Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Явление апомиксиса у покрытосеменных растений 10
1.1.2. Распространение и формы апомиксиса у злаков 17
1.1.3. Апомиксис в роде Роа L 20
1.1.4. Основные направления исследований апомиксиса у Poapratensis L 26
1.2. Особенности эмбриогенеза у псевдогамных апомиктов 31
1.3. Особенности эндоспермогенеза у апомиктов 36
2. Материал и методы исследования 46
2.1. Материал 46
2.1.1. Ботаническая характеристика объектов исследования 47
2.2. Методы 49
2.2.1. Метод давленных ацетокарминовых препаратов пыльников 50
2.2.2. Метод приготовления препаратов зрелой пыльцы 51
2.2.3. Метод приготовления препаратов просветленных семязачатков 51
2.2.4. Метод выделения целых зародышевых мешков с помощью ферментативной мацерации и последующей диссекции семязачатков 52
2.2.5. Метод приготовления микротомных препаратов семязачатков...52
3. Результаты цитоэмбриологического исследования мятликов 54
3.1. Микроспорогенез и развитие пыльцевых зерен 54
3.2. Мегагаметофитогенез и структура зародышевых мешков 71
3.3. Эмбриогенез 87
3.4. Эндоспермогенез 108
3.5. Эмбрио- и эндоспермогенез в отсутствии опыления у Роа pratensis L 123
4. Заключение 132
5. Выводы 135
6. Список литературы 137
- Явление апомиксиса у покрытосеменных растений
- Особенности эмбриогенеза у псевдогамных апомиктов
- Ботаническая характеристика объектов исследования
- Мегагаметофитогенез и структура зародышевых мешков
Введение к работе
Явление апомиксиса - образования семян у растений без оплодотворения - давно пользуется повышенным вниманием исследователей. Апомиксис имеет прямое отношение к решению задач, связанных с проблемой пола у растений (Хохлов, 1950; Поддубная-Арнольди, 1976; Ноглер, 1990).
Интерес к этому явлению особенно возрос во второй половине XX века, когда в печати стали широко освещаться перспективы, которые открывает использование апомиксиса в селекции растений (Nygren, 1958; Петров, 1964, 1970, 1979, 1988; Asker, 1979; Hanna, Bashaw, 1987; Ноглер, 1990; Asker, Jerling, 1992; Koltunow, 1998). Селекционная ценность апомиктичного размножения определяется тем, что обладающие им особи дают однородное, относительно константное потомство. Это открывает путь для закрепления в ряду поколений хозяйственно-ценных признаков и, в первую очередь, гибридного гетерозиса. При половом размножении это невозможно из-за наличия мейотической рекомбинации и, как следствие, расщепления признаков в гибридном потомстве. Только апомиксис может обеспечить длительное сохранение форм с нестабильной генетической конституцией - нечётных полиплоидов, анеуплоидов, отдаленных гибридов, которые не могут воспроизводиться половым путём и оказываются стерильными. В связи с этим апомиксис обладает потенциалом для широкого использования в селекционных программах по созданию пищевых ресурсов (Toenniessen, 2001).
Апомикты характеризуются такими качествами, как устойчивость к неблагоприятным условиям обитания, интенсивное вегетативное воспроизведение, мощность развития, которые являются весьма ценными для интродукции растений и лежат в основе интродукционного, селекционного отбора (Мирошниченко, 1968, 1970). Размножение апомиктичными семенами позволяет решить проблему «старения клонов», которая наблюдается при длительном вегетативном размножении (Петров, 1979; Тырнов, 2000). Она касается многих важных культурных растений, например, картофеля. У сахарной свёклы апомиксис может быть использован для закрепления хозяйственно ценного триплоидного уровня (высокая сахаристость), так как существующая схема получения триплоидов на основе скрещивания диплоидных и тетраплоидных форм сложна и дорогостояща (Тырнов, 2000).
