антибиотики, что обусловлено выраженной устойчивостью возбудителя.
Патогенное действие Р .aeruginosa обусловлено образованием веществ, проявляющих свойства экзотоксинов, и высвобождением эндотоксинов при гибели и распаде бактериальных клеток.
К эпителию слизистых P. aeruginosa прикрепляется благодаря фимбриям и полисахариду альгинату, из которого состоит слизистая капсулоподобная оболочка бактерий. Рецепторы к этим адгезинам найдены, в частности, на эпителиальных клетках трахеи и на муцине, секретируемом трахеей и бронхами. Поверхностные компоненты синегнойной палочки, в том числе альгинат и липополисахарид, защищают бактерию от опосредованного антителами и комплементом лизиса, опсонизации и фагоцитоза (Breidenstein, Е.В. et al., 2011)
P. aeruginosa выделяет во внешнюю среду ряд ферментов, в том числе щелочную протеазу, эластазу, фосфолипазу, цитотоксин, экзотоксин А и экзотоксин S. Эти ферменты разрушают ткани макроорганизма и создают условия, способствующие дальнейшему размножению бактерий и их внедрению. На фоне ослабленного иммунитета, особенно при глубокой нейтропении, высок риск проникновения микроорганизма в кровоток и его гематогенной диссеминации.
Большинство выделенных у больных штаммов P. aeruginosa вырабатывают экзотоксин А, подобный дифтерийному токсину. Он подавляет синтез белка в клетках млекопитающих, катализируя перенос АДФ-рибозильной группы с НАД на фактор элонгации 2 . В результате происходит инактивация фактора элонгации 2, без которого невозможно наращивание полипептидной цепи. Экзотоксин А обладает как местным, так и системным действием. In vitro он проявляет цитотоксическое действие, in vivo - некротизирующее (Wolf, P. et al., 2009).
Основными антигенами P. aeruginosa являются соматический антиген, О-Аг, и жгутиковый антиген, Н-Аг (Lavoie, E.G. et al., 2011). О-антигенный комплекс синегнойной палочки — сложный макромолекулярный агрегат ЛПС и белков. На основе структуры О-Аг проводят серологическое типирование. Белковый компонент О-Аг — антигенный комплекс, общий для псевдомонад, то есть родовой О-Аг. По структуре О-Аг выделяют более 20 серогрупп. Н-антигенный комплекс P. aeruginosa представлен термолабильными белками низкой специфичности, обусловленной различиями в строении флагеллинов. Выявлено 15 различных типов Н-Аг. Н-Аг обнаруживают лишь у жизнеспособных, подвижных бактерий, не подвергшихся какому-либо воздействию дезинфицирующих или антимикробных средств (Lavoie E.G. et al., 2011).
Указанные факторы патогенности могут оказывать влияние на состояние естественной резистентности макроорганизма, в частности, О-антиген, по-видимому, обладает антифагоцитарным ээфектом, липид А проявляет свойства эндотоксина, проеазы подавляют комплемент-зависимые механизмы защиты, а экзотоксин А токсичен для макрофагов.
Клетки P.aeruginosa содержат большое количество плазмид, ряд которых обуславливает широкую антибиотикорезистентность и устойчивость к химическим веществам. Это и образование протеаз, вызывающих изъязвление тканей, способствующих нарушению микроциркуляторного русла, а также способность формировать биопленки, особенно на изделиях медицинского назначения (катетерах, имплантах) (Amnions, М.С. et al., 2009) делают синегнойную палочку опасным патогеном, вызывающим внутрибольничные пневмонии, эндокардиты, поражения урогенитальной системы, пиодермии, ожоговые инфекции с высоким уровнем летальности.
Другим важнейшим возбудителем инфекций мягких тканей является Staphylococcus aureus благодаря тому, что его носительство на кожных покровах широко распространено, и при раневых поражениях представители данного вида оказываются одними из первых контаминантов открытых ран (Schierle C.F. et al., 2009).
