Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Понятие инфекция 12
1.2. Современные представления о начальных этапах воспаления 14
1.2.1. Роль процесса фагоцитоза в развитии воспалительной реакции 16
1.2.2. Фагоциты макроорганизма и их рецепторный аппарат 17
1.2.3. Этапы процесса фагоцитоза бактерий 20
1.3. Цитокины и их основные свойства 24
1.3.1. Основные провоспалительные цитокины 27
1.3.2. Участие регуляторних цитокинов в воспалительной реакции 41
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1. Объекты исследования 43
2.2. Методы исследований 43
2.2.1. Микробиологические методы исследований 43
2.2.2. Выделение перитонеальных макрофагов и спленоцитов мышей 44
2.2.3. Моделирование процесса фагоцитоза in vitro и определение индекса завершенности 45
2.2.4. Оценка механизмов киллинга бактерий 46
2.2.5. Заражение экспериментальных животных 50
2.2.6. Биохимические методы исследования сыворотки крови 50
2.2.7. Методы определения цитокинов 55
2.2.8. Метод спекл-микроскопии 56
2.2.9. Статистическая обработка результатов 59
Глава 3. Изучение биологических свойств стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями 60
3.1. Характеристика бактерий рода. Staphylococcus 60
3.2. Изучение биологических особенностей стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями в монокультуре и в ассоциации 62
3.3. Оценка чувствительности выделенных стафилококков к антибиотикам 65
Глава 4. Особенности фагоцитоза in vitro стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, и индукции основных провоспалительных цитокинов 66
4.1. Изучение особенностей процесса фагоцитоза стафилококков in vitro в перитонеальных макрофагах мышей 66
4.2. Оценка цитокиновой активности перитонеальных макрофагов in vitro при фагоцитозе стафилококков 73
Глава 5. Оценка цитокинового статуса организма экспериментальных животных при разных способах заражения стафилококками и метаболического статуса при стафилококковой инфекции 75
5.1. Оценка цитокинового статуса организма экспериментальных животных при разных способах заражения стафилококками, выделенными от животных с острыми гнойными инфекциями 75
5.2. Оценка метаболического статуса организма экспериментальных животных при моделировании стафилококковой инфекции 82
Глава 6. Особенности фагоцитоза in vitro энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, и индукции основных провоспалительных цитокинов 86
6.1. Характеристика бактерий семейства Enterobacteriaceae 86
6.2. Изучение особенностей процесса фагоцитоза энтеробактерий in vitro в перитонеальных макрофагах мышей 89
6.3. Оценка цитокиновой активности перитонеальных макрофагов in vitro при фагоцитозе энтеробактерий 91
Глава 7. Оценка цитокинового статуса организма экспериментальных животных при разных способах заражения энтеробактериями 94
Глава 8. Оценка действия цитокинов и цитокинсодержащего материала ex tempore in vivo на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс методом спекл-микроскопии 101
8.1. Использование метода спекл-микроскопии в медико-биологических и экологических исследованиях 101
8.2. Действие провоспалительных цитокинов и цитокинсодержащего материала на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс 105
Заключение 109
Выводы 116
Список использованных литературных источников... 118
- Фагоциты макроорганизма и их рецепторный аппарат
- Оценка механизмов киллинга бактерий
- Изучение особенностей процесса фагоцитоза стафилококков in vitro в перитонеальных макрофагах мышей
- Оценка цитокинового статуса организма экспериментальных животных при разных способах заражения стафилококками, выделенными от животных с острыми гнойными инфекциями
Введение к работе
Актуальность темы. Изучение биологических особенностей возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных остается важнейшим аспектом современной прикладной микробиологии (Пюхлер, Хаккер, 2005; Vogt, Mahan, 1998). Принципиально важными представляются сведения о некоторых видах стафилококков и энтеробактерий, потенциально опасных или условных патогенов, вызывающих острые гнойные процессы в организме человека и животных, что определяет непреходящий интерес к этим микроорганизмам со стороны широкого круга микробиологов (Ляшенко, 1995; Бондаренко, 1997; Дерябин, 2000; Roth, James, 1998). Актуальность этой проблемы обусловлена также формированием устойчивости этих бактерий к широкому спектру антибиотиков и совершенствованием способности к существованию и развитию во внутренней среде макроорганизма (Обгольц, 1992; Бухарин, Дерябин, 1997; Тихомирова, 2005; McManus, 1997).