К сожалению, у важнейших сельскохозяйственных культур, таких как пшеница, кукуруза, рис, рожь, ячмень и др., способность к устойчивому апомиктичному размножению отсутствует. Это, скорее всего, связано с использованием на протяжении длительного времени селекционных схем, включающих гибридизацию, то есть направленных на сохранение половой системы воспроизводства, которые должны были привести к потере способности к регулярному апомиксису, даже если тенденция к нему изначально существовала. В связи с этим, потенциально возможным способом создания апомиктичных форм культурных злаков является заимствование этого свойства у дикорастущих злаков. Решение этой проблемы, например, у кукурузы связано с использованием в качестве донора её дикорастущего сородича - 72-хромосомного трипсакума (Tripsacum dactyloides L.). Работа по интрогрессии генетического материала трипсакума в кукурузу путем гибридизации активно велась в Новосибирске под руководством Д.Ф. Петрова (1964, 1979, 1988) и в США под руководством J.WJ. de Wet, а позже аналогичные эксперименты с использованием новосибирского материала были начаты в США (Kindiger, Dewald, 1994; Kindiger, Sokolov, 1997; Leblank, Savidan, 1994; Grimanelli et al., 1997).
Несмотря на то, что у культурных злаков встречаются только редуцированные формы апомиксиса, тем не менее, использование их в селекции также имеет большое практическое значение. Так, гаплоиды представляют исключительную ценность в качестве материала для создания гомозиготных диплоидных линий, которые используются в селекционных схемах по производству гибридных семян. Кроме того, гаплоиды в перспективе могут быть использованы для получения диплоидных апомиктичных линий путём введения в их геном генов нередукции (Шишкинская, Юдакова, Тырнов, 2004).
В работах по апомиксису в качестве модельного объекта нередко используются мятлики, и, в частности, Роа pratensis L. (Кутлунина, Мальцев, 1994; Кутлунина, 2001; Naumova et al., 1992, 1993; Barcaccia et al., 1998; Albertini et al., 2001, 2004). Тем не менее, к числу аспектов, требующих дальнейших исследований, относятся: причины и последствия гаметофитных аномалий, характерные для апомиктов; соотношение темпов эмбрио- и эндоспермогенеза; условия формирования полноценных апомиктичных семян; алгоритм развития партеногенетического зародыша; геномный импринтинг в развитии эндосперма; константность и изменчивость апомиктов. На эти и ряд других вопросов в настоящее время нет однозначных ответов (Grimanelli et al., 1997, Тырнов, 2000; Spielman et al., 2003).
Кроме того, цитоэмбриологический анализ мятликов имеет практическое значение в связи с использованием некоторых видов этого рода в селекции, в качестве ценных кормовых и газонных культур (Мирошниченко, 1970, 1974; Ramulu et al., 1999; Кутлунина, 2001; Johnson et al., 2002; Czembor, 2003).
Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы заключалась в выявлении цитоэмбриологических особенностей системы размножения мятликов. В задачи экспериментальной работы входило исследование: - возможности апомиктичного размножения у видообразцов P. chaixii Vill., P. badensis Haenke, P. pratensis и десяти сортообразцов этого вида;
- микро- и мегаспорогенеза, микро- и мегагаметофитогенза,
- ранних стадий развития партеногенетических проэмбрио у P. pratensis;
- взаимоотношений эмбрио- и эндоспермогенеза при открытом опылении и беспыльцевом режиме.
Явление апомиксиса у покрытосеменных растений
Первый случай апомиксиса был обнаружен в 1839 году английским ботаником D. Smith (1841) у Alchornea ilicifolia. Он сообщил, что растения альхорнеи колючелистной в течение ряда лет в изобилии образуют зрелые и всхожие семена при отсутствии в Англии мужских растений этого вида. Позднее A. Braun (1860) и Е. Strasburger (1895) показали, что зародыш у этого вида образуется из соматических клеток, расположенных около женского гаметофита, и впоследствии проникает в зародышевый мешок, где окончательно созревает (цит. по: Банникова, Хведынич, 1982). Вскоре были описаны и другие способы развития зародышей без оплодотворения.
В области классификации и терминологии апомиксиса до сих пор существует разногласия в определении самого термина «апомиксис» и круга явлений, который он охватывает.