S. aureus относят к роду Staphylococcus, кроме него туда входит еще 45 видов, в 11 из которых дополнительно выделены 2-4 подвида, большинство которых колонизирует поверхность тела человека (Руководство по медицинской микробиологии. Под ред. Лабинской А.С., 2013). Стафилококки - грамположительные бактерии диаметром 0,5-1,5 мкм, располагающихся в мазках одиночно, парами или гроздьями (Медицинская микробиология. Под ред. Покровского В.И., 1999). Неподвижны, факультативные анаэробы, хемоорганотрофы,
Факторы патогенности S. aureus позволяют ему прикрепляться к поверхностям, нарушать или избегать иммунного ответа и вызывать токсические эффекты. К ним относят:
- адгезины;
- инвазины;
- факторы, позволяющие уклоняться от действия иммунной системы (ингибиции фагоцитоза, увеличивающие выживание внутри фагоцита);
- мембрано-повреждающие токсины, лизирующие мембраны эукариотической клетки;
- токсины (энтеротоксины, эксофолиативные токсины, токсин синдрома токсического шока и т.д.). Многие поверхностные структуры стафилококка обладают антигенной и иммуномодулирующеи активностью. Так, пептидогликан обеспечивает неспецифическую резистентность, активацию комплемента, является пирогенном. Капсула обладает антифагоцитарным и сенсибилизирующим действием, стимулирует появление в сыворотке крови опсонинов и протективных антител. Тейхоевые кислоты являются сильным тимус-независимым антигеном, активируют комплемент, обладают видовой антигенной специфичностью. Белок А имеет свойства преципитиногена, агглютиногенов благодаря неспецифическому взаимодействию с Fc-фрагментом сывороточных иммуноглобулинов и связыванию комплемента (Foumier, В. et al., 2005) Однако патогенез большинства болезней, вызванных S. aureus, — многофакторный, что сильно затрудняет точное определение роли каждого конкретного фактора патогенности.
К наиболее важным свойствам S.aureus принято относить выраженную приобретенную устойчивость к антибиотикам, контролируемую плазмидами (Boucher, Н. et al., 2010), и способность продуцировать биопленку, которая облегчает адгезию и формирование микроколоний микроорганизма на слизистых оболочках и раневой поверхности, тем самым, затрудняя лечение и способствуя формированию хронических форм инфекции (Davis S.C. et al., 2008).
Изучение индивидуальной чувствительности патогенных бактерий к НТП
Для исследований были выбраны патогенные бактерии, относящиеся к числу наиболее частых возбудителей нозокомиальных и раневых инфекции, такие, как P. aeruginosa, S.aureus, S.epidermidis, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Enterococcus faescium (Шагинян И.А. и др., 2005; Scali С. et al., 2013) (табл.2.1).
Для изучения чувствительности индивидуальных бактериальных клеток к воздействию плазмы, бактерии были помещены в стандартные условия - клетки из стационарной культуры были рассеяны по поверхности агара в концентрациях от 10" до 103 КОЕ/чашка.
В качестве контроля бактерии не подвергались воздействию плазмой или обрабатывались потоком неионизированного газа. Чашки с обработанными или контрольными образцами инкубировали, как описано в разделе «Материалы и методы», до формирования колоний. Бактерицидный эффект подсчитывался как процентное отношение колоний бактерий, проросших после обработки, к контрольным образцам, не подвергавшимся воздействию плазмы.
В работе сравнивалась бактерицидная эффективность трех источников, описанных в разделе Материалы и Методы: СВЧ-генератора аргоновой плазмы, сегнетоэлектрического генератора и коронного разряда. Состав плазмы отличался в зависимости от конструкции прибора, что заметно сказывалось на бактерицидной активности (см. ниже). Так, аргоновая плазма СВЧ-генератора включала заряженные частицы (10э- 10 ррт), метастабильые частицы аргона, активные формы кислорода и азота, получаемые в результате столкновения заряженных частиц аргона с молекулами воздуха, а также УФ. В потоке, выходящем из сегнетоэлектрического реактора, не было заряженных частиц, т.к. разряд проходил внутри замкнутого объема, а только активные формы азота и кислорода (при использовании воздуха в качестве плазмообразующего газа) или аргона (при использовании аргона в качестве плазмообразующего газа). УФ не выходил за пределы камеры и его влияние на объекты было минимальным. Коронный разряд включал заряженные частицы в высокой концентрации (10 - 10 ррт), набор которых отличался для положительной и отрицательной короны; активные формы кислорода и азота, концентрация которых различалась для положительной и отрицательной короны; УФ, интенсивность которого отличалась для положительной и отрицательной короны (табл.2.2 в главе «Материалы и методы»)
