Введение к работе
Актуальность проблемы
Введение в России в 1959 г планомерной массовой иммунизации детей дифтерийным анатоксином привело к значительному снижению заболеваемости дифтерией Так, если в 1958 г показатель заболеваемости на 100 тысяч населения (ПЗ) составил 68,0, то к 1975 г он снизился до спорадического уровня (ПЗ 0,03) Однако в следующие два десятилетия вновь зарегистрированы эпидемические подъемы В 80-е годы на фоне продолжения массовой вакцинопрофилактиют дифтерии наблюдалась интенсификация эпидемического процесса в 1983-1985 г г с максимальным ПЗ 0,93 в 1984 і (Маркина С С и др , 1989, Максимова Н М и др , 2003)
В 90-с годы распространение дифтерийной инфекции в России приобрело характер эпидемии с пиком в 1994 г, когда ПЗ составил 26,9 Благодаря расширению масштабов иммунизации детей и взрослых, контролю за состоянием антитоксического иммунитета населения и своевременному проведению мероприяшй по его коррекции, повышению качества клинической и лабораторной диагностики, а также совершенствованию методов лечения дифтерии произошло снижение уровня заболеваемости этой инфекции К 2003-2004 г г ПЗ снизились до 0,48 - 0,35 соответственно, к 2005 - 2006 г г - до 0,35 - 0,12 соответственно Вместе с тем, среди непривитых, по-прежнему, регистрируются тяжелые формы заболевания и летальные исходы, что указывает на скрытое протекание эпидемического процесса, который поддерживается, главным образом, за счет носительства токсигенных Corynebaciermm diphtheritic и леїких форм заболевания у привитых (Маркина С С и др , 1993, 1996, 2000, 2002, 2005, 2006)
Исследованиями российских и зарубежных ученых установлены основные причины поддержания эпидпроцесса дифтерии 1) антитоксический поствакцинальный противодифтерийный иммунитет, предотвращая летальные исходы и тяжелые формы заболевания, не препятствует носительству
токсигенных С diphtheriae (Фаворова Л А и др , 1988, Костюкова Н Н , 1991, 1999, Шмелева ЕЛ и др , 2002, 2005, Маркина С С и др , 2005 2006), 2) массовая вакцинопрофилактика дифтерии не привела к ослаблению вирулентных свойств возбудителя этой инфекции (Костюкова НН, 1967, Черкасова ВВ, 1988, Мазурова ИК, 1993, Платонова ТВ, 1991, Борисова ОЮ , 1999), 3) высокая гетерогенность вида С diphtheriae по биологическим свойствам способствует формированию популяции со сложной клональной структурой, что облегчает адаптацию возбудителя к постоянно меняющимся условиям сущееівования (Крылова М Д , 1976, Тренин С А , 1986, Eralrdtiou А , et al, 1995, Popovic Т , et al, 1996, 2000, Titov L P , et al, 2003, Мельников В Г и др , 2004, Мазурова И К , 1996, 2006)
Указанные причины определяют трудности борьбы с дифтерией на современном этапе и невозможность эрадикации ее возбудителя с помощью существующих средств вакцинопрофилактики Поэтому важным компонентом системы эпидемиологического надзора за дифтерийной инфекцией является наблюдение за циркулирующими штаммами С diphtheriae (Фаворова Л А и др, 1981, 1988, Мазурова И К и др , 1993, 1998, Максимова Н М и др 2002)
Современные молекулярно-биологические технологии расширили возможности исследователей по изучению возбудителей инфекционных заболеваний, тк позволяют наблюдать за формированием микробных популяций, выявлять возможную эволюционную изменчивость бактерий, а также оценивать и прогнозировать тяжесть эпидемического и инфекционного процессов (Шагинян И А , 2000, Versalovic J , et al, 2002, Tarasevich I V , et al, 2003, Мазурова И К и др , 2005)
Представлялось актуальным использовать методический прием, включающий классические микробиологические и молскулярно-генетические методы исследования, при мониторинге С diphtheriae в динамике эпидемического процесса
Цель исследования
Научное обоснование системы комплексного микробиологического и молекулярно-гснетичсского мониторинга возбудителя дифтерийной инфекции и установление особенностей его распространения в условиях высокой и низкой интенсивности эпидемического процесса
Задачи исследования
Провести молекулярно-генетическое типирование (риботнпирование, энзимтипирование) токсигенных и нетоксигенных штаммов С diphtheriae, выделенных в России в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции
Разработать ускоренный метод типирования С diphtheriae, основанный на технологии полимеразной цепной реакции
Изучить с помощью метода секвенирования структуру генов tox и dtxR, ответственных за синтез дифтерийного токсина - основного фактора патогенності! возбудителя дифтерии
Провести наблюдение за распространением токешенных и нетоксигенных штаммов С diphtheriae основных биоваров на территории России
Сформировать базу данных по риботипам С diphtheriae, выделенных в России
Научная новизна
Получены новые сведения по фенотипической и генотипической характеристике С diphtheriae, свидетельствующие о клоналыюм распространении штаммов возбудителя дифтерии в период последней эпидемии в 90-е годы XX века Формирование эпидемической клональной группы штаммов, установленное в динамике наблюдения, началось за несколько лет до повышения показателей заболеваемости дифтерией, что
явилось предвестником осложнения эпидемиологической ситуации В период эпидемического подъема эти штаммы доминировали в популяции и были распространены на всей территории России Доминирующие штаммы характеризовались высоким уровнем токсинообразовапия, относились к биовару gravis, энзимтипам комплекса 8, риботипам 'Sankt-Peterburg/Rossija', отличались по структуре гена дифтерийного токсина (tot) и регуляторного гена dtxR от недоминирующих штаммов, все штаммы доминирующей клоналышй группы имели мутационные изменения в регуляторном гене dtxR в положении 440 (замена нуклеотида С на Т), что, вероятно, привело r повышению уровня токсинообразовапия При снижении показателей заболеваемости популяция возбудителя дифтерии длительное время сохраняет гомогенную структуру, что обусловлено широким распространением доминирующих штаммов В условиях низкой интенсивности эпидемического процесса (80-е годы XX века) популяция возбудителя дифтерии гетерогенна по штаммовому составу (биоварам, риботипам, энзимтипам)