Известно, что в иммунном ответе на ряд инфекционных агентов огромную роль играют начальные этапы инфекционного процесса, связанные с фагоцитарной активностью и формированием острой фазы воспалительной реакции, опосредованной синтезом провоспалительных цитокинов (Маянский, Пику за, 1993; Сепиашвили, 2003; Фрейдлин, 2006; Agace, 1993). Традиционно неблагоприятное течение гнойно-воспалительного заболевания связывается со снижением уровня факторов естественной резистентности, нередко зависящих от способности возбудителя к их инактивации (Бухарин, Дерябин, 1996; Ефименко, 1999).
Развитие инфекционного процесса, особенно на начальных его этапах, во многом определяется активацией цитокиновой сети, для управления которой необходимо знание особенностей изменения цитокинового баланса при разных способах внедрения патогена в организм. Однако, сравнительные данные по индукции цитокинов при разных путях проникновения стафилококков и энтеробактерий в макроорганизм, а также воздействие провоспалительных
7 цитокинов ex tempore in vivo на микроциркуляцию крови практически не описаны.
Вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования. Цель работы: изучить активность механизмов фагоцитоза и индукцию цитокинов in vitro и in vivo при разных способах введения стафилококков и энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями. Задачи исследования:
1. Определить основные свойства стафилококков, выделенных в
монокультуре и в ассоциациях от животных с острыми гнойными инфекциями.
Изучить в условиях in vitro особенности фагоцитоза выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями стафилококков: Staphylococcus aureus 18, S. hyicus 12, S. epidermidis 6, S. saprophyticus 5, перитонеальными макрофагами белых мышей, активность механизмов кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга и индукцию основных провоспалительных цитокинов; продукцию оксида азота спленоцитами белых мышей.
Провести подкожное, внутримышечное и внутрибрюшинное заражение белых мышей стафилококками, выделенными от животных с острыми гнойными инфекциями: S. aureus 18, S. hyicus 12, S. epidermidis 6, S. saprophyticus 5, и определить содержание основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови; оценить активность некоторых ферментов белкового, углеводного и липидного обменов при моделировании стафилококковой инфекции.
Изучить в условиях in vitro особенности фагоцитоза энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями: Escherichia coli 34, Serratia sp. 3, Citrobacter sp. 1A, Enterobacter agglomerans 6, перитонеальными макрофагами белых мышей и индукцию основных провоспалительных цитокинов.
5. Провести подкожное и внутрибрюшинное заражение белых мышей
энтеробактериями, выделенными от животных с острыми гнойными
инфекциями: Е. coli 34, Serratia sp. 3, Citrobacter sp. 1A, E. agglomerans 6, и
8 определить содержание основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови.
6. Оценить действие ex tempore in vivo супернатанта среды культивирования перитонеальных макрофагов, фагоцитирующих S. aureus 18, и стандартных препаратов ИЛ-1а и ФНО-а на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс методом спекл-микроскопии.
Научная новизна. Установлено, что среди стафилококков, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, в монокультуре чаще всего встречались S. aureus и S. hyicus, реже - S. epidermidis и S. saprophytics; ассоциации были представлены преимущественно S. aureus и S. saprophytics.
Выявлено, что процесс фагоцитоза S. saprophytics 5 и Е. coli 34 в перитонеальных макрофагах белых мышей in vitro завершался к 24 часам; фагоцитоз других исследуемых бактерий носил частичный или незавершенный характер. Показано достоверное увеличение активности ферментов кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга, активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах и синтеза оксида азота спленоцитами мышей в процессе фагоцитоза S. aureus 18 в системе in vitro.
Впервые проведена оценка влияния стафилококков и энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, на содержание основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови лабораторных белых мышей при разных способах их заражения. Выявлено, что при внутрибрюшинном введении бактерий резко возрастает содержание основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови мышей через 6-24 часа, особенно при введении S. aureus 18 и Е. coli 34. При подкожном и внутримышечном введении этих бактерий изменения концентрации цитокинов были достоверными, но менее выраженными.
При моделировании стафилококковой инфекции выявлены изменения метаболической активности организма экспериментальных животных, свидетельствующие о большей эффективности защитных реакций в случае
9 введения S. saprophyticiis 5 и менее скомпенсированном характере патологических изменений в случае заражения S. aureus 18.