Сам термин и первая классификация апомиксиса принадлежат Н. Winder (1920). Он понимал апомиксис широко, включая в него все формы размножения, не связанные со слиянием половых клеток, в том числе вегетативное размножение. Эту точку зрения разделяли многие видные учёные первой половины XX века (Stebbins, 1941; Gustafsson, 1946-1947; Петров, 1964).
В дальнейшем было разработано много разных классификаций апомиксиса (Хохлов, 1967; Солнцева, 1970; Поддубная-Арнольди, 1976; Battaglia, 1963; Ascer, 1980), ни одна из которых не стала общепризнанной. Единственное, что объединяет все современные классификации, это исключение из системы апомиксиса вегетативного размножения. В области терминологии и выделении типов апомиксиса до сих пор существуют разногласия, что, несомненно, обусловлено сложностью самого явления. В настоящее время устойчивый (диплоидный, нередуцированный) апомиксис принято разделять на два основных типа: гаметофитный и апогаметофитный . При первом типе обязательно формируется зародышевый мешок, в котором зародыш развивается партеногенетически. К апогаметофитному апомиксису относят явление адвентивной эмбрионии, при котором зародыш формируется из соматических клеток семязачатка (нуцеллуса или интегумента).
В случае гаметофитного апомиксиса возможны разные способы формирования зародышевого мешка. При их определении мы использовали классификацию Н.А. Шишкинской (2000), в которой выделены три способа формирования женского гаметофита апомиктов: апоспория, диплоспория и апоархеспория2.
Апоспория - развитие зародышевого мешка непосредственно из материнской клетки мегаспор; диплоспория - из нередуцированной клетки диады мегаспор, апоархеспория - из соматической клетки нуцеллуса. Во всех случаях при образовании зародышевого мешка отсутствует мейоз (он либо выпадает, либо заменен делением без редукции числа хромосом), поэтому женский гаметофит апомиктов является нередуцированным. По способу образования эндосперма различают автономный апомиксис и псевдогамию. В первом случае и зародыш, и эндосперм развиваются без оплодотворения. При псевдогамии развитие партеногенетического зародыша сопровождается оплодотворением центральной клетки зародышевого мешка, из которой формируется «гибридный» эндосперм.
Редуцированным нерегулярным апомиксисом называют автономное развитие яйцеклетки, происходящее на базе редуцированного (эуспорического) зародышевого мешка; нередуцированным регулярным апомиксисом - на базе нередуцированного мегагаметофита (Петров, 1979). Апомиксис может быть облигатным или факультативным. В первом случае растения размножаются исключительно посредством апомиксиса. В семязачатках облигатных апомиктов функционируют только нередуцированные, чаще всего, апоархеспорические зародышевые мешки, яйцеклетки в которых развиваются партеногенетически.
Факультативные апомикты, в отличие от облигатных, в той или иной степени сохраняют способность к половому размножению. Говоря о факультативно-апомиктичных популяциях, чаще всего имеют в виду, что одна часть растений размножается половым путем, другая - апомиктично, или эти способы воспроизведения могут сменять друг друга при изменении условий окружающей среды (Ноглер, 1990). Иногда факультативный апомиксис описывается как одновременное использование одним растением двух альтернативных способов размножения: полового и апомиктичного, в результате чего формируется два типа потомков: материнского типа и гибриды. Факультативным апомиктам приписывается основная роль в формировании агамных комплексов - растительных сообществ, объединяющих несколько разных биотипов одного вида или родственных видов, с разными способами семенного размножения. Сохранение факультативными апомиктами способности к половому размножению обеспечивает обмен информацией между апомиктичными и половыми членами комплекса, что продуцирует большое количество разнообразных форм, увеличивая полиморфизм и эволюционную пластичность данного сообщества (Ноглер, 1990).
Первая половина 20 века характеризовалась интенсивными исследованиями в области апомиксиса. В этот период появились первые сводные работы по апомиксису и отдельным его аспектам (Fagerlind, 1940; Stebbins, 1941; Gustafsson, 1946,1947).
