Введение к работе
Актуальность темы исследования. Для оценки эффективности воздействия радиации на живые организмы необходима детальная информация как о микродозиметрическом распределении поглощенной энергии в веществе, так и о первичных повреждениях молекулы ДНК, о закономерностях образования летальных и мутационных изменений ДНК и, в частности, о хромосомных аберрациях. Наиболее перспективным подходом к решению подобного рода задач является сочетание теоретических и экспериментальных методов исследования. При этом необходима разработка биофизических методов, позволяющих предсказывать как ранние, так и отдаленные последствия воздействия радиации на молекулярном, клеточном уровне и, в конечном счете, на уровне организма человека в целом. Особенностью воздействия на молекулы ДНК различных излучений, особенно с низкой линейной переданной энергией (ЛПЭ) (гамма- и рентгеновское излучение), является существенный вклад механизма косвенного действия свободных радикалов, которые возникают в процессе радиолиза молекул воды и приводят к повреждению сахаро-фосфатного остова молекулы ДНК. По этой причине учет как прямого, так и косвенного действия ионизирующего излучения является необходимым условием разработки современной биофизической модели для оценки радиационных повреждений, вызванных излучением с различной ЛПЭ. На молекулярном уровне возрастает локальная кластеризация поглощенной энергии ионизирующего излучения. Поскольку эффективность работы репарационных систем на клеточном уровне может зависеть от распределения повреждений на масштабах в десятки пар оснований (ПО) в структуре молекулы ДНК, то исследование как простых, так и комплексных разрывов ДНК позволяет оценить эффективность работы систем репарации. Актуальность исследования первичных повреждений ДНК обусловлена тем, что они играют определяющую роль в механизмах образования хромосомных аберраций в соматических клетках человека. Анализ хромосомных аберраций позволяет делать обоснованные заключения о характере радиационного воздействия, а также прогнозировать его последствия.
Целью работы являлось исследование роли стохастических факторов путем биофизического моделирования взаимодействия ионизирующего излучения с биологическими структурами различного уровня организации, а также путем анализа наблюдаемого выхода хромосомных аберраций при облучении соматических клеток человека in vitro и in vivo. Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие конкретные задачи:
-
Разработка биофизической модели взаимодействия ионизирующего излуче-ния с биологическими структурами клетки, включая высшие формы пространственной организации молекулы ДНК.
-
Проведение анализа предсказанных по разработанной модели законо-мерностей индукции первичных повреждений на молекулярно-клеточном уровне в сопоставлении с наблюдаемыми радиационными эффектами.
-
Разработка модели межклеточного взаимодействия наблюдаемого in vitro эффекта "свидетеля" (bystander effect).
-
Исследование стабильных и нестабильных аберраций хромосом при облучении соматических клеток человека in vitro и in vivo.
-
Анализ закономерностей частоты радиационно-индуцированных аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека с целью совершенствования цито-генетических методов в задачах ретроспективной биодозиметрии.
Научная новизна. В процессе выполнения исследования были получены новые фундаментальные данные о закономерностях образования первичных повреждений ДНК и аберраций хромосом в соматических клетках человека.
Впервые была разработана оригинальная биофизическая модель, позволяющая рассчитывать вероятности поглощения энергии в различных структурных элементах ядра клетки, абсолютные значения эффективности образования первичных повреждений ДНК и их координаты с точностью до нуклеотида в широком диапазоне ЛПЭ воздействующего излучения. Также впервые была разработана биофизическая модель эффекта “свидетеля” (bystander effect), проявляющегося в форме изменения выживаемости и частоты образования мутантных клеток при воздействии малых доз радиации.
В работе впервые представлены оригинальные интерпретации и пред-сказания ряда радиобиологических эффектов, в частности, заключение о роли структуры хроматина при формировании спектра коротких фрагментов ДНК, выводы о механизме распространения и массе носителя сигнала в эффекте “свидетеля”, причина появления больших событий поглощения энергии при касательном воздействии тяжелого иона на сферическую газовую полость.
Впервые на репрезентативном уровне удалось получить и проанализиро-вать данные многолетнего цитогенетического наблюдения людей, облучив-шихся в дозах от 1 Гр до 10 Гр на все тело с клиническими проявлениями острой лучевой болезни (ОЛБ). При этом впервые были получены количествен-ные закономерности динамики стабильных и нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови этих лиц от момента облучения до 4050 лет после радиационного воздействия. Установлено, что частота дицентриков и центрических колец в лимфоцитах крови человека после острого облучения непрерывно снижается, следуя быстро и медленно спадающим компонентам в соотношении (90% на 10%), а частота транслокаций после первоначального снижения в течение 310 лет сохраняется на постоянном уровне до 3540 лет.
Практическая значимость. В работе обоснована возможность оперативного прогноза степени тяжести ОЛБ (от I до IV), основываясь на результатах анализа частоты дицентриков (от 5 до 500 диц/100 кл) в лимфоцитах крови человека непосредственно после общего аварийного облучения. По результатам работы предложены следующие практические рекомендации:
1. При исследовании закономерностей выхода двойных разрывов (ДР) путем анализа спектров индуцированных фрагментов ДНК, которые получены методом импульсного гель-электрофореза, необходимо учитывать фактор неслучайного распределения первичных повреждений по структуре ДНК за счет пространственной конфигурации хроматина в ядре клетки, что приводит к к возрастанию оценки числа ДР от 10% до 100% в зависимости от ЛПЭ.
2. При использовании метода Qdr в задачах ретроспективной биодозиметрии необходимо вносить поправку в показатель qdr. Если цитогенетический анализ выполнен в период от 1 года до 10 лет и более после облучения, то показатель qdr необходимо увеличить на 30%50%, чтобы правильно оценить поглощен-ную дозу.