Впервые методом спекл-микроскопии показано ex tempore in vivo усиление скорости кровотока в сосудах брыжейки белых крыс при нанесении супернатанта среды культивирования перитонеальных макрофагов, фагоцитирующих бактерии S. aureus 18, и стандартных препаратов ИЛ-1а и ФНО-а.
Практическая значимость работы. Полученные результаты имеют значение для расширения представлений о начальных этапах воспалительной реакции, вызванной возбудителями гнойных инфекций животных при разных путях их внедрения в макроорганизм. Содержащиеся в диссертационной работе данные могут быть использованы для дальнейших разработок в области изучения взаимодействия макро- и микроорганизмов. Показана возможность применения метода спекл-микроскопии для оценки действия различных цитокинов ex tempore in vivo на микроциркуляцию крови в исследовательской и диагностической медико-биологической практике.
Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций общих и специальных курсов студентам кафедры микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского и кафедры экологии Саратовского государственного технического университета.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Из выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями стафилококков и энтеробактерий наиболее активно фагоцитируются в условиях in vitro перитонеальными макрофагами белых мышей S. saprophyticus 5 и Е. coli 34. В процессе фагоцитоза S. aureus 18 происходит достоверное увеличение активности ферментов кислородзависимого и кислороднезависимого киллинга, образования активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах и синтеза оксида азота спленоцитами мышей.
2. При моделировании инфекции изменения цитокинового статуса
организма экспериментальных животных зависят от способа заражения:
внутрибрюшинное введение бактерий вызывает резкое увеличение содержания
основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови мышей через 6-24
часа, особенно при заражении S. aureus 18 и Е. coli 34. При подкожном и
внутримышечном введении изменения концентрации цитокинов достоверные,
но менее выраженные.
3. Метод спекл-микроскопии позволяет оценить действие цитокинов и
цитокинсодержащего материала ex tempore in vivo на микроциркуляцию крови в
сосудах брыжейки белых крыс.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на: Восьмой Общероссийской научной конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Москва, 2007); Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2007); Заочной конференции Российской Академии Естествознания «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (Москва 2007); Международной школе для студентов и молодых учёных по оптике, лазерной физике и биофизике Saratov Fall Meeting (Саратов, СГУ им. Чернышевского, 2007); Четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008); Х-ХИ Всероссийских Форумах с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006-2009).
Работа выполнена в рамках НИР Государственного научного учреждения
Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция
Россельхозакадемии «Изучение влияния ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов на возникновение заболеваний животных»; частично поддержана грантом № 45434 в рамках ведомственной научной программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (2006); а также в рамках НИР Федерального агентства по образованию № 1.4.09. «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и
разработка когерентно-оптических и спектральных методов медицинской диагностики и фототерапии» (2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 5 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Фагоциты макроорганизма и их рецепторный аппарат
К фагоцитам относят два типа дифференцированных клеток — полиморфноядерные нейтрофильные лейкоциты (нейтрофилы), являющиеся микрофагами, и моноциты/макрофаги, составляющие систему мононуклеарных фагоцитов (Хаитов, Игнатьева, Сидорович, 2000; Ройт, Бростофф, Мейл, 2000).
Первыми на антигены, проникшие в организм или собственного организма, реагируют нейтрофильные лейкоциты, которые по определению И.И. Мечникова (1892) «являются наиболее деятельными клетками организма». Не менее важная роль в осуществлении фагоцитоза принадлежит мононуклеарной фагоцитарной системе, которая включает моноциты мозга и крови, свободные и фиксированные тканевые макрофаги (Фрейдлин, 1984; Тотолян, 2000).
Полиморфноядерные нейтрофильные лейкоциты (нейтрофилы) -короткоживущие (2-3 суток) клетки, составляющие 60-70% общего числа лейкоцитов крови. Основная их масса циркулирует в крови. Как и моноциты, они способны прилипать к эндотелиальным клеткам, выстилающим кровеносные сосуды и покидать кровоток, протискиваясь между эндотелиальными клетками. Главная функция этих клеток - фагоцитоз, но, в отличие от многократно фагоцитирующих макрофагов, нейтрофил может совершать свою эффекторную функцию один раз, после чего он обычно гибнет. При этом нейтрофильные гранулоциты не обладают какой-либо «врожденной» специфичностью, но им принадлежит важнейшая роль в острой защитной воспалительной реакции на инфекцию (Рудик, Тихомирова, 2006).
