Введение к работе
Актуальность проблемы
В общей эпидемиологии и концепции природной очаговости инфекционных болезней до недавнего времени господствовали представления о циркуляции возбудителей как практически единственной форме их существования - в виде непрерывных эпидемических и эпизоотических процессов В последние десятилетия, по мере накопления сведений о закономерных перерывах в циркуляции патогенных микроорганизмов в природе и обществе, формировались представления о межэпизоотических и межэпидемических периодах — как сезонных, так и многолетних В условиях, затрудняющих или исключающих циркуляцию возбудителей, она сменяется стадией резервации - устойчивым их сохранением, в том числе в окружающей среде - почвах и водоемах (Гинцбург А Л , Романова Ю М , 1997, Литвин В Ю , 1986, 1991; Литвин В Ю и др , 1998, Пушкарева В И , 1997)
Относительно недавно установлено (Литвин В Ю и др , 1998, 2000, Collwell R R et al, 1985, 1996, Oliver J D , 1993 ), что неблагоприятные для существования и размножения условия среды неспорообразующие бактерии способны переживать, переходя в покоящееся, некультивируемое состояние (НС), которое является обратимым и может обеспечивать сохранение патогенных бактерий в межэпидемические и межэпизоотические периоды Способность к переходу в НС к настоящему времени выявлена для многих (более 30 видов) патогенных бактерий ( в основном грамотрицательных ), в том числе и для псевдомонад 4 видов
Основным местообитанием псевдомонад и буркхолдерий
(грамотрицательных неферментирующих палочек) в природе является ризосфера ряда растений, где они существенно влияют на другие микроорганизмы за счет продукции антифунгальных, бактерицидных и антипротозойных веществ, а также вступают в симбиотические отношения со свободноживущими почвенными
простейшими, которые могут служить их резервуарными хозяевами (Пушкарева ВИ, 1994)
Оставались неизвестными способность Burkholdena cenocepacia переходить в покоящееся состояние и факторы среды, индуцирующие этот процесс
Биопленки как «фиксированная» форма существования микроорганизмов в окружающей среде известна давно (Сукачев ВН, 1947) Патогенные бактерии, основной средой обитания которых являются почвы и водоемы (иерсинии, вибрионы, легионеллы, листерии, кампилобактеры, клебсиеллы, сальмонеллы, псевдомонады и др) прикрепляются к «неживым» субстратам - почвенным частицам или существуют в ассоциациях с водорослями, ризосферой растений, простейшими, ракообразными и другими организмами
Псевдомонады и экологически близкий им род Burkholdena известны как возбудители болезней человека, животных и растений В cenocepacia вызывает внутрибольничные инфекции, прежде всего у лиц, страдающих кистозным фиброзом (муковисцидозом) и хроническим гранулематозом, у иммунокомпрометированных больных, а также у пациентов, при лечении которых использовали катетеры и имплантаты (искусственные клапаны сердца, линзы, челюстно-лицевые протезы и др) Установлено, что бактерии колонизируют поверхности различных материалов, образуя биопленки (Donlan R М , Costerton JW, 2002, Gauthier Y et al, 1989, Girardeau JP, 1982) Доказана способность буркхолдерий формировать биопленки на пораженных органах и тканях (Шагинян И А , Данилина Г А , 2007).
Выявлены тесные биоценотические связи В cepacia (cenocepacia) с почвенными и водными простейшими - амебами, инфузориями (Пушкарева В И , 1994, 2006, Пушкарева ВИ и др , 1992, 2005, Landers Р et al, 2000, Marolda С L et. al, 1999), однако их участие в формировании биопленок неизвестно
Цель работы — оценка возможности и условий перехода Burkholdena cenocepacia в некультивируемое (покоящееся) состояние, а также способности к формированию биопленок в сообществе с простейшими
Задачи исследования
-
Оценить структуру и численность популяции В сепосерасіа в разных экологических условиях при параллельном использовании бактериологического метода и тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).
-
Определить возможность перехода В сепосерасіа в покоящееся состояние при воздействии ряда абиотических и биотических факторов
-
Изучить фенотипическую изменчивость основных свойств буркхолдерий в разных экологических условиях
-
Разработать методические подходы для получения и количественной оценки биопленок, формируемых бактериально-протозойным сообществом в искусственных и естественных средах
-
На ультраструктурном уровне с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) продемонстрировать динамику взаимодействий буркхолдерий с фагоцитирующими простейшими и исход внутриклеточных событий в планктонных и биопленочных сообществах
Научная новизна
Впервые описан переход В сепосерасіа в покоящееся (некультивируемое) состояние при взаимодействии с почвенными простейшими Tpynformis и в их отсутствие Установлены динамика и сроки этого процесса при температурах, соответствующих холодному сезону в почвах умеренных широт
Выявлены не известные ранее изменения культурально-морфологических свойств, биохимической активности и пигментообразования вегетативных клеток буркхолдерий в разных экологических условиях
Впервые разработана оригинальная технология получения биопленок, сформированных бактериально-протозойной ассоциацией на модели (В сепосерасіа + Т pynformis) и выявлена ведущая роль инфузорий в их образовании.
Впервые с помощью КЛСМ детально охарактеризована в динамике ультраструктура планктонных и биопленочных (неподвижных) клеток бактерий и
простейших Установлен паразито-хозяинный тип симбиотических отношений при обеих формах существования
Практическая значимость работы
Важная роль простейших в активной жизнедеятельности В cenocepacia и их длительной резервации в объектах окружающей среды определяют целесообразность микробиологического анализа бактериально-протозойных ассоциаций при мониторинге как природных водоемов, так и объектов окружающей среды стационаров Такой анализ должен включать, наряду с традиционными методами, применение тест-систем на основе ПЦР для выявления некультивируемых (покоящихся) форм буркхолдерий
Оригинальный метод, представленный в диссертации, оформлен в виде Методических рекомендаций. «Технология получения бактериально-протозойных биопленок» (2007 г), утвержденных на совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН
Технология получения бактериально-протозойных биопленок
предназначена для микробиологов и может найти применение в научно-исследовательских учреждениях, занимающихся проблемами симбиологии, экологии бактерий и простейших в природных и урбанизированных экосистемах
Материалы диссертации представлены на VI международном конгрессе Экватек - 2004 «Вода экология и технология» (Москва, 2004), на 1-й и 2-й Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005, Рязань, 2007), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007)
Материалы диссертации используются при чтении лекций студентам кафедры инфектологии ГОУ ВПО ММА им Сеченова
Апробация работы
Диссертация апробирована на конференции отдела природноочаговых инфекций ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН 18 июня 2007 года
Публикации
По результатам исследований опубликованы 6 работ Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы (53 отечественных и 75 зарубежных источников) Работа изложена на 114 страницах, иллюстрирована 7 таблицами, 30 рисунками
Работа выполнена в лаборатории экологии возбудителей инфекций Формирование биопленок изучали в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи РАМН (руководитель лаборатории - Академик, д б н Гинцбург АЛ) Ультраструктуру ассоциантов с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа изучали под руководством к б н Мойсеновича М М (кафедра физиологии микроорганизмов МГУ им М В Ломоносова)