СВЧ-генератор аргоновой плазмы. Эффективность инактивации изучалась при разном времени экспозиции: от 1 до 10 мин. Все протестированные штаммы грамотрицательных бактерий P.aeruginosa, E.coli и B.cenocepacia обладали сходной чувствительностью к воздействию аргоновой плазмы. Заметный бактерицидный эффект наблюдался после 2-хминутной обработки: не более 1% от начальной концентрации 10э КОЕ были способны формировать колонии (рис.3.1, табл.3.2.). После пятиминутного воздействия плазмой выживших микроорганизмов не было. Чувствительность грамположительных бактерий была штамм-зависимой. Клинический изолят S.aureus GIM78 был столь же чувствителен, как грамотрицательные бактерии: после 5 мин обработки плазмой не отмечалось выживания бактерий в концентрации 10\ Клинический изолят S. pyogenes GIM861 и штамм 6538 S.aureus из типовой коллекции обладали наиболее низкой чувствительностью. После 5-тиминутной обработки выживали 17,5% и 10,0% S. pyogenes GIM861 и S.aureus 6538, соответственно. Около 5% Str .pyogenes формировали колонии и после 10 мин воздействия плазмы. Неионизированный аргон не обладал бактерицидным эффектом (данная работа проводилась совместно с лабораторией молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России)
Сегнетоэлектрический генератор. Чувствительность бактерий in vitro в зависимости от времени воздействия была определена для двух газов: аргона и воздуха. При использовании в качестве плазмообразующего газа аргона бактерицидного эффекта не наблюдалось (данные не приведены). При использовании воздуха в качестве плазмообразующего газа были использовании два режима: режим, при котором воздух прокачивался через газоразрядную камеры со скоростью 7 л/мин и режим, в котором прокачки воздуха через камеру не было, а выходящий поток активных частиц определялся скоростью диффузии.
Наиболее долгоживущими биологически активными частицами, формирующимися в воздухе при плазменном разряде, являются озон и монооксид азота NO. Распределение этих частиц на разных расстояниях от выходного отверстия показало сильную зависимость концентрации частиц от скорости прокачки воздуха. Особенно сильную зависимость демонстрировал монооксид азота NO: в стационарных условиях (без дополнительной прокачки воздуха с помощью насоса) концентрация NO на расстоянии 1 см от выходного отверстия превышала 300 ррм. (рис. 3.2). При скорости прокачки воздуха 10 л/мин концентрация N0 падала ниже предела чувствиетельности прибора. При скорости прокачки 5 л/мин концентрация NO на расстоянии 1 см составляла около 20 ррм. Количество озона в составе воздуха, прошедшего сегнетоэлектрический реактор, напротив, возрастало с увеличением скорости прокачки: на расстоянии 4 см от выходного отверстия количество озона при скорости прокачки 10 л/мин в 3 раза превышало количество озона в стационарной системе. Минимальное расстояние, на котором был определен верхний предел чувствительности прибора к озону 1,2 ррм, - составляло 3 и 4 см, соответственно, для стационарной системы и для системы, в которой воздух прокачивался через реактор со скоростью 10 л/мин (рис. 3.3). Концентрации активных частиц обоих типов падали по мере удаления от выходного отверстия реактора по логарифмическиому закону (рис. 3.2., рис.3.3).
Чувствительность бактерий in vitro в зависимости от времени воздействия была определена для стационарных условий, в которых наблюдалось максимальная концентрация монооксида азота, поскольку концентрация озона для разных условий пропускания воздуха через реактор изменялась не так значительно (ср. рис.3.2. и рис.3.3). Максимальный бактерицидный эффект при обработке бактерий воздушной плазмой был достигнут после 5 мин воздействия, а увеличение длительности экспозиции до 10 и 20 мин не усиливало антибактериального действия (рис. 3.4) Падение бактериальной обсемененности составило от 24 до 813 раз, при этом чувствительность не зависела от грам-принадлежности бактерий (табл.3.2). Скорее, она носила штаммоспецифический характер. Максимальную чувствительность к продуктам плазменного разряда продемонстрировал бактерии Е. coli штамма JM109, в геноме которого есть мутация recAl, уменьшающая способность бактерий к общей рекомбинации.
Определение чувствительности патогенных бактерий к воздействию различных компонентов плазмы положительного и отрицательного коронного разряда в воздухе
В отличие от предыдущих источников, в которых фактически использовались продукты плазмохимических реакций (сегнетоэлектрический реактор) или сильно разреженная плазма (СВЧ-плазменный генератор), коронный разряд представляет собой источник «прямой» плазмы. При использовании этого метода разряд протекает через газовую среду, в результате чего газ ионизируется (формируется плазма), а образец находится между электродами, т.е. на пути разряда и в плазменной среде. Эксперименты по инактивации P.aeruginosa 103 и S. aureus78 коронным разрядом проводились при одинаковых токах отрицательной и положительной короны (250 мкА), обеспечивающих одинаковую мощность разрядов (около 4 Вт), на расстоянии 15мм. Для получения достоверных результатов обрабатывалось по 18 образцов для каждой точки.