В нашей стране проблема апомиксиса была впервые поставлена С.С. Хохловым. В 1950 году была опубликована его монография «Перспективы эволюции высших растений», в которой он изложил свой взгляд на эволюционную роль апомиксиса. В этот период практически всеми учеными апомиксис рассматривался как случайная аномалия, не имеющая эволюционного значения.
Особенности эмбриогенеза у псевдогамных апомиктов
Характерной чертой эмбриогенеза у покрытосеменных растений является таксоноспецифичность морфогенеза зародыша (Терехин, 1997; Батыгина, Васильева, 2002). Эта особенность позволяет классифицировать разные типы эмбриогенеза, в основе которых лежит последовательность и особенности деления клеток в первый период развития зародыша (Schnarf, 1929; Johansen, 1950). На ранних этапах формирования зародыша существуют различия по характеру заложения клеточных перегородок и степени участия апикальной и базальной клеток 2-х клеточного проэмбрио в образовании основных органов будущего растения. Более поздние стадии эмбриогенеза в разных группах покрытосеменных протекают относительно одинаково. Из-за отсутствия определенного направления в заложении перегородок процесс развития зародыша злаков не укладывается ни в один из других типов эмбриогенеза. Начальная стадия его развития сходна с типом Asteraceae, но последующее развитие протекает достаточно своеобразно.
В результате многолетних исследований Т.Б. Батыгиной (1968) был выделен новый особый тип эмбриогенеза, присущий только данной таксономической группе, Graminad-тші, который характеризуется заложением серии наклонных («косых») перегородок к продольной оси зародыша, обуславливающих дорзовентральность внутреннего строения раннего проэмбрио и зрелого зародыша (Батыгина, 1997). Ранние этапы эмбриогенеза у различных видов злаков сходны, однако строение зрелых зародышей может существенно различаться.
В норме зигота злаков делится на две, лежащие друг над другом, клетки неравного размера: небольшую верхнюю или апикальную (са) и более крупную нижнюю или базальную (cb). Второе деление - поперечное -происходит в базальной клетке, образуются клетки т и сі, третье деление -продольное - имеет место в апикальной клетке и приводит к образованию Т-образного 4-х клеточного проэмбрио, четвертое - в клетке сі. Перегородки закладываются наклонно по отношению к продольной оси зародыша. В результате ряда последовательных делений из апикальной клетки формируется колеоптиле, частично щиток и частично эпибласт, из базальной - частично щиток и эпибласт, точка роста стебля, инициальная клетка центрального цилиндра корня, инициальная клетка коры корня, инициали чехлика, подвесок (зачаток стебля, зачаток корня, подсемядольное колено) (Батыгина, 1997; Батыгина, Васильева, 2002). Зрелый зародыш злаков имеет щиток, колеоптиле - влагалищный лист, первые листочки, зачаток стебля, подсемядольное колено, эпибласт, зачатки одного или нескольких корешков с чехликами, колеоризу - пленчатое влагалище вокруг корешков. В зрелой зерновке злаков небольшой зародыш располагается на её вершине, всё остальное пространство занято эндоспермом (Поддубная-Арнольди, 1976; Батыгина, 1987).
У половых видов злаков темпы раннего эмбрио- и эндоспермогенеза строго скоординированы. Зигота после оплодотворения приступает к развитию только после первого деления центрального ядра (первичного ядра эндосперма) или в присутствии 7-8 ядер эндосперма, а затем идет почти синхронное увеличение количества ядер эндосперма и клеток проэмбрио, но так, что число клеток эндосперма равно 2 в степени п+2, где п - число клеток зародыша (Шишкинская, Юдакова, Тырнов, 2004).
При псевдогамии эмбриогенез, как правило, инициируется до оплодотворения полярных ядер в нераскрытых цветках, тогда как образование эндосперма происходит примерно через сутки после опыления. Таким образом, к моменту вхождения в зародышевый мешок пыльцевой трубки и началу развития эндосперма, там уже присутствует многоклеточный зародыш. Преждевременный эмбриогенез отмечен рядом авторов у мятликов (Tinney, 1940; Scalinska, 1959; Мирошниченко, 1970; Кордюм, 1970; Шишкинская, Юдакова, 2001), у Parthenium (Esau, 1946), у Tripsacum dactyloides (Farquharson, 1955). Количество клеток в зародыше на этой стадии в разных зародышевых мешках варьирует, но дальше стадии недифференцированного проэмбрио его развитие без эндосперма не идет (Hakansson, 1943, 1944). В отсутствии эндосперма зародыш может достигать достаточно больших рамеров (например, 42-клеточной стадии у Роа granitica), но затем всегда погибает (Scalinsca, 1959).
