Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Экзогенная гипертермия как экстремальный фактор 11
1.2. Морфофункциональные свойства лейкоцитов крови 17
1.2. Г. Особенности объяснения морфофункциональных свойств клеток с позиций мембранной теории и гипотезы ассоциации-индукции 17
1.2.2. Морфометрические характеристики и микрореологические свойства белых клеток крови 20
1.2.3. Осморегуляторные реакции лейкоцитов крови 21
1.2.4. Фагоцитарная активность белых.клеток крови 28
1.3. Действие тепловой нагрузкина морфофункциональные характеристики клеток крови 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Описание объекта, моделей исследования и серий эксперимента 38
2.2. Методы оценки развития стресс-реакции в организме 40
2.3. Методы-исследования функциональных свойств и морфологических показателей белых клеток крови 41
2.3.1. Изучение локомоционной активности лейкоцитов 41
2.3.2. Оценка адгезионной способности белых клеток крови 43
2.3.3. Исследование поглотительной способности нейтрофилов 44
2.3.4. Изучение осмотической стойкости, мембранного резерва и осморегуляторных реакций лейкоцитов крови 44
2.4. Методы микроскопирования и анализа полученных изображений, использовавшиеся при изучении морфофункциональных свойств клеток 51
2.4.1. Метод световой микроскопии 52
2.4.2. Метод сканирующей электронной микроскопии 53
2.4.3. Метод полуконтактной атомно-силовой микроскопии 54
2.5. Методы статистической обработки данных 59
Глава 3. Результаты исследования 60
3.1. Оценка системных изменений и клеточных реакций, возникающих в результате действия на организм интенсивной тепловой нагрузки (опыты in vivo) 60
3.1.1. Системные реакции на экзогенную гипертермию 60
3.1.2. Изменение морфометрических показателей лейкоцитов в условиях экзогенной гипертермии 66
3.1.2.1. Сравнительная оценка .геометрических характеристик лимфоцитов, полученных различными методами микроскопии 66
3.1.2.2. Результаты исследования морфометрических показателей нейтрофилов методами полуконтактной атомно-силовой и световой микроскопии 72
3.1.3. Влияние экстремального перегревания организма на функциональные и микрореологические свойства лейкоцитов крови .76
3.1.3.1. Результаты изучения этапов фагоцитарного процесса' лейкоцитов крови крыс 76
3.1.3.2. Оценка осморегуляторных реакций и осмотической стойкости лейкоцитов с использованием функциональных проб 79
3.1.3.3. Результаты изучения резерва плазмалеммы и пластичности лимфоцитов 83
3.1.3.4. Результаты исследования мембранного резерва нейтрофилов 93
3.2. Изменение функциональных и микрореологических свойств лимфоцитов крови при прямом действии тепловой нагрузки на клетки (опыты in vitro) 95
3.2.1. Сравнительная характеристика морфометрических показателей лимфоцитов '. 95
4 3.2.2. Динамика пластичности лимфоцитов и использования клетками мембранного резерва в условиях гипотонии 100
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 111
4.1. Сравнительная оценка различных методов изучения изменений морфометрических характеристик и функциональных свойств белых клеток крови 111
4.2. Анализ действия интенсивной экзогенной тепловой нагрузки на организм (опыты in vivo) 119
4.2.1. Реакция организма на действие интенсивной тепловой нагрузки 119
4.2.2. Динамика морфометрических характеристик и функциональных свойств белых клеток крови при действии интенсивной тепловой нагрузки на организм 121
4.3. Оценка прямого действия тепловой нагрузки на морфофункциональные характеристики лимфоцитов (опыты in vitro) 124
Выводы 129
Библиографический список 131
- Морфометрические характеристики и микрореологические свойства белых клеток крови
- Изучение осмотической стойкости, мембранного резерва и осморегуляторных реакций лейкоцитов крови
- Изменение морфометрических показателей лейкоцитов в условиях экзогенной гипертермии
- Анализ действия интенсивной экзогенной тепловой нагрузки на организм (опыты in vivo)
Введение к работе
Актуальность исследования.