Система мононуклеарных фагоцитов - это, прежде всего, монобласты и промоноциты, моноциты и макрофаги костного мозга, пролиферация и дифференцировка которых находятся под влиянием ряда последовательно действующих цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-1, ИЛ-3, гранулоцитарного-макрофагального колониестимулирующого фактора (ГМ-КСФ)), моноциты периферической крови (Зайчик, Чурилов, 2001).
Клетки в этой системе в функциональном отношении относят к двум типам: 1. «Профессиональные» макрофаги, главная функция которых -утилизация и уничтожение антигенов, микроорганизмов, продуктов распада собственных клеток организма. Чужеродный материал относительно успешно распознается, в том числе, благодаря отсутствию маркеров главного комплекса гистосовместимости. Распознавание собственного клеточного материала, подлежащего удалению, осуществляется посредством презентации клеткой-мишенью на мембране специальных лигандов, то есть происходит своеобразный вариант программируемой гибели (Krieser, White, 2002). Путем фагоцитоза могут удаляться инфицированные и стареющие клетки, а также клетки опухолей (Участие сиалосвязывающих..., 2005; Хаитов, Манько, 2005). 2. Антигенпрезентирующие клетки, чьей основной ролью является презентация антигена иммунокомпетентным клеткам. Это клетки Лангерганса в коже, интердигитирующие клетки тимуса и лимфоузлов, фолликулярные дендритические клетки герминативных центров. Помимо фагоцитоза, они специализированы на взаимодействии с лимфоцитами, обладают экспрессией белков главного комплекса гистосовместимости не только первого, но и второго класса, осуществляют процессинг антигенов и их презентацию и выделяют клеточно-специфические хемоаттрактивные пептиды. Кроме фагоцитоза и антигенпредставления, макрофаги участвуют в регуляции иммунного ответа (Ройт, Бростофф, Мейл, 2000; Тотолян, Фрейдлин, 2000; Галактионов, 2004). Макрофаги и моноциты способны секретировать более 100 различных молекул, которые выполняют как регуляторные, так и эффекторные функции (табл. 1). Большая часть продуктов секретируется индуцибельно. Важнейшими продуктами синтеза макрофагов, моноцитов являются провоспалительные и противовоспалительные цитокины. Открытие цитокин-обусловленной сигнальной системы, обеспечивающей взаимообмен информацией между клетками макроорганизма, что позволило расшифровать и объяснить многие феномены, следует считать крупнейшим достижением последних лет (Белобородова, Осипов, 1999).
Рецепторы, запускающие реакции естественного иммунитета, в том числе посредством выработки разнообразных цитокинов, распознают химические структуры или группы структур, не свойственные нормальным клеткам данного организма. Это, в первую очередь, бактериальные липополисахариды (ЛПС) и пептидогликаны (Manthey, Vogel, 1994; Rietschel, Kirikae, 1994), а также другие бактериальные модули ны, например, экзотоксины, порины, липид А -связанные протеины, белки теплового шока, чье активное изучение идет в научном мире последних лет (Hogan, Vogel, 1987; Retzlaff, Yamamoto, 1994; Hedges, Svanborg, 1995).
Рецепторный аппарат моноцитов и макрофагов очень разнообразен, и принимает участие в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки, адгезии, фагоцитоза, миграции, активации и цитотоксичности (табл. 2).
Оценка механизмов киллинга бактерий
Определение активности щелочной фосфатазы проводили с помощью набора реагентов «ДиахимЦитоСтейн-ЩФ» по методу одновременного азосочетания (Шубич, 1965; Kaplow, 1955). Принцип метода заключается в расщеплении щелочной фосфатазой а-нафтилфосфата с освобождением а-нафтола, образующего с солями диазония нерастворимый коричневый осадок в местах локализации фермента.
Мазки инкубировали в субстратной смеси (а-нафтилфосфат натрия растворяли в 0,05 М пропандиоловом буфере и добавляли прочный синий) в течение 10 минут. После инкубации мазки промывали проточной водой 10 минут и докрашивали 2% раствором метилового зеленого в течение 15 минут. Выявляли микроскопически коричневый продукт реакции в цитоплазме клеток.
