Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Использование методов биотехнологии для сохранения биологического разнообразия растений 8
1.2. Факторы, определяющие процессы морфогенеза в культуре изолированных тканей и органов растений 12
1.3. Модели регенерации растений в культуре in vitro 23
1.4. Сомаклональная изменчивость; методы ее идентификации у регенерантов 31
1.5. Получение регенерантов лилий в культуре in vitro 43
Глава 2. Объекты, методы и условия проведения исследований 50
Глава 3. Результаты и обсуждение 72
3.1. Введение в культуру in vitro Lilium pilosiusculum (Freyn) Miscz. с помощью семян 72
3.2. Введение в культуру in vitro Lilium pilosiusculum, L. cernuum Komv L. pumilum Delile из луковичных чешуи 80
3.3. Введение в культуру in viti'o Lilium pilosiusculum, L. distichum Nakai, L.cernuum, L. pumilum из эксплантов тканей и органов цветка 84
3.4. Анализ регенерантов лилий 96
3.4.1. Гистологический анализ 96
3.4. 2. Цитологический анализ 103
3.4. 3. Анализ изоферментов 113
Глава 4. Практическое применение методов культуры in vitro для получения регенерантов сортовых лилий, хост и лилейника 121
Выводы 134
Литература 136
Список сокращений
- Использование методов биотехнологии для сохранения биологического разнообразия растений
- Факторы, определяющие процессы морфогенеза в культуре изолированных тканей и органов растений
- Введение в культуру in vitro Lilium pilosiusculum (Freyn) Miscz. с помощью семян
- Практическое применение методов культуры in vitro для получения регенерантов сортовых лилий, хост и лилейника
Введение к работе
Актуальность темы. В связи с ускоряющимися в последнее время темпами исчезновения многих видов растений появляется необходимость разработки методов их размножения и сохранения. Особенно это касается редких декоративных и лекарственных растений, для которых реинтродукция и репатриация являются одним из возможных способов восстановления. К таким видам относятся редкие виды лилий Сибири и Дальнего Востока - LU-ium pilosiuscalum (Freyn) Miscz., L. pumilum Delile, L. distichum Nakai и L. cer-nuum Kom.
В условиях интродукции, особенно в климатической зоне средней полосы, возобновление этих видов традиционными способами часто отсутствует (Растения..., 2005). В связи с этим, необходимым стал поиск ускоренного метода размножения лилий, позволяющего в то же время сохранить генотипы растений. При выборе стратегии сохранения биоразнообразия редких, исчезающих видов растений многими исследователями показана эффективность методов биотехнологии в сравнении с традиционными способами их размножения (Камелин, 1997; Benson, 1999; Молканова, Горбунов, 2003;) в том числе и представителей порядка Liliales (Pelkonen, 2005; Pejman, Morteza, 2007).
В то же время, существует необходимость построения прогнозируемой модели морфогенеза регенерантов, исключающей возникновение сомакло-нальной изменчивости. Важным преимуществом разрабатываемой технологии размножения редких генотипов в культуре in vitro должно явиться массовое воспроизводство генетически стабильных регенерантов, не отличающихся по ряду морфологических, биохимических и генотипических признаков от исходных растений. Выявление возможной изменчивости обеспечивается применением наиболее воспроизводимых и доступных методов экспресс-анализа.
Цель и задачи исследований. Цель исследования - выявить пути реализации морфогенетического потенциала различных типов эксплантов 4-х видов рода Lilium L. и разработать методы, позволяющие сохранять генетическую стабильность регенерантов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Изучить морфогенетические особенности развития различных типов эксплантов - семян, соматических тканей репродуктивных органов, тканей луковичных чешуи в культуре in vitro и сравнить их регенерационную способность.
Определить типы морфогенеза и особенности регенерации в зависимости от возраста материнского растения и соотношения экзогенных гормонов в питательной среде.