Значительный интерес к исследованию морфофизиологических характеристик лейкоцитов обусловлен тем, что белые клетки крови выполняют в организме комплекс важных функций. Лейкоциты принимают участие как в осуществлении специфических защитных реакций, к которым относится продукция и секреция антител иммунокомпетентными клетками (лимфоцитами) (ТяжеловаВ.Г., 2003; КозинецГ.И. и др., 2001), так и в реализации механизмов неспецифической защиты, включающих фагоцитарную активность нейтрофилов (Игнатов П.Е., 2002; Yap В., 1999). Циркуляция в крови лимфоцитов, чьей функцией является постоянный иммунологический контроль антигенного состава собственного и поступающего извне чужеродного материала (ТяжеловаВ.Г., 2003), и движение по капиллярному руслу полиморфноядерных клеток, а также их активация, адгезия к эндотелию и миграция в ткани, оказывают значительное влияние на формирование местного микрососудистого сопротивления и вносят вклад в регуляцию перфузии органов (РедчицЕ.Г., Парфенов А.С., 1989; Иванов К.П., Мельникова Н.Н., 2004). При этом особенности микрореологических характеристик и физиологической активности лейкоцитов определяются морфофункциональным статусом белых клеток крови, в формировании которого важную роль играют такие показатели как объём, резерв плазмалеммы и пластичность, поддерживающиеся на относительно постоянном уровне и являющиеся индикатором состояния клетки (Иванов К.П., Мельникова Н.Н., 2004; WehnerF., Tinel Н., 2000; WehnerF. et al., 2003; LangF., 2007; McManusM.L. et al, 1995; BeckF.X. et al, 1998; EbnerH.L. et al, 2005; Davis C.E. et al., 2004). Активация лейкоцитов происходит в условиях развивающегося в организме инфекционного процесса, зачастую сочетающегося с лихорадкой (характеризующейся повышением температуры тела), и сопровождается изменением морфофизиологических характеристик клеток (Hartzfeld-Charbonnier A.S. et al., 2007; Park H.G. et al., 2005; Hanson D.F., 1993; Ostberg J.R., Repasky E.A., 2006; Murapa P. et al, 2007; Rice P. et al, 2005; Chen Q. et al., 2006; Zheng H. et al., 2003). Для ответа на вопрос как изменятся функциональные и реологические свойства лейкоцитов при повышении температуры окружающей среды, и каковы механизмы возможных изменений, было предпринято изучение действия тепловой нагрузки на клетки крови на двух моделях: in vivo и in vitro.
Несмотря на большое количество работ по изучению клеточных механизмов адаптации к действию активного физического модулятора функционального состояния организма стрессорной природы - гипертермии (Васильев Н.В., 1992; КинштД.Н., КинштН.В., 2006; БаллюзекФ.В. и др., 2001; Курпешев O.K. и др., 2005; ЖавридЭ.А. и др., 1997), эта проблема остаётся актуальной для современной физиологии. Исследование динамики морфометрических показателей и реактивности клеток в условиях экзогенного перегревания в опытах in vivo и in vitro позволяет оценить влияние клеточных
изменений на адаптивные возможности организма в целом (Moseley P.L., 1997; ГоричеваВ.Д, 2000) и раскрыть механизмы лечебного и повреждающего действия гипертермии (Козлов Н.Б., 1990; СуверневА.В. и др., 2009). Экзогенное перегревание рассматривается в качестве одного из перспективных методов профилактики и терапии ряда заболеваний, в частности в онкологической (Сувернев А.В. и др., 2009; Клишковская А.Ф., 2007; Fiorentini G., Szasz А., 2006; Atanackovic D. et al., 2006; J. van der Zee, 2002), вирусологической и аллергологической области медицинской практики (Сувернев А.В. и др., 2009), поэтому изучение реакций клеток крови на действие теплового фактора приобретает особую значимость.
Целью диссертационной работы была сравнительная оценка функциональных и микрореологических свойств лейкоцитов в условиях действия экзогенной гипертермии на клетки крови в опытах in vivo и in vitro.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
дать сравнительную оценку динамики физиологических свойств (общих и специфических) лейкоцитов крови в условиях действия интенсивной тепловой нагрузки на организм и охарактеризовать сопутствующие им изменения на организменном уровне;
выявить особенности изменений функциональных и микрореологических свойств лейкоцитов при действии экзогенной гипертермии на организм;
оценить сходства и различия в изменении геометрических и физиологических характеристик лимфоцитов под влиянием экзогенной гипертермии в опытах in vivo и in vitro;
установить особенности динамики морфофункциональных характеристик лимфоцитов при действии на кровь тепловой нагрузки.
Научная новизна исследования.