Определение активности кислой фосфатазы Определение активности кислой фосфатазы проводили методом азосочетания Бернстона с помощью набора реагентов «ДиахимЦитоСтейн-КФ» (Бернстон, 1965). Цитохимическое выявление этого фермента основано на образовании нерастворимого окрашенного преципитата в местах гидролиза субстрата, катализируемого кислой фосфатазой. Сухие мазки помещали в емкость Коплина и заливали свежеприготовленным рабочим раствором, состоящим из раствора А (нафтол-AS-фосфат в диметилформамиде и холодный ацетатный буфер) и раствора Б (парарозанилин и азотистокислый натрий). Инкубировали 2 часа при 37 С. После инкубации мазки промывали дистиллированной водой и докрашивали гематоксилином Майера в течение 15 минут, промывали, высушивали и микроскопировали. Активность кислой фосфатазы выявляли по наличию и количеству гранул красного цвета в цитоплазме клеток. Определение содержания катионных белков Определение содержания катионных белков проводили методом с бромфеноловым синим (Шубин, 1974). Принцип метода заключается в избирательной окраске катионных беков красителем бромфеноловым синим. Мазки окрашивали 0,1 % раствором бромфенолового синего в боратном буфере в течение 2 минут. Промывали в трех сменах 0,05 М боратного буфера. Высушивали и докрашивали 1% раствором сафранина в течение 30-60 секунд, микроскопировали. Катионные белки выявлялись в цитоплазме клеток в виде синих гранул. Кислородзависимый киллинг бактерий оценивали по определению активности миелопероксидазы, NO-синтетазы и при постановке теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-теста). Определение активности миелопероксидазы Определение активности миелопероксидазы проводили с помощью набора реагентов «ДиахимЦитоСтейн-МПО» методом Грэхема-Кнолля. На мазки-препараты наливали рабочий раствор (бензидин растворяли в 3 мл спирта, доливали 2 мл дистиллированной воды) с добавленной в него 3% перекисью водорода на 15 минут при комнатной температуре. Затем мазки промывали дистиллированной водой, высушивали и докрашивали 0,5% раствором по Романовскому в течение 15 минут, после чего промывали проточной водой, высушивали и микроскопировали. Миелопероксидаза представляет собой фермент - лизосомальную каталазу, обеспечивающую в присутствие перекиси водорода в клетке окисление различных субстратов. Выявляли присутствие миелопероксидазы в цитоплазме клеток наличием коричневых гранул окисленного бензидина (Саидов, Пинегин, 1991; Долгушин, Бухарин, 2001; Арнхольд, 2004). На основе результатов всех исследований рассчитывали средний цитохимический коэффициент с использованием полуколичественного метода оценки по Астальди-Верга, основанного на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски в каждой клетке (Astaldi, Verga, 1957). Определение оксида азота Продукцию оксида азота спленоцитами определяли методом Грисса по накоплению в инкубационной среде ионов NO2- Метод основан на развитие окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в реактив Грисса (Grees, Wagner, Glogowsky, 1982). Проводили выделение спленоцитов по стандартной методике (Кондратьева, Воробьёва, Буракова, 2001). В лунки планшета для иммунологических реакций вносили 180 мкл взвеси спленоцитов в среде 199 в концентрации 10 клеток/мл и 20 мкл суточной культуры бактерий S. aureus 18 и S. saprophytics 5, приготовленные по оптическому стандарту мутности № 5 (ГИСК им. Л. А. Тарасевича, 2002). В качестве контроля использовали взвесь спленоцитов без бактерий. Инкубировали 48 часов при 37 С. Надосадочную культуральную жидкость в объеме 100 мкл вносили в лунки нового иммунологического планшета. В те же лунки вносили 100 мкл реактива Грисса и выдерживали 15 минут. Оптическую плотность проб измеряли при 540 нм в 96-луночном планшете на приборе Multiscan МСС 340 (принцип действия - вертикальная фотометрия). Для определения содержания в инкубационной среде ионов N02" использовали график, который был построен по данным оптической плотности различных концентраций NaN02 Постановка теста восстановления нитросинего тетразоля
Изучение образования активных форм кислорода (АФК) при «респираторном взрыве» в процессе кислородзависимого киллинга бактерий перитонеальными макрофагами проводили постановкой теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ). Сущность метода состоит в том, что НСТ в присутствии АФК окрашивается в синий цвет вследствие образования нерастворимых гранул диформазана, по интенсивности накопления которых можно судить о фагоцитарной и метаболической активности фагоцитов (Нагоев, 1983; Маянский, Пикуза, 1993; Тотолян, Фрейдлин, 2000). При постановке теста в лунки 96-луночного иммунологического планшета вносили 100 мкл взвеси ПМФ в среде 199 и 80 мкл 0,2 % раствора нитросинего тетразолия на 0,1М Na, К-фосфатном буфере. Содержимое лунок перемешивали пипеткой, затем инкубировали в термостате при 37С 15 мин, затем при комнатной температуре еще 15 мин. После инкубации из содержимого каждой лунки готовили препараты-мазки на чистых обезжиренных предметных стеклах, высушивали, фиксировали смесью Никифорова в течение 20 мин и докрашивали 0,1 % раствором сафранина Т в течение 5 минут (Бажора, Тимошевский, Протченко 1981; Долгушин, Бухарин, 2001).