Нами была использована специальная конструкция источника коронного разряда, разработанная сотрудниками ТРИНИТИ (г. Троицк), которая позволяла разделять активные компоненты плазменного факела (см. Материалы и методы).
Полученные результаты по раздельному и совместному влиянию различных активных агентов коронных разрядов на выживаемость клеток P.aeruginosa 103 к S.aureus 78 представлены в табл. 3.4 и на рис.3.21 и 3.22 . Полученные результаты являются достоверными, р 0,05.
E+R+UV - комплексное действие заряженных частиц, нейтральных активных частиц и УФ, E+UV - действие заряженных частиц и УФ, R+UV - действие нейтральных активных частиц и УФ, UV - действие УФ, R - действие нейтральных частиц.
Как видно из результатов, представленных на рис. 3.21, положительный коронный разряд обладал большим бактерицидным эффектом в отношении грамотрицательной P.aeruginosa, чем отрицательный коронный разряд. Уже после 10с обработки наблюдалось снижение бактериальной обсеменности на 4 порядка (2,3±0,4)х10"4), а элиминация на 5 порядков (1,1±0,3)х10"5) достигалась при экспозиции 30с. Для достижения такого же бактерицидного эффекта с использованием отрицательного коронного разряда требовалось 120с.
Комбинация активных нейтральных частиц и УФ для положительного коронного разряда обладала сходным бактерицидным эффектом, как и комплекс всех компонентов плазменного факела (рис. 3.21, А) Полная элиминация P.aeruginosa 103 в концентрации 106КОЕ наблюдалась уже после 90с облучения. При этом отмечалась двухступенчатое падение бактериальной обсеменности: после 10с и 90с обработки количество выживших патогенов снижалось на порядки, между тем, как в промежутке между 30с и 45с обработки различий в бактерицидном эффекте не было (см. табл.3.4). Таким образом, эти данные коррелируют с полученными ранее при использовании других источников плазмы (Abramson et al. 2006, Critzer et al. 2007, Joaquin et al. 2009, Larossi et al. 2000).
Для отрицательного коронного разряда комбинация нейтральных частиц и УФ также обладала наиболее выраженным бактерицидным эффектом (рис. 3.21, Б) Приблизительно одинаковое снижение бактериальной нагрузки в положительной и отрицательной короне наблюдалось после 45с обработки. Однако для полной элиминации 10 КОЕ в отрицательной короне требовалось 300с, а двухэтапная кинетика снижения обсеменности, заметная для положительной короны, была сглажена, что, по-видимому, связано с различиями в свойствах положительного и отрицательного коронного разряда.
В стационарной положительной короне электрический ток состоит из многих узких импульсов тока, каждый из которых намного (примерно в тысячу раз) превышает средний ток короны. Отдельный импульс тока соответствует одному или нескольким стримерам, которые представляют собой тонкую токовую нить (примерно 100-200 мкм), зарождающуюся на коронирующем электроде (аноде) и быстро удлиняющуюся в сторону плоского электрода (катода), каковым является агар, нанесенный на металлическую пластину. Одновременно в промежутке могут распространяться несколько стримеров. Стримеры хаотично распределены в пространстве и характеризуются высокой частотой повторения (несколько килогерц), поэтому при временах экспозиции более нескольких секунд они достаточно равномерно обрабатывают поверхность агара. Значительное количество стримеров в межэлектродном промежутке обуславливает более сильное УФ излучение и большее число образующихся активных частиц по сравнению со стационарной отрицательной короной, в которой генерация УФ и активных радикалов происходит только вблизи коронирующего острия.
Комбинация УФ с электрическими компонентами положительной короны также обладала выраженным бактерицидным эффектом: для полной элиминации 10 КОЕ требовалось менее 120с. При этом бактерицидный эффект УФ, производимого положительным коронным разрядом, был значительно ниже, чем его комбинация с любым другим компонентом плазменного факела. Так, облучение бактерий только УФ, генерируемым в положительной короне, в течение 300с приводила к снижению концентрации бактерий в 100 раз, в то время как любая комбинация давала в 1000 раз более сильный бактерицидный эффект (см. табл.3.4 и рис.3.21, А).
УФ, производимый отрицательным коронным разрядом, не обладал бактерицидным эффектом (рис. 3.21, Б) Более того, даже при увеличении времени экспозиции до 10 мин снижения бактериальной обсемененности не наблюдалось (данные не приводятся).