Впервые показано, что в условиях действия интенсивной тепловой нагрузки на организм на фоне стресс-индуцированной гиперплазии коры надпочечников и изменения клеточного состава красного костного мозга, происходит специфический сдвиг лейкоцитарной формулы крови, сопровождающийся лимфоцитозом, моноцитозом, нейтропенией. Получены новые данные о том, что гипертермия вызывает повышение эффективности осморегуляторных реакций и осмотической стойкости лейкоцитов крови. Впервые установлено, что экстремальная экзогенная гипертермия организма приводит к регуляторному уменьшению объёма лимфоцитов, снижению пластичности и экономному использованию клетками мембранного резерва в условиях гипотонии.
Впервые выявлены особенности изменений функциональных свойств и геометрических параметров лейкоцитов, подвергавшихся экспозиции в средах разной осмоляльности в опытах in vitro. Показано, что инкубация клеток крови при температуре физиологической нормы (37С) вызывает увеличение объёма и пластичности лимфоцитов. Действие тепловой нагрузки (37С, 42С) на клетки
крови сопровождается использованием лимфоцитами функционального мембранного резерва уже в изоосмолярных условиях.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Полученные данные об изменении морфофункциональных свойств лейкоцитов крови в условиях экзогенной гипертермии расширяют и углубляют существующие представления о клеточных механизмах адаптации организма к действию тепловой нагрузки. Выявленные в ходе исследования изменения морфологических параметров и функциональных свойств лейкоцитов, инкубированных в условиях температуры физиологической нормы (37С) в опытах in vitro, следует учитывать при проведении клинических процедур, предусматривающих извлечение порции крови и возвращение её в организм (гемодиализ, плазмаферез).
Результаты исследования могут быть использованы для преподавания курсов «Физиология клетки», «Физиология крови», «Физиология экстремальных состояний», «Экологическая физиология», а также при написании учебно-методических пособий.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Направленность адаптационных реакций лейкоцитов крови в условиях
действия интенсивной тепловой нагрузки на организм, характеризующаяся
повышением эффективности регуляции объёма клеток, их осмотической
стойкости и локомоционной активности, опосредована как физическим
действием температуры, так и развивающейся у животного стресс-реакцией,
подтверждением которой служат неспецифические морфологические
изменения со стороны надпочечников и клеточного состава костного мозга.
В условиях экстремального перегревания организма происходит компактизация структур лимфоцитов крови, сопровождающаяся уменьшением их объёма, пластичности и снижением использования функционального резерва плазмалеммы.
Инкубация клеток крови при температуре физиологической нормы (37С) и повышенной температуре (42С) приводит к увеличению их пластичности и объёма за счёт использования мембранного резерва не только в гипотонической, но и в изотонической среде.
Апробация результатов работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), 25th Conference of the European Society for Microcirculation (Budapest, Hungary, 2008), IV Всероссийской конференции (с международным участием) «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2009), XIV Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2009), VII Международной научной конференции «Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику)» (Ярославль, 2009), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), Международной научно-практической конференции «Здоровье в XXI веке - 2010» (Тула, 2010), Всероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010).
Объём и структура диссертации. Диссертация содержит 156 страниц текста компьютерного набора, 17 таблиц, 70 рисунков, 12 формул. Рукопись состоит из введения, четырёх глав основной части (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов исследования), выводов и библиографического списка, включающего 241 источник (71 отечественную и 170 зарубежных публикаций).
Морфометрические характеристики и микрореологические свойства белых клеток крови
Циркулирующие в крови лейкоциты в неактивированном состоянии имеют сферическую форму (Yap В., 2005), которая поддерживается благодаря существованию в клетке достаточно жёсткой цитоархитектоники, противодействующей частым гидродинамическим и механическим нагрузкам и защищающей их от повреждений (Brown MJ. et al., 2001). Основными «помощниками» в обеспечении механических свойств цитоплазмы лейкоцитов являются актиновые филаменты (Ting-Beall PLP. et al., 1993) и белки, связывающие их и контролирующие их размер (Luby-Phelps К., 1994; RiveroF. et al., 1996). Протеины, содержащиеся в клетках и выполняющие функцию поперечных сшивок актина, которые связывают актин с разной аффинностью, имеют различное внутриклеточное расположение и по-разному регулируются. Это позволяет клеткам изменять цитоплазму от жёсткой до динамической сети (RiveroF. et all, 1996). Цитоскелет лейкоцитов, выполняя, важную структурную функцию, играет также регуляторную роль, в обеспечении множества разнообразных мембранных процессов (RaucherD., Sheetz М.Р., 1999; Bretscher А., 1991), обеспечивает подвижность, фагоцитоз, изменение формы (Machesky L.M., Insall R.H., 1999; Raucher D., Sheetz M.P., 1999), сократимость, цитокинез и сохранение полярности клетки (Machesky L.M., Insall R.H., 1999).