Изучение особенностей процесса фагоцитоза стафилококков in vitro в перитонеальных макрофагах мышей
Кислая фосфатаза является гидролитическим ферментом с оптимумом действия рН 5,2. Она содержится в первичных, или азурофильных гранулах. Кислая фосфатаза включает ряд изоферментов, обладающих общим свойством - способностью освобождать фосфат из спиртовых или фенольных фосфомоноэфиров в кислой среде (Шубич, Нестерова, 1980).
Активность кислой фосфатазы в нашем эксперименте в 1,5 раза увеличивалась к 3 часам фагоцитоза по сравнению с исходным уровнем, и значительно снижалась к 6 часам процесса.
Щелочная фосфатаза относится к группе гидролитических ферментов с оптимумом действия при рН 9,6. Она осуществляет гидролиз однозамещенных эфиров ортофосфата. Щелочная фосфатаза содержится во вторичных (специфических) гранулах цитоплазмы (Шубич, 1965; Kaplow, 1955).
Полученные данные показали, что наибольшая активность данного фермента была зарегистрирована к 6 часам процесса фагоцитоза, вдвое превышая исходный уровень до начала фагоцитоза. Неферментные катионные белки локализованы в лизосомах. Они осуществляют бактерицидное действие, являясь медиаторами воспаления (Мазинг, Старосельская, 1981). Определение катионных белков позволяет судить об активности кислороднезависимого киллинга бактерий в фагоцитирующих клетках (Сепиашвили, 2002). Наибольшее содержание катионных белков в ПМФ было отмечено через 1 час процесса фагоцитоза, которое в дальнейшем снижалось к 3 часам до исходного уровня. На рисунке 2-А представлена динамика активности ферментов кислороднезависимого киллинга в процессе фагоцитоза макрофагами микробных клеток S. aureus 18. Оценка кислородзависимых механизмов киллинга стафилококков в перитонеальных макрофагах и спленоцитах При кислородзависимом киллинге происходит окисление кислорода НАДФ-Н-оксидазной системой, в результате чего образуются активные формы кислорода, оказывающие сильное микробоцидное действие (Хаитов, Пинегин, 1995). Важнейшим ферментом кислородзависимого аппарата фагоцитирующих клеток является миелопероксидаза (МПО), которая вместе с НАДФ-Н-оксидазой участвует в процессах образования активных форм кислорода и в окислении биологического материала (Долгушин, Бухарин, 2001; Арнхольд, 2004). Нами была изучена активность миелопероксидазы через 1, 3 и 6 часов процесса фагоцитоза перитонеальными макрофагами микробных клеток S. aureus 18. Графическая зависимость активности МПО от времени фагоцитоза представлена на рисунке 2-Б. Установлено достоверное увеличение активности МПО уже к 1 часу инкубирования макрофагов с бактериями. Наибольшая активность фермента наблюдалась к 6 часам фагоцитоза. Для оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма принято использовать НСТ-тест, дающий возможность судить о фагоцитарной и метаболической активности фагоцитирующих клеток по образованию в цитоплазме нерастворимых синих гранул формазана. Активность этого процесса отражает состояние бактерицидных пероксидазных систем (Гордиенко, 1983). Для определения содержания активных форм кислорода в ПМФ использовали спонтанный и индуцированный бактериальными клетками S. aureus 18 и S. saprophytics 5 варианты НСТ-теста (табл. 10). Установлено, что содержание АФК в макрофагах при индуцированном бактериями S. aureus 18 варианте НСТ-теста в 1,4 раза выше, чем при спонтанном, достоверно повышалось оно и при фагоцитозе S. saprophytics 5. Полученные данные свидетельствуют об увеличении активности «кислородного взрыва» в фагоцитах. К настоящему времени показана важность исследования продукции оксида азота в фагоцитирующих клетках. Оксид азота вовлекается в неспецифический иммунитет в качестве важного медиатора воспалительного процесса и