Введение к работе
Актуальность проблемы. Возбудители мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) и сапа {Burkholderia mallei) являются известными патогенными видами рода Burkholderia. Их роль в инфекционной заболеваемости человека и некоторых животных рассматривается, главным образом, в связи с существованием эндемичных районов, появлением завозных случаев инфекций, а также потенциальной опасностью преднамеренного использования этих микроорганизмов в качестве агентов биотерроризма [Dance А., 2000; Соепуе Т., Li-Puma J.J., 2003; Inglis T.J., Rolim D.B., Sousa A.Q., 2006].
В последнее время отмечено повышение интереса к другим, имеющим медицинское значение, филогенетически родственным В. pseudomallei и В. mallei микроорганизмам комплекса Burkholderia cepacia - оппортунистическим патогенам, поражающим больных муковисцидозом и грануломатозом и нередко становящимся причиной развития тяжелого серасіа-сшідрома. у лиц со сниженным иммунитетом [Holmes A., Govan J., Goldstein R., 1998; Ple-sa M., Kholti A., Vermis K., et al, 2004].
Как возбудители мелиоидоза и сапа, так и В. cepacia, с некоторыми отличиями, характеризуются высокой природной резистентностью к ингибиторам, в том числе к антибактериальным препаратам, используемым для лечения. Особенности организации геномов обеспечивают патогенным Burkholderia spp. значительные возможности для адаптации в различных неблагоприятных условиях, позволяя им с достаточной легкостью повышать резистентность в процессе лечения и формировать штаммы с множественной лекарственной устойчивостью [Ciss M.F., Dian Y.D., Sow A.I. et al, 1998; Kenny D.J. Russel P., Rogers D. era/, 1999].
Показано, что множественная лекарственная резистентность бактерий обусловлена функционированием различных молекулярных механизмов, таких как модификация мишеней, снижение общей проницаемости клеточной оболочки за счет изменения экспрессии поровых белков наружной мембраны, активный транспорт из клетки антимикробных соединений и т.д. [Li X.Z., Nikaido Н., 2004].
Изучение механизмов формирования резистентности является важным направлением в исследованиях биологии представителей рода Burkholderia. Оно представляет перспективу для решения целого ряда научно-практических задач, направленных на оценку значения измененной чувствительности штаммов в развитии инфекционного процесса, установление связи резистентности с вирулентными и персистентными свойствами микроорганизма, поиск оптимальных путей преодоления устойчивости к антибактериальным средствам, разработку новых способов лечения и профилактики инфекционных заболеваний и т.д. Одновременно определение молекулярных маркеров, ассоциированных с теми или иными типами резистентности, может занять важное место в эпидемиологическом мониторинге этих патогенов.
Необходимой моделью для оценки особенностей природной резистентности микроорганизмов и изучения молекулярно-генетических механизмов, лежащих в ее основе, являются экспериментально полученные штаммы, устойчивые к антибиотикам различных групп. Селекция таких штаммов и их последующее изучение составляли основу настоящей работы.
Цель работы заключалась в изучении основных закономерностей формирования резистентности множественного типа у В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia.
Задачи исследования:
-
Дать сравнительную характеристику природной чувствительности к антибактериальным препаратам патогенных буркхольдерий и исследовать особенности формирования у них антибиотикорезистентности; получить коллекцию мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia с маркерами резистентности/чувствительности к антибиотикам групп фтор-хинолонов и цефалоспоринов.
-
Оценить участие в формировании резистентности механизмов, связанных с проницаемостью наружных мембран (изменение уровня анти-биотикоустойчивости в присутствии блокатора мембранных каналов и продукции некоторых внеклеточных ферментов).
-
Провести сравнительный анализ продукции компонентов системы мембранного транспорта у мутантов буркхольдерий с различными фенотипами резистентности к антибиотикам.
-
Определить вирулентность мутантов с измененной чувствительностью к антибиотикам для экспериментальных животных и разработать метод ее оценки на модели простейших.
-
Охарактеризовать генетический полиморфизм резистентных мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia с использованием метода RAPD, анализа фрагментов ДНК, гомологичных генам интеграз и изучить изменчивость пориновых генов с помощью ПЦР.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование особенностей формирования резистентности к антибиотикам классов фтор-хинолонов и цефалоспоринов у патогенных филогенетически родственных видов Burkholderia (В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia). Установлено, что направленно селекционированные мутанты (SMR) этих микроорганизмов с маркерами резистентности к пефлоксацину, офлоксацину и цефтазидиму, приобретают фенотип множественной устойчивости к препаратам других классов высокого уровня.
Оформлен патент на изобретение «Инсерционный мутант Burkholderia pseudomallei КМЗ1 - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности
у патогенных буркхольдерий» (заявка №2009141036 от 5 ноября 2009 г., положительное решение о выдаче патента от 13 октября 2010 г.).