Структурные характеристики и реологические свойства лейкоцитов определяют способность клеток к деформации (Tran-Sonay R. et al., 1998). Лейкоциты ведут себя в потоке как более упругие и резистентные, по сравнению с эритроцитами, тела, которые могут существенно нарушать кровоток в капиллярах вплоть до полного его прекращения (РедчицЕ.Г., Парфёнов А.С., 1989). Несмотря на то, что количество лейкоцитов в обращающейся крови составляет лишь доли процента от общего числа форменных элементов, белые клетки крови могут оказывать значительное влияние на микроциркуляцию (SungK.-L.P. et al, 1982; РедчицЕ.Г., Парфенов А.С., 1989; Иванов К.П., Мельникова Н.Н., 2004). Поведение белых клеток крови в микрососудах зависит, прежде всего, от геометрических параметров (площади поверхности и объёма) и механических свойств (РедчицЕ.Г., Парфёнов А.С., 1989). Прижизненными исследованиями установлено, что при входе в узкие (4-5 мкм) капилляры лейкоциты останавливаются, затем деформируются (Фёдорова, М.З., 2001; РедчицЕ.Г., Парфёнов А.С., 1989; Yap В., 2005), принимая цилиндрическую форму, и медленно, с частыми остановками, передвигаются по сосуду. Деформация лейкоцитов возможна за счёт складок плазмалеммы (Фёдорова М.З., 2001; РедчицЕ.Г., Парфёнов А.С., 1989; Stuart J., Kenny M.W., 1980). Это так называемый мембранный «резерв» (Yap В ., 2005; Stuart J., Kenny M.W., 1980), который расправляется в результате деформации клетки в микрососуде (Stuart J., Kenny M.W., 1980). Таким образом, в нормальных условиях закупоривание лейкоцитами узких капилляров — явление редкое и кратковременное. Оно не причиняет вреда питанию тканей (ФёдороваМ.З., 2001; РедчицЕ.Г., Парфёнов А.С., 1989). Кроме ситуаций, связанных, например, с повышением адгезии (Фёдорова М.З., 2001; РедчицЕ.Г., Парфёнов А.С., 1989; Иванов К.П., Мельникова Н.Н., 2004; Свешников П.Г. и др., 2007), увеличением содержания количества белых клеток в крови или сужением микрососудов (Stuart J., Kenny MiW., 1980), когда лейкоциты могут представлять существенную помеху микроциркуляции.
Одной из физиологически значимых морфофункциональных характеристик клеток является их объём. В настоящее время доказано, что объём клетки определяет не только её внутриклеточную осмолярность и форму, но также влияет на трансэпителиальное перемещение, миграцию клетки, клеточный рост, гибель и регуляцию внутриклеточного метаболизма (WehnerF. et al., 2003; WehnerF., TinelH., 2000). Известно, что даже краткосрочные изменения объёма могут вызвать достаточно глубокие перемены функций клетки (Davis СЕ. et al., 2004). Тогда как чрезмерные его колебания приводят к нарушению целостности клеточной мембраны и архитектоники цитоскелета (Lang F., 2007; Al Habori М. et al., 2001). A no данным Chan C.K. и соавторов (1995) динамика объёма клеток- может оказывать влияние на процесс их активации. Изменение объёма клеток происходит в результате движения молекул воды через полупроницаемую плазматическую мембрану при нарушении осмотического равновесия между содержимым клетки и окружающим раствором (Mongin А.А., Orlov S.N., 2001). Причиной возникновения подобного осмотического градиента является изменение концентрации растворённого вещества в-той или иной среде (МсManusM.L., 1995; LangF.. et al., 1998; LangF., 2007; WehnerF., Tinel H., 2000). При этом вода легко проникает через липидный слой плазмалеммы путём простой диффузии (Strange К., 2004; Marinelli R.A., LaRusso N.F., 1997; Verkman A.S. et al., 1996), а благодаря присутствию в нём специализированных белков (аквапоринов) - селективных каналов?для воды-(МаТ., Verkman A.S., 1999; Maunsbach А.В. et al., 1997; Hoffman Е.К. et al., 2009) - проницаемость клеточных мембран для воды значительно повышается (BorgniaМ. et al., 1999; KingL.S., AgreP., 1996; LangF., 2007; GreszV. etal.,2001).