апоптоза. Его цитотоксическое действие усиливается, благодаря способности вступать в реакцию с супероксидным радикалом, образуя пероксинитрит (Сахно, Леплина, Норкин, 2000; Ковальчук, Хараева, 2003; Саникидзе, Тхилава, Папави, 2006; Chemoprevenyion with..., 2009). Контролем в наших исследованиях являлась концентрация N02 —, продуцируемая спленоцитами в норме, без добавления бактериальной взвеси. Она составляла 12,4±1,2 мкМ. При фагоцитозе бактерий S. aureus 18 продукция оксида азота спленоцитами мышей увеличивалась в 1,4 раза и составила 17,3±0,3 мкМ. Повышение содержания оксида азота в культуральной среде при фагоцитозе S. saprophytics 5 было недостоверным (см. табл. 10). Таким образом, было установлено увеличение через 1-3 часа фагоцитоза S. aureus 18 в макрофагах активности кислой фосфатазы и содержания катионных белков в 1,5 раза; к 6 часам процесса — двукратное увеличение активности щелочной фосфатазы, что свидетельствует об активации механизмов кислороднезависимого киллинга в фагоцитирующих клетках.
Активность миелопероксидазы достоверно увеличивалась к 1 часу инкубации. Бактерии S. aureus 18 вызывали выраженное увеличение содержания активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах и продукции NO2- спленоцитами по сравнению с влиянием S. saprophyticus 5. Такие отличия в активации механизмов кислородзависимого киллинга изучаемыми бактериями связано, вероятно, с наличие у золотистого стафилококка более совершенных факторов патогенности.
Оценка цитокинового статуса организма экспериментальных животных при разных способах заражения стафилококками, выделенными от животных с острыми гнойными инфекциями
Представители семейства распространены в составе микрофлоры человека и животных, в почве, в воде. Многие из них подвижны, благодаря наличию перитрихально расположенных жгутиков, имеют капсулу или микрокапсулу. Обладают выраженной ферментативной активностью, спор не образуют. Вызывают: 1- кишечные инфекции, возбудителями которых чаще всего являются представители родов Salmonella, Shigella, Yersinia, Escherichia, характеризующиеся фекально-оральным или оральным механизмом заражения и водным, пищевым или контактно-бытовым путями передачи; 2- некишечные, оппортунистические инфекции, возбудителями которых бывают условно-патогенные бактерии родов Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Serratia. Общими антигенами всех энтеробактерий являются: соматический О-антиген (липополисахарид), капсульный К-антиген (протеин или полисахарид) и Н-антиген (жгутиковый, белковый) (Борисов, 2002).
Эшерихии относятся к типовому роду семейства Escherichia (типовой вид Е. coli). Встречаются в кишечнике почти всех видов млекопитающих, птиц, рыб и рептилий, а так же в воде, почве и других объектах окружающей среды. Какие-либо морфологические особенности между патогенными и непатогенными кишечными палочками не обнаружены. Их дифференцировка основана на различиях в структуре поверхностных антигенов, среди которых выделяют липополисахаридные (О), жгутиковые (Н) и капсульные полисахаридные (К) антигены (Покровский, 2002).
Патогенные свойства у эшерихий обуславливаются комплексом факторов: наличием эндотоксина, выработкой экзотоксинов, гемолизина, адгезией и выделением колицинов (Ветеринарная микробиология и иммунология, 1991).
Патогенные Е. coli вызывают кишечные инфекции, поражения мочевыводящих путей, бактериемии, маститы и др. Кишечные инфекции (коли-инфекции) вызываются диареегенными Е. coli. Основной механизм распространения диареегенных эшерихий - фекально-оральный, наиболее часто заражение происходит при употреблении контаминированной пищи, воды, а также при контактах с инфицированными животными (Коротяев, Бабичев, 2002).