Провести анализ регенерантов, полученных из различных типов эксплантов при помощи гистологического, цитологического методов и изучения электрофоретических спектров изоферментов.
Показать возможность получения регенерантов из соматических тканей и органов цветка у различных сортов рода Lilium (пор. Liliales) и у сортов родов Hosta Tratt. и Hemerocallis L. (пор. Amaiyllidales).
Защищаемые положения.
Для изученных видов лилий выделен тип эксплантов, характеризующийся наибольшей регенерационной способностью - тычиночные нити с пыльником и фрагментом цветоложа. Полученные из них регенераты развивались только по пути прямого органогенеза.
Реализация программы гемморизогенеза или соматического эм-бриоидогенеза у регенерантов изученных видов лилий, полученных из соматических тканей и органов цветка позволяет сохранять их генотипы неизменными.
Научная новизна. Впервые проведен комплексный анализ регенерантов четырех видов лилий, полученных в культуре тканей луковичных чешуи
и соматических тканей и органов цветка при использовании гистологического, цитологического методов и изучения электрофоретических спектров изо-ферментов. Приведенные результаты гистологического анализа тканей реге-нерантов двух видов лилий - L. pumilum и L. сегпиит позволяют заключить, что появление мелких клеток с хорошо различимыми ядрами, образовывавших шаровидные структуры с васкулярными элементами, обозначенные ранее О.А. Чуриковой как полиады (2005), предваряют появление как побего-вых конусов, так и соматических эмбриоидов.
Показано, что регенерация жизнеспособных растений проходит у изученных нами видов и сортов лилий по таким путям морфогенеза in vitro, как гемморизогенез и соматический эмбриоидогенез (терминология дана по Т.Б.Батыгиной (1997). Отсутствие каллусогенеза при интенсивной регенерации микролуковичек у тычиночных нитей, выделенных вместе с пыльником и фрагментом цветоложа, говорит о высокой степени интактности эксплан-тов, исключающем образование каллуса.
Впервые при анализе электрофоретических спектров у двух видов лилий и полученных регенерантов были выделены как наиболее видоспеци-фичные изоферментные спектры изоцитратдегидрогеназы (ГОН) и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-FGD). При проведении анализа данных изо-ферментов в нескольких повторностях были получены сопоставимые результаты в тех случаях, когда исследовали материал, полученный от растений, выращиваемых в одинаковых условиях и находящихся на одной стадии онтогенеза.
При проращивании неспелых семян L. pilosiusculum на среде П-2, дополненной 0,2 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л БАП, отмечено формирование соматических эмбриоидов в основании семядоли проростков путем прямой регенерации без образования каллуса. Показано, что у регенерантов, полученных путем соматического эмбриоидогенеза по сравнению с сеянцами в культуре in
vivo образуется большее количество метамеров в луковице за одинаковый промежуток времени.
Практическая значимость работы. Разработана оригинальная методика получения регенерантов из соматических тканей и органов цветков лилий, которая позволяет сохранять исходный генотип неизменным. Создание подобной воспроизводимой модели регенерации дополняет существующие методы микроклонирования. Введение в культуру in vitro редкого вида L. сегтшт из соматических тканей и органов цветка способствует сохранению материнских растений и созданию клонированных генотипов для репатриации данного вида в природу.
Привлечение в качестве эксплантов неспелых семян Lilium pilosiuscu-lum приводит к ускорению онтогенетического развития сеянцев данного вида, что особенно важно для его интродукции.
Подобраны оптимальные условия культивирования in vitro для получения в короткие сроки идентичных сорту редких генотипов высоко востребованных в интродукции культиваров из родов Hosta и Hemerocallis.