Необходимо отметить, что увеличение объёма клеток млекопитающих в среде со сниженной осмолярностью обеспечивается изменением их формы и ростом площади поверхности (RaucherD., Sheetz М.Р.", 1999; GroulxN. et al., 2006; Dai J. et al, 1998), в результате использования дополнительных участков наружной мембраны и внутриклеточных резервов (Groulx N. et al., 2006; Sukhorukov V.L. et al., 1993; Wan X. et al., 1995). При этом значительное встраивание в плазмалемму эндомембраны происходит лишь в случае экстремального набухания (GroulxN. et al., 2006). Соответствующий вклад этих процессов, источник и величина мембранного резерва ещё не полностью определены (Groulx N. et al., 2006).
Известно, что клетки различного происхождения по-разному реагируют на изменение объёма. Растительные клетки в гипотонической среде ведут себя подобно неживым осмометрам, то есть их объём прямо зависит от концентрации осмотически активных веществ в растворе (Смирнова Е.А. и др., 1987). В то время как многие клетки животных в подобных условиях способны к регуляции объёма (Смирнова Е.А. и др., 1987; Hoffman Е.К., Lambert I.H., 1983; Ben-Sasson S. et al., 1975; Davis G.E. et al., 2004).
Процесс, в результате которого набухшая или сморщенная клетка возвращается к нормальному объёму, называется, соответственно, регулируемое уменьшение (Strange К., 2004; Tamma G. et al., 2007; Okada Y. et al., 2001) и регулируемое увеличение объёма (Strange К., 2004) (рис. 2). Эти процессы необходимы для нормальногої функционирования и выживания клеток (Мс Manus M.L., 1995; Lang F., 2007; Beck F.X. et al., 1998; Ebner H.L. et al., 2005).
Изучение осмотической стойкости, мембранного резерва и осморегуляторных реакций лейкоцитов крови
Для изучения поглотительной способности лейкоцитов использовали ранее разработанную методику фагоцитоза нейтрофилами дрожжевых клеток (Дуглас С.Д., КуиП.Г., 1983), так как опыты с чистыми нейтрофилами, отмытыми от плазмы или тканевой жидкости, позволяют спроецировать параметры поглощения на клетку (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983). В пробирку, объёмом 2 мл, помещали дрожжевые клетки и добавляли суспензию лейкоцитов. Пробирки инкубировали в термостате в течение 30 минут при температуре 37С. Через каждые пять минут осуществляли встряхивание содержимого пробирки. По истечении времени инкубации готовили мазки, которые фиксировали этанолом. Фиксированные мазки окрашивали азур-эозином по Романовскому. Подсчитывали число фагоцитирующих нейтрофилов на каждые 100 клеток популяции -фагоцитарная активность (ФА) и количество дрожжевых клеток, поглощённых в среднем одним нейтрофилом — фагоцитарный индекс (ФИ) (Пат. № 2143693 (РФ)). Подсчёт фагоцитированных частиц осуществляли с использованием светового микроскопа (МикМед, объектив хЮО МИ, окуляр х15).
