Введение к работе
Актуальность проблемы.
Исследования последнего десятилетия показали, что более 99 % бактерий существуют в природной среде и в организмах хозяев в виде сложно организованных сообществ - биопленок. Такой образ жизни является основной стратегаей их выживания. Биопленки могут быть сформированы популяциями как одного вида бактерий, так и сообществом многих видов микробов. Современные микроскопические методы показали, что биопленки имеют сложную архитектуру: бактерии в биопленке заключены в экзополимерный матрикс, который содержит каналы, наполненные жидкостью, через которые происходит приток питательных веществ и кислорода и выведение продуктов метаболизма. Главным компонентом матрикса являются экзополисахариды, в его состав также входят белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества [Ильина Т.С., Романова Ю.М., с соавт., 2004].
Изучение биопленок вызывает огромный интерес исследователей в последние годы в силу того, что этот способ существования бактерий создает большие проблемы в медицинской практике: установлено, что многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантированного оборудования - линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, - обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхностях этих устройств. Причем, будучи организованными в биопленочные сообщества, бактерии проявляют большую устойчивость к действию антибактериальных препаратов, в том числе антибиотиков, факторов иммунной защиты организма и неблагоприятных факторов среды [Donlan R.M., Costerton J.W., 2002].
Объект нашего исследования - бактерии Burkholderia cenocepacia -являются одним из возбудителей, вызывающих тяжелые легочные инфекции у иммунодефицитных пациентов и у больных с наследственным заболеванием -кистозным фиброзом легких (КФ). Интенсивные исследования этого возбудителя в последнее время позволили определить у него следующие
факторы патогенносте: кабельные пили, сидерофоры, липазы, гемолизины, экзополисахариды (EPS), биопленки [Sajjan U.S., Sun L., v et al., 1995; Visser M.B., Majumdar S., et al., 2004; Kooi C, Subsin В., et al., 2006; Hutchison M.L., Poxton I.R., et al., 1998; Cunha M.V., Sousa S.A., et al., 2004]. Вклад каждого из этих факторов в общую патогенность Burkholderia sp. все еще недостаточно определен. Поскольку тяжелые хронические легочные патологии, вызываемые В. cenocepacia у обширной группы иммунодефшщтных людей, обусловлены способностью возбудителя формировать биопленки и поскольку проблема лечения этой инфекции остается актуальной и в нашей стране, и за рубежом, изучение процесса образования биопленок и его генетического контроля как основа для разработки способов борьбы с ними является одной из актуальных проблем современной инфектологии. Изучение механизмов образования биопленок этими бактериями должно внести существенный вклад в поиск мер профилактики и защиты против патогенов путем создания нового класса антимикробных препаратов, способных ингибировать патогенные свойства бактерий или препятствовать процессу образования биопленок.
Одним из подходов к изучению процесса образования биопленок является получение мутантов, влияющих на этот процесс, и их комплексное изучение.
Цель работы: получение мутантов бактерий В. cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo.
В соответствии с поставленной целью в процессе выполнения диссертационной работы предстояло решить следующие задачи:
изучение способности бактерий В. cenocepacia формировать биопленки и отработка методик качественной и количественной оценки этого процесса;
получение мутантов В. cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок методом инсерционного мутагенеза;
сравнительная электронно-микроскопическая характеристика полученных мутантов.
клонирование фрагментов мутантнъгх генов, содержащих инсерцию пласпозона;
секвенирование клонированных фрагментов и идентификация мутантных генов с помощью баз данных; протеомный анализ;
изучение in vivo динамики инфекционного процесса, вызываемого полученными мутантними штаммами на биологической модели заражения лабораторных животных.
Научная новизна.
На основе комплексного подхода при исследовании процесса формирования биопленок бактериями В. cenocepacia выявлены три гена, принимающие участие в генетическом контроле процесса образования биопленок: ompR и tetR, кодирующие глобальные регуляторы транскрипции, и ген cydB, кодирующий субъединицу I цитохром bd убихинол оксидазы. Впервые показано участие этих генов в генетическом контроле процесса образования биопленок у В. cenocepacia.
Впервые при использовании протеомного анализа показана дифференциальная экспрессия белка шаперона GroEL у штаммов с различной способностью к образованию биопленки. Это дает возможность предполагать роль этого белка в генетическом контроле процесса формирования биопленок бактериями В. cenocepacia.
Выявлена наиболее чувствительная к инфекции В. cenocepacia линия мышей I/St, позволяющая проводить сравнительные исследования динамики инфекционного процесса, вызываемого различными штаммами этого возбудителя. С использованием этой линии мышей впервые экспериментально показана зависимость более длительной персистенции бактерий В. cenocepacia в органах зараженных животных in vivo от способности возбудителя к формированию биогшенок, определяемой in vitro.
Впервые при проведении патоморфологических исследований легких мышей, инфицированных штаммом с повышенной способностью к образованию биопленки, на поверхности альвеол наблюдали окрашенную эозином биопленку. Впервые в биологической модели показано, что способность к образованию биопленок у бактерий В. cenocepacia обусловливает воспалительный процесс в легких, длительную персистенцию возбудителя в организме экспериментальных животных, что может приводить к гибели мышей.
Практическая значимость.
Получена коллекция штаммов В. cenocepacia с различной способностью к образованию биопленок, которые хранятся в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Определен комплекс методов и подходов для характеристики полученных мутантов in vivo и in vitro, что позволит оценивать степень влияния различных лекарственных средств на способность образовывать биопленки различными видами бактерий.
Положения, выносимые на зашиту.
Процесс образования биопленок патогенными бактериями подвержен сложному генетическому контролю. Методом инсерционного мутагенеза получены мутанты В. cenocepacia как с пониженной, так и с повышенной способностью к образованию биопленок. 3 мутантных гена идентифицированы и впервые показано участие генов, ompR и tetR, кодирующих глобальные транскрипционные регуляторы OmpR и TetR, соответственно и гена cydB, кодирующего важный дыхательный фермент бактерий, цитохром bd убихинол оксидазу, в регуляции процесса формирования биопленок бактериями В. cenocepacia. Показана дифференциальная экспрессия гена groE в штаммах с мутациями cydE и отрК, что предполагает роль белка GroEL в процессе формирования биопленок бактериями В. cenocepacia.
На биологической модели заражения мышей наиболее чувствительной к инфекции В. cenocepacia линии мьшіей I/St in vivo показано, что повышенная
способность к формированию биопленок у мутантного штамма cydK, приводит к более длительной персистенции бактерий в органах зараженных животных и вызывает воспалительный процесс в легких.
Апробация работы.
Материалы диссертации были доложены на международной конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Пущино, 2006; 16-ом Международном Конгрессе по Клинической Микробиологии и Инфекционным Заболеваниям (Ницца 2006); 12-ом Международном симпозиуме по Микробной Экологии (ISME-12, Керне, Австралия 2008).
Апробация диссертации состоялась на конференции отдела Генетики и Молекулярной биологии бактерий 2 апреля 2009 года.
Публикации.
По результатам исследований опубликовано 8 научных работ, 5 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации.