Личный вклад автора состоит в получении и анализе экспериментального материала, описании результатов исследования, формировании выводов. Гистологические и цитологические исследования проведены в лаборатории декоративных растений совместно с Бугловой Л.В., а также в Центре коллективного пользования; анализ спектров изоферментов и их интерпретация проведены совместно с сотрудниками ИЦиГ Левитес Е.В.и Кирикович С.С.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на юбилейной конференции «Садоводство и цветоводство на современном этапе» (Новосибирск, 2005), Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), Международной научной конференции «Цветоводство без границ» (Харьков, 2006), I (IX) Международной конференции молодых ботаников (С-Петербург, 2006), I Всероссий-
ской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2006), Международной конференции «Современные проблемы фитодизайна» (Белгород, 2007), VI Междунар. научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы; списка сокращений; содержит 35 рисунков и 18 таблиц. Список литературы включает 270 работ, в том числе 110 работ на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, д.б.н. О.В. Дорогиной за ценные советы и замечания в процессе написания диссертации; искреннюю благодарность заведующей лаборатории биотехнологии ЦСБС д.б.н. Т.И. Новиковой за поддержку и критические замечания; к.б.н. А.Б. Горбунову за помощь в статистической обработке результатов. Искренне признательна за научное сотрудничество проф., д.б.н. О.А. Сорокопудовой (БелГУ), к.б.н. Л.В. Бугловой (ЦСБС), к.б.н. Е.В. Левитесу, к.б.н. С.С. Кирикович (ИЦиГ), - вед.н.с, д.б.н. О.Д. Никифоровой; н.с, к.б.н. Е. Карповой; с.н.с, к.б.н. Н.В. Власовой (ЦСБС) - за всесторонний анализ работы. Автор выражает благодарность всем сотрудникам лаборатории биотехнологии ЦСБС, чья помощь и поддержка помогли завершить диссертационную работу, а также искреннюю признательность заведующей лаборатории биотехнологии ГБС РАН к. с- х. н. О.И. Молкановой и официальным оппонентам, д.б.н., проф. Г.И. Высочиной и д.б.н. О.В. Мочаловой (ГНУ НИИ садоводства Сибири им. М.А. Лисавенко СО РАСХН, г. Барнаул) за подробный и тщательный анализ диссертационной работы.
Использование методов биотехнологии для сохранения биологического разнообразия растений
Генеральная Ассамблея Организации Объединенных Наций провозгласила 22 мая Международным днем биологического разнообразия, чтобы привлечь внимание к важности проблемы биоразнообразия и повысить осведомленность о ней. Утрата биоразнообразия стала реальностью, вымирание видов ускоряется и уже в 1000 раз превышает естественные темпы. По данным ООН, каждый час на Земле исчезает три вида флоры и фауны (http://www.cbd.int/doc/speech/2007/sp-2007-05-22-es-ru.pdf).
Существующие традиционные подходы к сохранению генофонда основаны большей частью на создании разнообразных коллекций и банков семян (хранение ex situ), а также на организации заповедников и заказников (хранение in situ). В Международной Конвенции (Конвенция.., 2006) о биологическом разнообразии, как и в Стратегии ботанических садов России по сохранению биоразнообразия растений (Стратегия.., 2003) подчеркивается, что методы сохранения ex situ должны преимущественно дополнять методы сохранения in situ.
Для решения данной проблемы предполагается "создать механизмы для совершенствования, разработки, развития и устойчивого использования биотехнологии с учетом ее потенциального вклада в сохранение биологического разнообразия и устойчивое использование биологических ресурсов" (Международная.., 2000).
Крупные коллекции редких и исчезающих растений России и сопредельных стран созданы в ряде российских ботанических садов, разработаны специальные методы по формированию таких коллекций (Андреев, Горбунов, 2000; Семенова, 2007). При этом следует подчеркнуть, что в условиях ех situ должны сохраняться в первую очередь редкие и исчезающие растения — представители местной флоры.