Осмотическую стойкость, осморегуляторные реакции лейкоцитов крови и использование ими мембранного резерва исследовали с помощью функциональных проб с гипотоническими нагрузками. В качестве сред со сниженной осмолярностью использовали растворы хлорида натрия -умеренно гипотонический (массовая доля NaCl в котором составляет 0,45%) и сильно гипотонический (массовая доля NaCl в котором составляет 0,2%) (Фёдорова М.З., Левин В.Н., 1997). Осмотические свойства растворов оценивали по величине их осмолярной концентрации (осмолярности), которая определяется количеством всех кинетически активных частиц, содержащихся віл раствора, независимо от их формы, размера и природы (Учение о растворах. Протолитические и гетерогенные равновесия/ Под ред. Кроме осмолярной концентрации для учёта осмотических свойств І плазмы крови нередко пользуются осмоляльной концентрацией { (осмоляльностью), которая! отражает концентрацию частиц в 1 кг } растворителя (осмоль/кг) (Рябов Г.А., 1994). Однако разница между осмолярностью и осмоляльностью плазмы и других биологических растворов незначительна вследствие их относительной разбавленности. В норме осмолярная концентрация плазмы крови равна 290-310 мосмоль/л, а осмоляльность плазмы составляет 275-290 мосмоль/кг (Учение о растворах. Протолитические и гетерогенные равновесия/ Под ред. профессора Т.Н. Литвиновой, 2009). \ Теоретическая- осмолярность растворов хлорида натрия, ) использовавшихся в эксперименте, составляла 308,0 мосмоль/л для физиологического раствора хлорида натрия (0,9% NaCl), 154,0 мосмоль/л для 1 умеренно гипотонического раствора хлорида натрия (0,45% NaCl) и і і 68,4 мосмоль/л для сильно гипотонического раствора хлорида натрия (0,2% NaCl). С целью получения данных по осмотической стойкости, резервным возможностям мембраны и осморегуляторным реакциям лейкоцитов использовали модифицированный комплексный метод (Фёдорова М.З., Левин В.Н., 1997) (рис. 8). Рисунок 8. Схема изучения осмотической стойкости, резервных возможностей мембраны и осморегуляторных реакций лейкоцитов крови крыс: 0,9% - инкубация клеток в изотоническом растворе NaCl; 0,45% -инкубация клеток в умеренно гипотоническом растворе NaCl; 0,2% -инкубация клеток в сильно гипотоническом растворе NaCl; D - диаметр клетки.
В лунки планшеток помещали по 5 мкл суспензии лейкоцитов. К клеткам добавляли по 50 мкл растворов хлорида натрия различной осмолярности. В первую лунку - изотонический раствор (0,9% раствор NaCl), во вторую лунку - умеренно гипотонический раствор (0,45% раствор NaCl), в третью лунку - сильно гипотонический раствор (0,2% раствор NaCl). По истечении 1 минуты и 60 минут проводили изучение морфофизиологических характеристик клеток.
Исследование объёма, площади поверхности лейкоцитов и использования клетками мембранного резерва в условиях гипотонии проводили методами световой и полуконтактной атомно-силовой микроскопии на воздухе. При этом клетки, инкубированные в изотоническом растворе и в сильно гипотоническом растворе в течение одной минуты, подвергались различным способам подготовки для дальнейшего исследования.
1) Из клеток готовили мазки, фиксировали их этанолом в течение 20 минут на воздухе и окрашивали азур-эозином по Романовскому в течение 15 минут. Измерение диаметра клеток проводили с помощью аппаратно-программного комплекса «ВидеоТест-Размер 5.0» (Санкт-Петербург, Россия) (световой микроскоп МикМед, при увеличении хЮО).
2) Суспензию нефиксированных клеток помещали в камеру Горяева (рис. 9).
Изменение морфометрических показателей лейкоцитов в условиях экзогенной гипертермии
Проведено изучение геометрических показателей лейкоцитов крови крыс в условиях нормальной и сильно сниженной осмолярности среды. Оценивали изменение морфологии белых клеток крови в результате интенсивного теплового воздействия на организм.
Оценка топографии поверхности лимфоцитов с помощью сканирующей электронной микроскопии
Использование сканирующего электронного микроскопа позволяет получить достоверные данные о микротопографии поверхности клеток, однако данный метод микроскопии не даёт возможности оценить трёхмерные геометрические характеристики исследуемых объектов (рис. 25, 26).
Рисунок 25. Электронограмма лимфоцита, инкубированного в изотоническом растворе хлорида натрия (СЭМ Quanta 200, сканирование проводилось в режиме низкого вакуума (5.00 kV), х20 000).
Представленные электронограммы белых клеток крови (рис. 25, 26) демонстрируют присутствие складок на поверхности лимфоцитов, что ещё раз подтверждает наличие у лейкоцитов резерва плазмалеммы. Более выражен складчатый характер поверхности у клетки, инкубированной в изотоническом растворе (рис. 25). Складчатость поверхности клеток в гипотонической среде, вероятно, является следствием незначительного гипертонического сжатия лимфоцита при фиксации глутаровым альдегидом.