3. В задачах ретроспективной биодозиметрии не следует использовать в качестве калибровочной кривой дозовую зависимость частоты транслокаций, полученную при облучении лимфоцитов крови in vitro, поскольку доза при этом будет существенно занижена. Дозовая кривая in vitro должна быть скорректирована с учётом снижения частоты транслокаций в лимфоцитах крови облучившихся лиц в отдаленном пострадиационном периоде.
Личный вклад соискателя. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследований, планировании, проведении экспериментов и анализе результатов. Диссертантом обоснованы актуальность, цели и задачи работы. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является опреде-ляющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследо-вания: от постановки задачи до публикации.
Основные положения, выносимые на защиту. В работе установлено, что:
-
спектр радиационно-индуцированных фрагментов ДНК, образующихся при воздействии тяжелых ионов, позволяет реконструировать организацию хроматина в ядре клетки на нуклеосомном и фибриллярном уровнях;
-
гипотеза о диффузионном механизме передачи сигнального объекта позволяет интерпретировать эффект "свидетеля" (bystander), наблюдаемый на клеточном уровне, и получить оценку массы сигнала менее 10 кДа;
-
после общего острого облучения человека частота транслокаций в лимфоцитах крови в отдаленном периоде сохраняется на уровне 12%18 % от первоначально индуцированной величины в течение 3540 лет;
-
in vitro дозовая зависимость частоты транслокаций не пригодна для ретро-спективной биодозиметрии, поскольку существенно занижает оценку дозы, и должна быть скорректирована с учетом пострадиационного снижения частоты транслокаций, которая наблюдается у облучившихся лиц.
Внедрение в практику. На основании полученных в работе результатов были предложены методы совершенствования ретроспективной биологической дозиметрии по цитогенетическим показателям. Эти методы внедрены и используются в практической деятельности Лаборатории радиационной гематологии и цитогенетики ФГУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна и Лаборатории молекулярной биологии Российского научного центра рентгенорадиологии Минздравсоцразвития России, что подтверждается соответствующими официальными актами о внедрении. Полученные результаты были использованы при выполнении совместных НИР с ФГУ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна, ИОГЕН РАН, в международных проектах, поддержанных CEC, INTAS и МНТЦ.
Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены и обсуждены на следующих научных конференциях: VII Совещание стран СНГ по микродозиметрии и школы «Фундаментальные и прикладные аспекты радиационных исследований», 1992, 15-20 ноября, Суздаль; 24-th Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, 4-8 Oct., 1992, Erfurt, Germany; 25-th Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, June 10-14, 1993, Stockholm University, Sweden; 26-th Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, 25-29 June, 1994, Amsterdam, The Netherlands; 11-th Symposium on Microdosimetry, 13-18 Sept. 1992, Gatlinburg, Tennessee, USA; Molecular Mechanisms of Environmental Mutagenesis and Cancer, August 20-25, 1994, Stockholm/Huddinge, Sweden; 10-th International Congress of Radiation Research Aug. 27- Sept. 1, 1995, Wurzburg, Germany; 12-th Symposium on Microdosimetry Sept. 29- Oct. 4, 1996, Oxford, UK; International Conference on Biodosimetry and 5-th International Symposium on ESR Dosimetry and Applications Obninsk-Moscow, June 22-26, 1998; 29-th Meeting of the European Society for Radiation Biology and the 9-th Meeting of the Italian Society for Radiation Research. Capri 3-7 Oct. 1998 ; International Conference Modern Problems of Radiobiology, Radioecology and Evolution dedicated to centenary of N.W. Timofeeff-Ressovsky, Sept. 6-9, 2000, Dubna 2000; Cospar Colloquium. Second International Workshop – Radiation Safety for Manned Mission to Mars. Sept. 29–Oct. 01, 2003, Dubna; 3rd Dosimetry workshop on the Semipalatinsk nuclear test site area and 10-th Hiroshima International Symposium, Hiroshima, 9-11 March, 2005; V съезд по радиационным исследованиям, Москва, 10-14 апреля, 2006; 7-th International Symposium on ESR Dosimetry and Applications 10-13 July 2006, Bethesda, Maryland, USA; 4-th International Workshop on Space Radiation Research and 17-th Annual NASA Space Radiation Health Investigators’ Dubna, 2006; III Международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», Дубна, 24-28 января 2007; Международная конференция «Новые направления в радиобиологии» Москва, 6-7 июня, 2007; BioDose-2008, Sept. 7-11, 2008, Dartmouth College, Hanover, NH, USA; 46-th Japan Science Workshop, 27-28 Nov., NIRS, Chiba, Japan; VI съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) Москва, 25-28 октября 2010; EPRBioDose 2010 Conference Mandelieu La Napoule (France) 10-14 October, 2010.
Диссертационная работа апробирована на научной конференции экспериментального радиологического сектора Учреждения Российской академии медицинских наук «Медицинский радиологический научный центр» РАМН, протокол № 255 от 10.11.2010 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 статьи в российских и зарубежных изданиях. Кроме того, результаты представлены в 44 тезисах докладов на научных конференциях.
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Первая глава посвящена обзору современного состояния проблемы, описанию используемых материалов и методов и постановке задачи. Во второй и последующих главах излагаются полученные результаты и проводится обсуждение результатов исследований. Диссертация содержит 287 страниц текста, 72 рисунка и 35 таблиц. Список литературы включает 355 наименований, среди них 41 работа на русском языке и 314 работ зарубежных авторов.