Сохранение коллекций живых растений ex situ несет в себе ряд недостатков, которые обусловлены следующими причинами: 1) небольшим числом особей, выживающих в культуре; 2) отбор образцов для переноса в культуру часто ограничен несколькими особями из одной популяции, что не обеспечивает достаточную репрезентативность охраняемого генофонда; 3) увеличением вероятности аутокроссинга, ведущего к гомозиготности, а также понижению или полной потере фертильности; 4) ограничение генотипического разнообразия интродуцируемых растений при вегетативном размножении; 5) неспособностью к выживанию многих растений в культуре, особенно в искусственно созданных условиях среды, например, в оранжереях, т.к. интродукция многих видов лимитирована их узкой экологической амплитудой. Кроме того, применяемые методы сохранения биоразнообразия растений часто требуют ежегодных материальных и трудовых затрат. Использование специальных методик отбора при интродукции могут обеспечить частичное решение этих проблем, однако полностью избежать негативных последствий не удается (Андреев, Горбунов, 2000, Стратегия.., 2003).
Эффективность сохранения генофонда растений ex situ может быть существенно повышена путем создания генетических банков растений. Организация генетических банков считается в настоящее время необходимым компонентом работ по сохранению биологического разнообразия растительного мира. Для растительных ресурсов сохранение совокупности видовых признаков ex situ должно осуществляться в условиях, не нарушающих генетическую целостность семенного фонда. (Molecular.., 1997). По классификации Международного центра генетических ресурсов различают следующие виды банков: 1) полевые генные банки (специальные, обычно клоновые посадки плодовых и лесных пород, корневых и клубневых культур); 2) генетические банки семян; 3) банки растительного материала, сохраняемого in vitro (культуры меристем, тканей и сеянцев в условиях замедленного роста).
В общей сложности, по данным, представленным в докладе генерального секретаря BGCI Питера В. Джексона на XVI Международном ботаническом конгрессе (1999 г.), в мировых генетических банках содержится более 250 000 образцов. Наиболее крупный банк находится в Королевском ботаническом саду Кью, где собраны и сохраняются семена 4900 видов растений (12400 образца). В России долговременное хранение налажено в Главном Ботаническом саду РАН, где с 1982 года при +5 С хранятся семена 490 видов растений, а также во ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова. Но даже в таких условиях семена со временем стареют и утрачивают жизнеспособность (Мехтизаде и др. 2007). Проблема идентификации в мировых коллекциях дублетов и так называемых очень сходных образцов остро встала в генных банках, особенно с крупными коллекциями. Для решения последних задач широко применяются технологии молекулярного маркирования (Karp et al., 1997; Конарев, 2006).
Таким образом, появилась необходимость в новых подходах, позволяющих преодолеть названные трудности, для чего были разработаны методики сохранения растений in vitro. Они подразделяются на две группы: регенерация и хранение в длительно пассируемой клеточной культуре без нарушения процессов роста и хранение при лимитированном росте, вплоть до его полной остановки.
Одним из эффективных приемов является хранение растительного материала in vitro в виде культур меристем и тканей, в так называемых банках меристем. На базе лаборатории биотехнологии ГБС создан банк редких и ценных генотипов, представляющий собой коллекцию асептических меристем 232 видов растений из 39 семейств - всего более 900 наименований (Молканова и др., 2003; Молканова, Коротков, 2007). Метод длительного хранения меристем обычно применяется для растений с высокой способностью к регенерации и генотипической стабильностью. Определено, что у таких растений как карельская береза и некоторые виды тополя (Машкина и др., 1999) стадия размножения в культуре in vitro может продолжаться годами без потери способности к укоренению и нормальному росту, и, что немаловажно, при отсутствии изменчивости in vitro.
В тех же случаях, когда при длительном культивировании растения возможна полная или частичная потеря клетками морфогенетических потенций, применяется метод криоконсервации. Одновременное снижение температуры и внесение в культуральную среду ингибиторов позволило сохранить в беспересадочной культуре лилии (Bonnier, 1997). В криобанке Института биофизики (Москва) содержится коллекция редких видов растений (Tik-honova, Yashina, 1996) где, в частности, находятся в коллекции in vitro 4 вида растений из семейства лилейных, в том числе - лилия кудреватая (Lilium martagon L.).