Уропатогенные эшерихий вызывают около 90% банальных поражений. Бактерии проникают в уретру, затем в мочевой пузырь, прикрепляются к поверхности переходного эпителия и активно размножаются. Зачастую эшерихий являются возбудителями колимаститов (Ветеринарная микробиология и иммунология, 1991; Покровский, 2002).
До 50-х гг. Е. coli редко выделяли из крови, подобные случаи рассматривали как казуистические. Однако постепенно кишечная палочка вытеснила грамположительные бактерии, и на сегодняшний день Е. coli составляет одну из основных причин бактериемии (17-35%). Основные возбудители (по частоте выделения) бактерии серогрупп 06, 04, 02, 016, 018, 07, 01 и 075 (Ляшенко, 1995).
Цитробактеры относятся к роду Citrobacter (типовой вид — С. freundii). Бактерии этого рода выделяются из воды, почвы, фекалий животных и человека. Некоторые виды, очевидно, входят в состав нормальной кишечной микрофлоры. Большинство цитробактеров не патогенны, но бактерии некоторых серогрупп (03-08, 012 и других) способны вызвать вспышки гастроэнтеритов и пищевых токсикоинфекций. Согласно последним данным, цитробактеры - частые возбудители оппортунистических инфекций. Механизмы передачи возбудителя - фекально-оральный и контактный. На сегодняшний день приобрели значимость поражения цитробактерами желче- и мочевыводящих путей, отмечены также бактериемии, эндокардиты и поражения дыхательных путей, вызываемые С. diversus. Патогенез поражений плохо изучен. Предположительно, основными факторами патогенности цитробактеров являются микроворсинки, жгутики (как факторы инвазивности), эндотоксин и поверхностный белок адгезии (Покровский, 2002).
Серрации объединены в род Serratia (типовой вид - S. marcescens). Бактерии широко распространены в окружающей среде, встречаются в почве, воде, воздухе, испражнениях млекопитающих и других животных, а так же насекомых (Кучерук, 1974). Серрации, особенно S. marcescens, ранее считали непатогенными. Позднее выяснилось, что экология S. marcescens аналогична таковой у Pseudomonas aeruginosa, была установлена способность серрации вызывать бактериемии, пневмонии, инфекции мочевыводящих путей и кожных покровов (Коротяев, Бабичев, 2000).
Факторы патогенности изучены плохо. Ими могут быть фимбрии, гемагглютинины. У серрации описаны гемолизины, ассоциированные с клеточной стенкой (высвобождаются в окружающую среду). Гемолизины обычно присутствуют у изолятов, колонизирующих почечную ткань. Определённый вклад вносит сидерофорная система (представлена энтеробактином, реже - аэробактином), обусловливающая поглощение ионов Fe2+ из крови и тканей. Внеклеточные протеазы вызывают появление кровоизлияний на коже и слизистых оболочках, поражения глаз и развитие экспериментальных пневмоний (Медицинская микробиология, 2000).
Биологические характеристики серрации по основным свойствам соответствуют таковым у прочих энтеробактерий. Выделяемые серрации, не идентифицированные по полной схеме, относят к Serratia sp (Покровский, 2002). Энтеробактеры - подвижные грамотрицательные палочки с перитрихально расположенными жгутиками. Род Enterohacter относится к трибе Klebsielleae и делится на 2 группы: 1-я включает виды, широко распространенные в природе (10 видов); 2-я группа включает виды, имеющие медицинское и ветеринарное значение - Е. cloaceae, Е. sakazakii Е. agglomerans, Е. gergoviae. Энтеробактерная инфекция — обычно острое заболевание, характеризующееся поражением различных органов и систем (желудочно-кишечный тракт, мочевыделительная, желчевыводящая, центральная нервная системы). Источник инфекции - человек и животные, механизм передачи -фекально-оральный, контактный (Борисов, 2002).
При различных состояниях, сопровождающихся ослаблением резистентности макроорганизма, представители семейства Enterobacteriaceae могут составлять до 80% клинических изолятов всех грамотрицательных бактерий. В связи с этим, было интересным изучить особенности фагоцитоза энтеробактерий, выделенных от животных с острыми гнойными инфекциями, и оценить цитокиновый статус лабораторных мышей при разных способах введения бактерий Е. со И 34, Serratia sp. 3, Citrobacter sp. 1 A, E. agglomerans 6.