Преждевременная эмбриония рассматривается эмбриологами в качестве механизма, страхующего растения от оплодотворения (Richards, 1970) и делающего невозможным возникновение триплоидного потомства. Однако это может происходить спонтанно в тех случаях, когда в отдельных семязачатках присутствуют задержавшиеся в своем развитии и неподелившиеся яйцеклетки (Muntzing, 1940). В связи с этим предполагают, что, например, у апомиктичных мятликов отсутствуют физиологические барьеры, препятствующие оплодотворению яйцеклетки спермием. Такие барьеры, возможно, существуют у Atamosko (Zephyranthes) texana (цит. по: Ноглер, 1990), Rudbeckia laciniata (Battaglia, 1946, Fagerlind, 1946). У этих видов наблюдалась дегенерация мужской гаметы после её проникновения в цитоплазму яйцеклетки, которая после этого приступала к делению. Это явление, называемое гиногенезом, показывает, что оплодотворению яйцеклетки препятствуют скорей всего физиологическое состояние женской гаметы. Поэтому, как считает G.A. Nogler (1984), отсутствие оплодотворения не связано напрямую с ранним временем начала эмбриогенеза, а обусловлено возникновением барьера, препятствующего проникновению спермия в яйцеклетку. По его мнению, таким барьером может быть структурно-измененная оболочка яйцеклетки. Однако точных данных, подтверждающих это предположение нет, и, следовательно, вопрос о механизме партеногенеза остается открытым.
Помимо преждевременной эмбрионии у некоторых пседогамных апомиктов развитие зародыша может начинаться после инициации развития эндосперма. Такой тип развития наблюдался у Rubus (Berger, 1953), Hypericum perforatum (Noack, 1939), Ranunculus auricomus (Rutishauser, 1954), R.. cassubicus (Izmailow, 1967), Hierochloe (Weimarck, 1967), Panicum maximum (Warrnke, 1954), Pennisetum ciliare (Snyder et al, 1955), P. dubium (Gildenhuys, Brix, 1959).
Обычно видам одного рода свойственен или автономный, или псевдогамный апомиксис, но, вместе с тем, отмечена встречаемость и обоих типов (Ноглер, 1990). У представителей некоторых родов в пределах одной популяции, и даже одного растения имеет место как преждевременная эмбриония, так и опережающее развитие эндосперма, а также значительное отставание эмбриогенеза (ранний проэмбрио при многоядерном и даже клеточном эндосперме). Примерами могут служить Potentilla (Rutishauser, 1948), Paspalum (Snyder, 1957; Reusch, 1961), Hierochloe glabra, Festuca rubra, Poaglauca (Шишкинская, Юдакова, 2001). Такое варьирование времени начала развития зародыша и эндосперма может быть связано с разными способами образования зародыша и разной его плоидностью (Шишкинская, Юдакова, 2001).
Ботаническая характеристика объектов исследования
Роа pratensis L. - мятлик луговой, многолетнее растение высотой 20-120 см с ползучими подземными побегами, образующими более или менее густые дерновины. Основания надземных побегов не утолщенные, нередко сближены. Ветки крупной широко раскидистой метелки гладкие или слабо шероховатые, нижние цветковые чешуи более или менее волосистые, верхние - с относительно длинными шипиками, нередко переходящими в волоски; листовые пластинки 1,2-5 мм шириной, обычно плоские.
Произрастает на лугах, лесных полянах, приречных песках и галечниках, в разреженных лесах, среди кустарников, нередко также у дорог и в населенных пунктах; до верхнего горного пояса. Занимает все районы Европейской части; встречается на Кавказе, Западной и Восточной Сибири, на Дальнем Востоке, в Средней Азии. За пределами России распространен в Скандинавии, Западной Европе, Средиземноморье (горы), Иране (горы), Монголии, Японо-Китайском районе, Северной Америке, заносный или интродуцированный во многих других странах (Цвелев, 1976).