Факторы, определяющие процессы морфогенеза в культуре изолированных тканей и органов растений
Морфогенез высших покрытосеменных растений трактуется как последовательная цепь изменений формы в онтогенезе, приводящая к созданию видоспецифичной структуры, либо как совокупность протекающих в развивающемся организме процессов дифференцировки клеток с образованием специализированных тканей и органов (Коваленко, 1993; Круглова и др., 1999). Принципиально важное свойство морфогенеза — универсальность его путей как в условиях in vivo, так и в условиях in vitro (Батыгина и др., 1978). Генетическая обусловленность процессов морфогенеза отражается в изменении синтеза и-РНК, белков, активных ферментов, то есть в комплексе скоординированных во времени и пространстве реакций, обуславливающих дифференциацию активности генов (Бутенко, 1994).
Методы культивирования изолированных тканей и органов основаны на важнейшем свойстве растительной клетки — тотипотентности, т.е. способности некоторых клеток растений реализовать при определенных условиях имеющуюся генетическую информацию и дать начало целому организму {totalis - общий, целый; potentia — способность). Однако лишь некоторая часть клеток обладает свойством тотипотентности, а ее проявление представляет собой вероятностный процесс на каждом этапе культивирования.
В последние годы по аналогии с животными клетками в длительно размножающейся популяции растительных клеток в ходе морфогенеза выделяются стволовые клетки, которые сохраняют продолжительное время способность к пролиферации (Батыгина, Рудский, 2006). Главное отличие растительных клеток от животных, по мнению Б.Г. Иванова (2003), состоит в том, что стволовые клетки многократно возникают в ходе роста из уже дифференцированных или перешедших к активным делениям клеток. Именно эта способность определяет открытый тип морфогенеза растения и способность в течение длительного периода образовывать новые органы. Автор подчеркивает, что "образование и поддержание стволовых клеток определяется системой межклеточных отношений между клетками разных доменов в меристеме и зависимостью меристем от притока физиологически активных соединений (в том числе фитогормонов) от других частей растения, либо внесенных извне". Отличительными особенностями стволовых клеток являются: 1) их замедленная пролиферация в обычных условиях за счет непропорционального удлинения продолжительности периода Go , за что они получили название покоящегося центра в корне и меристемы ожидания - в стебле; 2) ускорение деления этих клеток в апикальной меристеме побега при его переходе к образованию генеративных органов; 3) способность менять направление дифференцировки и активность делений в зависимости от внешних условий. Удлинение митотических циклов приводит к уменьшению вероятности возникновения хромосомных аберраций (Иванов, 1986).
Принято считать, что в стволовых клетках стеблевых и корневых апексов число хромосом в ядрах строго постоянно, ведь именно они являются предшественниками археспориальных и генеративных клеток, сохраняющих наследственную идентичность в ходе делений. Им отводится особая роль в реализации плана строения растения и поддержания его стабильности в ходе онтогенетического развития (Laux, 2003). В реальности, клетки меристем на 14 равне с клетками, содержащими диплоидное число хромосом, могут содержать клетки и других уровней плоидности (Кунах, 1995). При сравнительном изучении объема геномов (как растений, так животных и человека) зафиксировано, что часто не наблюдается корреляции между уровнем эволюционной сложности биологического вида и размером его генома. Так, количество пар оснований, определенных для гаплоидного генома Lilium longiflorum = 1,8 1011. Это больше, чем для генома человека, включающего не менее 3,0 109 пар оснований (Малецкий, Колодяжная, 1999). Рост содержания ДНК в ядре, возможно, может происходить за счет увеличения числа копий отдельных последовательностей ДНК в геноме, в частности, за счет мультикопирования некодирующих последовательностей ДНК. Так, у злаков 75% общей ДНК состоит из повторяющихся последовательностей (тандемных групп). В свою очередь, размер генома влияет на число клеточных типов, отмечаемых в соматических клетках. Например, в соматических клетках растений с крупными размерами геномов преобладают клетки с основным набором хромосом, тогда как у растений с малыми геномами встречаются несколько типов клеток, различающихся по уровню плоидности (De Rocher et al., 1990). Предполагается, что существует корреляция между содержанием ДНК и продолжительностью клеточного цикла и, как следствие, длительностью периода вегетации у растений (Малецкий, Колодяжная.., 1999). Соответственно, эфемеры должны иметь небольшую массу ДНК в ядрах, тогда как родственные растения, живущие в более благоприятных условиях, очевидно, должны иметь гораздо более крупные по массе геномы.