Динамика морфометрических параметров лимфоцитов в условиях экзогенной гипертермии, регистрируемая методом световой микроскопии Проведено изучение динамики размеров клеток в результате действия на организм экзогенной гипертермии методом световой микроскопии. Морфометрические характеристики клеток контрольной и экспериментальной групп в мазке представлены в таблице 2. Объём лимфоцитов крови животных, подвергавшихся действию интенсивной тепловой нагрузки, меньше объёма лимфоцитов крови интактных животных на 15,9% при инкубации клеток в изотонической среде, и на 11,5% при инкубации клеток в течение 1 минуты в сильно гипотоническом растворе (рис. 27). С целью исследования влияния экзогенной гипертермии на морфофункциональные характеристики клеток проводили изучение живых лимфоцитов, помещённых в камеру Горяева, и лимфоцитов, фиксированных глутаровым альдегидом (таблица 3).
Данные, полученные в результате исследования живых лимфоцитов и клеток, фиксированных глутаровым альдегидом, свидетельствуют о том, что экзогенное перегревание организма вызывает уменьшение объёма клеток в изотонической среде, и увеличение объёма лимфоцитов, подвергавшихся действию сильно гипотонической нагрузки, ПС сравнению с соответствующими объёмами лимфоцитов крови животных группы «Контроль» (таблица 3, рис. 28).
Таким образом, исследование фиксированных различными способами лимфоцитов и последующая оценка динамики объёма клеток по изменению диаметра, измеренного с помощью светового микроскопа, даёт противоречивые результаты, обусловленные ограниченными возможностями метода.
Изменения геометрических показателей лимфоцитов в условиях экзогенной гипертермии, выявляемые методом полуконтактной атомно-силовой микроскопии
Представленные на рисунке 29 сканограммы лимфоцитов крови контрольной и экспериментальной групп, полученные методом полуконтактной АСМ на воздухе, наглядно демонстрируют изменение линейных размеров и архитектоники клеток под влиянием экзогенной гипертермии.
Данные, характеризующие геометрические параметры клеток, занесены в таблицу 4.
Рисунок 29. Сканограммы лимфоцитов крови в мазке, полученные методом полуконтактной атомно-силовой микроскопии на воздухе (СЗМ «ИНТЕГРА Вита» (фирмы НТ-МДТ, Россия)): 1 - группа «Контроль», 2 - группа «Перегревание животного»; А - клетки, инкубированные в изотоническом растворе хлорида натрия (0,9% NaCl); Б - клетки, инкубированные в сильно гипотоническом растворе хлорида натрия (0,2% NaCl) в течение 1 минуты.
Анализ действия интенсивной экзогенной тепловой нагрузки на организм (опыты in vivo)
Одной из важных особенностей гомойотермных организмов является способность поддерживать температуру ядра тела относительно постоянной (Иванов К.П. и. др., 1984). Известно, что лабораторная крыса (вида Rattus norvegiciis) посредством активации ряда автономных и поведенческих механизмов- (Gordon С J., 1990)г сохраняет температурный гомеостаз на уровне 38,1 С (при температуре воздуха 18-25G) (Иванов К.П. и др:, 1984). Однако экспериментально у становлено; что действие на организм животного экзогенной гипертермии; интенсивностью; 3 8?G в стечение 120- минут приводит к нарушению процессов терморегуляции и увеличению температуры тела крысы, в среднем, на 5Є (рис. 19). Анализ данных научнош литературы, даёт основание считать наблюдаемое в; эксперименте, повышение ректальной температуры животного до 42 3 G экстремальной тепловой: нагрузкой (Ismaitzade R.S.,-2005), при этом повышение температуры тела примерно до 43-44?Є считается смертельным для ряда млекопитающих/(Иванов К.П: и др;,. 1984);. По мнению ряда авторов, определённый? вклад в повышение температуры, тела может вносить развивающаяся у животного в условиях экзогенной гипертермии стресс-реакция (KokoV. et-al, 2004; KlugerШЖ et al, 1990) котораяшриводит к росту температуры телакрысы, в среднем на 1,4G (Kluger Ml J. et al, 1990): О том, что продолжительное действие интенсивной тепловой нагрузки на организм животного опосредует запуск стресс-реакции, свидетельствуют морфологические- изменения в- надпочечниках. Выявлено, что перегревание крысы вызывает относительное увеличение коркового слоя надпочечников (рис. 20), снижение митотического индекса клеток пучковой зоны коры надпочечников (рис.21) и увеличение диаметра ядер клеток пучковой зоны (рис. 22); Причиной подобных гистологических преобразований является активация в условиях стресса гипоталамо 120 гипофизарно-адреналовой системы (DallmanM.F. et al., 1992; Koko V. et al., 2004), которая посредством стимуляции выработки адренокортикотропного гормона (АКТГ) гипофизом приводит к повышению секреции глюкокортикоидных гормонов корой надпочечников (DallmanM.F. et al., 1992; Koko V. et al., 2004). При этом секреция минералокортикоидных гормонов угнетена (ГаркавиЛ.