P. pratensis, сорт «Ургу» - выведен в Уральском Госуниверситете им. A.M. Горького методом массового отбора из дикорастущих популяций в 1995г. Низовой многолетний злак. Относится к корневищно-рыхлокустовому типу. Обладает большой побегообразовательной способностью. Листья укороченных побегов узкие, до 3 мм шириной, мягкие. В культуре образует плотную дернину, густой травостой ярко-зеленой окраски с хорошими декоративными качествами. Побеги весной рано трогаются в рост. Зимостойкий, засухоустойчивый сорт, дающий высокий урожай семян.
P. pratensis, сорт «Balin» - выведен в The Danish Institute of Plant and Soil Science в 1998 г. Антоциановая окраска влагалища листа слабая. Лист в год посева широкий. Время выметывания соцветий раннее. Стебель, включая соцветие, длинный. Сорт зимостойкий, засухоустойчивый, быстро образующий травяной покров.
P. pratensis, сорт «Вагант» - выведен в Уральском Госуниверситете им. A.M. Горького в 2001 г. Антоциановая окраска листового влагалища отсутствует или очень слабая, волоски по краю отсутствуют или очень редкие, на обеих сторонах ниже листовой пластинки - отсутствуют или очень редкие, на язычке - отсутствуют или очень короткие. Опушение на верхней стороне листовой пластинки густое. Куст полупрямостоячий; лист зеленый, средней ширины. Время выметывания соцветий на второй год. Флаговый лист короткий, средней ширины, стебель длинный. Соцветие средней длинны, нижние боковые веточки прямостоячие, антоциановая окраска соцветий средняя. Ось напротив нижней стороны веточек наклоненная, шейка оси закрытая. Сорт зимостойкий, засухоустойчивый, обладающий высокой побегообразующей способностью.
P. chaixii Vill. - мятлик Ше, многолетнее растение с короткими ползучими подземными побегами или без них, обычно образующее довольно рыхлые дерновины. Влагалища стеблевых листьев на 2/з - 5/6 длины от основания замкнутые, ветки метелки шероховатые, нижние цветковые чешуи в нижней части более или менее волосистые, верхние цветочные чешуи по килям с относительно длинными шипиками.
Обитает на субальпийских лугах, лесных полянах, в разреженных лесах; до верхнего горного пояса. Встречается на Европейской части (Карпаты, интродуцирован в Прибалтике), Кавказе, вне территории России -в Скандинавии, Средиземноморье, интродуцирован в Северной Америке (Цвелев, 1976).
P. badensis Haenke - мятлик баденский, многолетнее растение, образующее очень густые дерновины без ползучих подземных побегов, основания надземных побегов не бывают луковицеобразно утолщенными, нижние цветочные чешуи более менее волосистые.
Произрастает на лужайках, галечниках, каменистых склонах и скалах (преимущественно известняковых); до верхнего горного пояса. Распространен во всех районах Кавказа, на территории Средней Европы, Средиземноморья (Цвелев, 1976).
Растения дикой популяции P. pratensis и экспериментальные образцы сортов мятлика лугового и видообразцы P. chaixii, P. badensis выращивались на открытых солнечных участках с нерегулярным поливом в течение трех лет. Параметры сортообразцов «Ургу», «Balin», «Вагант» и видообразцов P.pratensis, P.chaixii, P. badensis в этих условиях соответствовали их ботаническим и хозяйственным характеристикам.
Соцветия фиксировали ацетоалкоголем (3:1) при двух режимах цветения: открытом цветении и беспыльцевом. В первом варианте темпоральная фиксация проводилась до начала цветения, на стадии начала цветения, а также спустя 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 12, 15 суток от начала цветения. При беспыльцевом режиме из зрелых нераскрывшихся цветков пинцетом удаляли пыльники. Соцветия изолировали бумажным пакетом. Фиксацию проводили темпорально спустя 1, 2, 3, 4, 5, 7, 14 суток после кастрации. Во все сроки фиксации исследовали не менее 100 семязачатков из 5-10-ти растений каждого видо- и сортообразца. В общей сложности изучена структура 26723 женских гаметофитов.