На основании изучения устойчивости к антибиотикам в присутствии блокатора мембранных каналов - верапамила и секреции внеклеточных ферментов дана предварительная оценка возможных механизмов формирования множественной резистентности, связанных с процессами проницаемости клеточных мембран.
У мутантов всех трех видов Bwkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам проведен сравнительный анализ продукции компонентов системы мембранного транспорта и секреции и обнаружены различия в профилях белков наружных мембран, варьирующие при изменении резистентности к ингибиторам.
Для определения вирулентности мутантных штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia в качестве альтернативной модели впервые предложен вид простейших Paramecium caudatum и осуществлено моделирование локального инфекционного процесса (феномен Штрауса), вызываемого В. cepacia, на золотистых хомячках. Установлено, что развитие исследуемых типов резистентности или повышенной чувствительности приводит к снижению вирулентности мутантов для данных моделей.
Впервые изучен генетический полиморфизм мутантов патогенных видов Bwkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам с использованием метода RAPD и проведен анализ изменчивости пориновых генов методом ПНР. Показано, что штаммы В. pseudomallei, резистентные к пеф-локсацину, офлоксацину, цефтазидиму (SMR), образовывали две группы сходства, отдельные от групп, объединяющих транспозонные мутанты (ТТМ) этого вида, чувствительные к антибиотикам.
На основании результатов анализа аллельного полиморфизма пориновых генов орсР1/отр39, показавшего модификацию их структуры у SMR-штаммов В. mallei и В. cepacia, высказано предположение о возможной роли полифункциональных поринов ОрсР1/Отр39 в формировании у патогенных буркхольдерий множественной резистентности. Роль порина OpcPl В. cepacia в развитии резистентности подтверждена комплементацией дефекта по продукции белка при трансформации по признаку устойчивости с выявлением специфического ПНР-продукта, соответствующего последовательности орсР1/отр39 генов.
Практическая ценность. Получена коллекция мутантов B.pseudomallei, В. mallei, В. cepacia, включающая штаммы как с фенотипом множественной резистентности, так и штаммы с множественной чувствительностью к антибиотикам, предназначенных для изучения молекулярно-генетических механизмов резистентности и вирулентности буркхольдерий. Мутанты В. cepacia 25416 SMR2 (CfzRPfxR) и В. cepacia 25416 NSP депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского
НИПЧИ «Микроб», ГКПБ с присвоенными номерами В. cepacia КМ 197 и В.cepacia КМ 196 соответственно.
Модель простейших (P. caudatum), предложенная для ускоренного определения вирулентности, и мутантные штаммы используются в работе профильных лабораторий ВолгоградНИПЧИ при изучении вирулентности и способности к персистированию патогенных буркхольдерий.
Материалы диссертационной работы вошли в раздел методических указаний МУК 4.2.2495-09 «Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам», утвержденных Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 1 апреля 2009 г. (с введением в действие 1 июня 2009 г.).
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Полученные методом направленной селекции мутантные SMR-штаммы В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia, резистентные к фторхинолонам (пефлоксацину, офлоксацину) и цефалоспоринам (цефтазидиму), характеризуются стабильным наследованием приобретенных признаков с развитием перекрестной устойчивости к антибиотикам других классов.
-
Мутанты патогенных буркхольдерий с множественной устойчивостью к антибиотикам отличаются измененной проницаемостью клеточных мембран, что фенотипически проявляется в снижении продукции внеклеточных ферментов и изменении резистентности к антибактериальным препаратам при воздействии на клетки верапамила, блокирующего мембранные каналы.
-
У резистентных мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia наблюдается варьирование состава мажорных протеинов наружных мембран с возрастанием экспрессии ряда белков, при этом у мутантов В. cepacia с повышенной чувствительностью происходит снижение продукции протеинов (Мг21, 27, 71, 110 kDa) и отсутствие экспрессии поринаМг 36 Ша(ОрсРІ).
-
Развитие у буркхольдерий измененной чувствительности к антибиотикам, приводит к снижению вирулентности мутантных штаммов для лабораторных животных (белых мышей, золотистых хомячков) и простейших вида P. caudatum.
-
В развитии резистентности множественного типа у патогенных буркхольдерий принимает участие порин наружной мембраны ОрсР1/Отр39, что подтверждается наличием модификаций в структуре пориновых генов орсРИотрЗЯ резистентных штаммов. При трансформации мутантов В. cepacia с повышенной чувствительностью к антибиотикам, дефектных по гену opcPl, наблюдается компенсация признака сниженной резистентности, восстановление геномной последовательности, соответствующей орсР1/отр39 и продукция белка Мг 36 Ша.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); V Международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2008); а также на ежегодных итоговых научных конференциях ВолгоградНИПЧИ (2002-2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 2 - в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций, 1 - в зарубежной печати.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, иллюстрированных 14 таблицами и 33 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 232 литературных источника (38 отечественных и 194 иностранных авторов).