Вклад различных компонентов плазмы в бактерицидный эффект
Структура оболочки клетки играет важную роль в резистентности микроорганизмов к различным типам воздействий. Сложный характер действия плазмы, который включает в себя физико-химические эффекты благодаря образованию химически активных частиц (N2 , N, О, NO, 03, 02(а Д), ОН, Н202 и др) и воздействие электромагнитного поля и УФО, не позволяет использовать простые модели для описания естественной резистентности бактерий к плазменной обработке.
Для понимания механизмов плазменного воздействия на клетки необходимо установить эффективность каждого из поражающих факторов НТП, определить вклад отдельных компонентов плазменного факела и их комбинаций в общий бактерицидный эффект.
Различными авторами были совершены попытки ответить на этот вопрос (Laroussi, М. and Leipold, F., 2004; Philip, N. et al., 2002). Их исследования позволили предположить наличие синергизма между активными действующими компонентами НТП. То есть эффективность воздействия на бактерии максимально, если все активные агенты плазмы (УФ, активные частицы и электромагнитные поля) действуют одновременно.
В условиях наших экспериментов впервые было экспериментально доказано усиление бактерицидных свойств плазмы при совместном действии электрического поля, нейтральных активных частиц и ультрафиолетового облучения, а также установлен бактерицидный эффект каждого компонента для грамположительных и грамотрицательных бактерий на примере S.aureus и P.aeruginosa.
Суммарный бактерицидный эффект положительной и отрицательной короны при воздействии на Грам(+) и Грам(-) бактерии примерно одинаков и очень силен - достаточно нескольких десятков секунд, чтобы полностью инактивировать клетки S. aureus и P. aeruginosa. Однако существует сильное различие в эффективности одинаковых агентов в разных разрядах. Данное различие связывается со свойствами разрядов и исследованных клеток.
Так, более сильное воздействие УФ излучения в положительной короне обусловлено большей интенсивностью УФ излучения в этой короне. Более сильный эффект от воздействия электрического поля в положительной короне связан с наличием в ней стримеров, поле которых обеспечивают электропорацию мембран, а также пробой клеток положительным зарядом, откладываемым стримерами на клетках.
В отрицательной короне электрическое поле у поверхности агара меньше пороговой величины, необходимой для электропорации мембран, поэтому само по себе воздействие электрического поля практически не влияет на инактивацию. В то же время в отрицательной короне обнаружен очень сильный инактивирующий эффект при одновременном воздействии электрического поля и незаряженных активных частиц. По нашему мнению, сильный E+R синергизм обусловлен заметным увеличением проницаемости мембраны под действием отрицательного поля, в результате чего активные нейтральные агенты получают доступ в цитоплазму. В случае совместного воздействия УФО и электрического поля (E+UV) такого эффекта нет, поскольку проникновение УФ излучения в клетку не зависит от проницаемости цитоплазматической мембраны.
Полученные результаты позволят в дальнейшем создать адекватную модель воздействия плазмы на биологические объекты, позволяющую предсказывать эффективность различных типов плазменных генераторов биомедицинского применения.
Исследования в области «плазменной медицины» впервые стартовали в конце 90-х годов прошлого века в ряду развитых стран с традиционно сильными исследованиями в области физики, в том числе России, США, Франции, Германии и др. Работы проводились по разным направлениям, что позволило к настоящему времени выделить ряд областей, для которых применение НТП методически и экономически целесообразно, а также областей, для которых НТП может стать методом, позволяющим достичь принципиально новых результатов (Kong М. et. al., 2009; Laroussi М, et al., 2005; Moreau M. et al., 2008) . К первой группе областей применения НТП относятся
1) стерилизация медицинских приборов и оборудования, сделанных из термо- и химико-чувствительных материалов, которые не могут быть подвергнуты другим методам стерилизации;
2) обеззараживание рук медицинского персонала, более быстрое по сравнению с традиционной обработкой спиртосодержащими растворами;
3) деконтаминация пищевых продуктов.
Ряд направлений остается еще в стадии экспериментальных исследований. В первую очередь, это инициированные в нашей стране исследования по применению НТП для элиминации внутриклеточных возбудителей, а также для разрушения бактериальных биопленок. Технические возможности конструирования источников НТП достаточно велики, что позволяет создавать с одной стороны источники, покрывающие относительно большие площади, исчисляемые даже десятками сантиметров, а с другой стороны, уже созданы первые эндоскопические источники НТП, которые могут быть использованы для терапии бронхолегочных и урогенитальных инфекций (Lu, X., 2012).