Впервые выявлена мутация в гене tox в положении 1252 (замена нуклеотида G на С), приводящая к изменению домена R фрагмента В дифтерийного токсина, ответственного за первичное взаимодействие токсина с рецепторами чувствительной эукариотической клетки Полученные данные опровергают сложившееся представление о невозможности генетических изменений гена дифтерийного токсина, приводящих к изменению структуры дифтерийного токсина - основного фактора патогенности возбудителя дифтерии
Получены новые данные, свидетельствующие об участии нетоксигенных штаммов в формировании популяции возбудителя дифтерии выявлена взаимосвязь процессов циркуляции токсигениых и нетоксигенных штаммов С diphthenae, филогенетическая связь между ними, обусловленная общностью генов рРНК и регуляторного гена dtxR, показана способность нетоксигенных
штаммов, выделенных в современный период, приобретать ген дифтерийного токсина
Теоретическая значимость
Устновлепные особенности формирования популяции возбудителя дифтерии, внутривидовое разнообразие С diphtheiiae по признаку токсигенности, биоварам, риботипам, энзимтипам и аллельным вариантам по генам tox и dtxR. ответственным за токсинообразованис, являются теоретическим обоснованием невозможности полного искоренения (эрадикации) возбудителя дифтерии вследствие его высокой жизнеспособности
Новые сведения об изменчивости генов tox и dtxR, контролирующих структуру и функцию дифтерийного токсина, указывающие в ряде случаев на несоответствия структуры этих генов у циркулирующих штаммов и вакцинного штамма Park Williams 8, в дальнейшем, при накоплении подобных фактов, помогут объяснить причину заболевания правильно привитых лиц и теоретически обосновать новые подходы к совершенствованию вакцинопрофилактики при дифтерии
Практическая значимость
С помощью усовершенствованной системы мониторинга возбудителя дифтерии, включающей комплекс микробиологических, биохимических и молекулярно-генетических методов исследования уточнены механизмы формирования популяции возбудителя дифтерии в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции Полученные результаты позволяют повысить эффективность микробиологического мониторинга при сосіавлении более точных прогнозов развития эпидемического процесса
Учитывая, что негоксигенпые С diphthenae могут оказывать влияние на формирование популяции возбудителя дифтерии, целесообразно проводить наблюдение за нетоксигенными штаммами в специализированных центрах и
научно-исследовательских институтах, изучающих проблему дифтерии Установление механизма блокирования продукции дифтерийного токсина у нетоксигенных токснесущих штаммов риботипа 'Moskva' позволило разработать метод дифференциации нетоксигенных токснесущих штаммов С diphthenae от «истинно» токсигснных штаммов (защищено патентом № 2209831)
Пополнена уникальная, единственная в мире коллекция штаммов С
diphthenae, выделенных в России, которая включена в единую
информационную систему «Генетические и биологические (юолоіические и
ботанические) коллекции Российской Федерации
(http //www scvin ui/colleetions/index html) Включение коллекции в единый реестр расширяет возможности ученых России и всего мира по исследованию возбудителя дифтерии с целью создания новых препаратов и биотехнологий, направленных на совершенствование лабораторной диагностики и средств иммунопрофилактики дифтерии
Созданная база данных по риботипам С diphthenae позволяет проводить сравнительные исследования генетической структуры штаммов С diphthenae с целью регистрации новых, ранее не циркулировавших штаммов, и наблюдать за их распространением Штаммы риботипов С diphthenae, выделенных в России, включены в коллекцию Федеральной референс лаборатории по диагностике дифтерийной инфекции МНИИЭМ им Г Н Габричевского Штаммы риботипов 'Sankt-Peterburg', 'Rossya', 'Vladimir', 'Kaliningrad' и 'Moskva', впервые зарегистрированные в России, представлены в Международную базу данных риботипов С diphthenae в Институте Пастера (Париж)
Апробация работы
Диссертация обсуждена и одобрена на заседании Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им Г Н Габричевского, протокол № 6 от 2 ноября 2006 г Основные результаты исследований доложены и обсуждены на 5-ги
Российских и 14-ти международных конференциях съездах Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997, 2002), Российских научно-практических конференциях «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000), «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2004), «Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006), на международных конференциях «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1995, 1998, 2003), на 95ом Съезде американского общества по микробиологии (95th General Meeting of American Society for Microbiology - Вашингтон, 1995), на 1ом Конгрессе общества европейских микробиологов (1 FEMS Congress of European Microbiologists - Любляна, 2003), на совещаниях Международной лабораторной рабочей группы ВОЗ по дифтерии и проекта по контролю за дифтерией в странах Европейского Союза (International Meetings of the European Laboratory Working Group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria Surveillance Network, DIPNET - Лондон, 1994, Хельсинки, 1995, Париж, 1996, Бухарест, 1997, Халхидики, 1998, Брюссель, 2000 г, Вена, 2002, Копенгшен, 2004, Вольягменн, 2006)
Публикации
Основное содержание работы отражено в 53 научных публикациях в статьях - 16, в том числе в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК России - 8 (5 в отечественных, 3 - в иностранных журналах), в материалах всероссийских и международных конференций - 30, в патенте на изобретение -1, в инструктивно-методических документах - 6
Объем и структура диссертации