Х. и др., 1998). Известно, что кроме надпочечников, органы тимико-лимфатической системы и клеточный состав крови также обладают высокой чувствительностью к действию любого стрессорного фактора и отвечают на него определёнными морфофункциональными изменениями (Мельник Б.Е., КаханаМ.С, 1981; Селье Г., 1979). В ходе проведённого исследования выявлено, что действие экзогенной гипертермии на организм приводит к лимфоцитозу, нейтропении, моноцитопении и эозинопении в костном мозге животных (рис. 24). Считается, что подобные изменения клеточного состава костного мозга являются неспецифическими и носят стрессорный характер (Горизонтов П.Д. и др., 1983). Экспериментально установлено также, что влияние на организм интенсивной тепловой нагрузки опосредует значительное снижение количества циркулирующих в ікрови лейкоцитов. При этом-лейкопенияшри экзогенной гипертермии сопровождается специфическим сдвигом лейкоцитарной формулы крови - лимфоцитозом, нейтропенией и моноцитозом (рис. 23). В то время как стресс-реакции сопутствует лимфопения, которую объясняют вызванной кортизолом миграцией клеток в лимфоидные ткани (Brenner I. et al., 1998), эозинопения, (Мельник Б.Е., КаханаМ.С, 1981) и нейтрофильный лейкоцитоз (СельеГ., 1979). Что касается количества и соотношения разных типов лейкоцитов крови у интактных животных (рис. 23), то оно не отличается от полученных другими авторами (Горизонтов П.Д. и др., 1983).
Оценка геометрических характеристик и реактивности клеток крови позволила установить, что действие интенсивной тепловой нагрузки на организм приводит к мобилизации функциональных свойств лейкоцитов.
Рисунок 69. Схема, иллюстрирующая изменение морфофункциональных характеристик лимфоцитов под влиянием тепловой нагрузки в условиях in vivo: Ку - коэффициент уплощённости (отн.ед.); AS - показатель, демонстрирующий изменение площади поверхности клетки по сравнению с соответствующим параметром интактных лимфоцитов (%); AV - показатель, демонстрирующий изменение объёма клетки по сравнению с соответствующим параметром интактных лимфоцитов (%); Sr/V -относительный мембранный резерв клетки (отн.ед.); S/V - относительная площадь поверхности клетки (отн.ед.).
При анализе данных, полученных методом полуконтактной атомно-силовой микроскопии, установлено, что экзогенная гипертермия животного вызывает уменьшение объёма белых клеток крови, сопровождающееся снижением их распластанности на подложке (рис. 69). Подобная компактизация клеточных структур является свидетельством увеличения функциональной активности лимфоцитов в условиях действия интенсивной тепловой нагрузки на организм. Исследование использования резерва плазматической мембраны лимфоцитами в условиях гипотонии, позволило установить, что в результате перегревания животного оно становится более экономным. Это подтверждается уменьшением значения относительного мембранного резерва лимфоцитов (рис. 69), и может трактоваться как проявление «сберегающего» типа реагирования клеток (Фёдорова М.З., 2002). Незначительное снижение относительной площади поверхности лимфоцитов, наблюдающееся при перегревании организма, может быть связано с реакцией клетки, направленной на уменьшение площади соприкосновения с другими объектами (рис. 69). Выявленные изменения геометрических характеристик клеток могут рассматриваться в качестве подтверждения высокой физиологической» значимости исследуемых морфометрических параметров, модификация, которых является одним из компонентов сложного механизма клеточной реакции адаптации животного к действию интенсивной тепловой нагрузки.
Результаты исследования показали, что экзогенная гипертермия повышает реактивность, лейкоцитов и эффективность осморегуляторных реакций клеток. Экспериментально установлено, что и лимфоциты, и нейтрофилы крови животных, подвергавшихся действию интенсивной тепловой нагрузки, в условиях умеренно гипотонической среды достигают большего объёма, по сравнению с клетками контрольных животных (рис. 37, 38). В то же время лейкоциты животных экспериментальной группы более полно восстанавливают исходный размер после длительной инкубации в умеренно гипотонической среде, по сравнению с белыми клетками крови животных группы «Контроль» (рис. 37, 38; таблица 7).