Мегагаметофитогенез и структура зародышевых мешков
Ядра эндосперма делились синхронно и располагались по периферии зародышевого мешка, центральную часть которого занимала большая вакуоль (рис. 34а). В ядрах эндосперма халазального района мегагаметофита, в единичных случаях, наблюдали отставание хромосом и формирование трехполюсных веретен.
Клеткообразование в эндосперме у мятлика лугового обычно начиналось на 4-5 сутки (рис. 34 б), когда в нем присутствовало около 70 ядер, что соответствовало шести циклам митотических делений. Как и у половых форм, образование клеточных стенок происходило центропетально. Вначале они закладывались вокруг проэмбрио, а затем в средней и халазальной части зародышевого мешка.
После того как эндосперм на пятые сутки полностью становился клеточным (рис. 34 в, г), в нем происходила дифференциация, формировался алейроновый слой, а в клетках эндосперма появлялись крахмальные зерна.
Клетки эндосперма по мере его развития изменяли свою морфологию: стенки сильно утолщались, цитоплазма становилась густой, сильно вакуолизированной и ярко окрашивалась (рис. 34 д, е).
Как только процесс образования клеточного эндосперма завершался, в зародышевом мешке дегенерировали антиподы. До этого времени они сохраняли связь с проводящим пучком семязячатка и оставались, судя по их морфологии, функционально активными. На ранних стадиях эндоспермогенеза количество ядрышек в антиподах увеличивалось, что может свидетельствовать о продолжении в них процессов эндорепродукции. При достижении эндоспермом клеточной стадии, сначала в цитоплазме антипод появлялись крупные вакуоли, а затем все клетки сморщивались. Когда завершалась дифференциация алейронового слоя эндосперма, в семязачатках можно было обнаружить лишь небольшие темноокрашенные остатки дегенерировавших антипод. эндосперм (3 сутки от начала цветения); б - начало клеткообразования (4 сутки от начала цветения); в, г - клеточный эндосперм (5 и 10 сутки от начала цветения); д - изменение морфологии клеток эндосперма (5 сутки от начала цветения); е -формирование алейронового слоя
Несмотря на то, что клеткообразование заканчивалось, деление ядер и клеток эндосперма продолжалось. Начиная с седьмых суток, происходило заполнение клеток эндосперма крахмалом, то есть шел налив зерна (молочная спелость). К концу этой фазы, по данным Т.Б. Батыгиной (1987), при неблагоприятных условиях зародыш способен к прорастанию. На двенадцатые сутки наступала фаза восковой спелости, размер зерна не уменьшался, но оно становилось твердым. На пятнадцатые сутки в развитии эндосперма наступала фаза полной спелости, которая характеризовалась сокращением размеров зерна за счет снижения содержания воды в нем.
При образовании в одном семязачатке нескольких мегагаметофитов оплодотворение центральной клетки происходило либо во всех зародышевых мешках, либо только в одном. В первом случае на клеточной стадии эндоспермы разных мегагаметофитов сливались, образуя одну общую ткань (рис. 35 в). Подобное явление ранее была описано только для представителей семейства Loranthaceae (Виджаярагхаван, Прабакар, 1990). На цитологических препаратах практически невозможно отличить, где заканчивается эндосперм одного зародышевого мешка, и начинается другого. Так как положение множественных мегагаметофитов в семязачатках могло быть весьма разнообразным, зародыши в некоторых из них оказывались со всех сторон окруженными клетками эндосперма (рис. 35 б).
Если по каким-то причинам в одном из нескольких мегагаметофитов одного семязачатка полярные ядра оставались неоплодотворенными, центральная клетка в нем постепенно дегенерировала. Однако зародыш продолжал делиться и через некоторое время оказывался окруженным растущим эндоспермом соседнего зародышевого мешка. На более поздних этапах в семязачатках с несколькими зародышами не было обнаружено ни одного случая их дегенерации.