Успех реализации тотипотентности культивируемых клеток в процессах морфогенеза определяют а) видоспецифичность исходного растительного материала, понятие которой объединяет в себе генотипические характеристики донорного растения и особенности дифференцировки инициальной ткани; б) влияние гормональных, трофических факторов и условий культивирования на морфогенез in vitro. Из всех факторов, определяющих морфогенетические потенции культивируемых тканей и органов, значение видоспецифичности доказано, пожалуй, с наибольшей убедительностью. Эпигенетические характеристики исходных органов сохраняются не только в процессе культивирования, но также дифференцировки и морфогенеза (Бутенко, 1999). Так, двудольные травянистые растения обладают более выраженной способностью к регенерации, чем однодольные и древесные растения. В стеблях большинства однодольных камбий отсутствует, и это в какой-то степени ограничивает возможность регенерации ими утраченных частей (Эсау, 1969). У части растений отмечена прямая корреляция между способностью к вегетативному размножению in vitro и in vivo. Многие растения из порядков Amaiyllidales, Liliales (амарилис, нерине, гиацинт, нарцисс, лилия) размножаются в культуре тканей адвентивными луковичками (Stanilova et. al., 1994; Jeong, 1996; Varshney et al., 2001; Bahr, Compton, 2004; Миронова, 2005), что соответствует традиционному методу их вегетативного размножения дочерними луковичками.
О.А. Чурикова (2000), изучив в качестве эксплантов луковичные чешуи и листья низовой и срединной формации семи видов p. Lilium (L.regale Wils., L.longiflorum Thunb., L. speciosum Thunb., L. pardalinum Kellogg., L. candidum L., L. martagon L., а также Hyacinthus orientalis L., сорт Anna Maria), сделала вывод о большей регенерационной активности внутренних чешуи по сравнению с наружными, как у лилий, так и у гиацинта. Морфогенетический потенциал листьев лилий и гиацинтов ею определен как более низкий по сравнению с луковичными чешуями. На наш взгляд, это говорит об акропетальном усилении регенерационной способности у листьев лилий и гиацинта. Ф.М. Куперман (1973) отмечает, что на практике всегда необходимо учитывать онтогенетическую разнокачественность почек на побеге: чем выше по стеблю взяты черенок или почка, тем быстрее идут процессы онтогенеза у полученных из них растений, и они быстрее переходят к цветению.
Введение в культуру in vitro Lilium pilosiusculum (Freyn) Miscz. с помощью семян
Европейские исследователи используют в работе с культурами ткани типовой вид - L. martagon L. s. str. Так, была разработана методика получения каллуса из эмбриональных тканей семян L. martagon L. (Pelkonen, 2005; Kedra, Bach, 2005). Рассматриваемый в данной работе вид L. pilosiusculum не был вовлечен в биотехнологические исследования.
Нами была поставлена задача — провести сравнительный анализ всхожести спелых и неспелых семян L. pilosiusculum в культуре in vitro; определить возможные пути ускорения онтогенеза проростков и получения наибольшего количества дочерних микролуковичек от одного семени.
Собранные в августе, т.е. в первый срок коробочки (вне зависимости от года) были еще зеленые, семенная кожура белого цвета, что свидетельствует о незаконченности формирования как стенок плода, так и самой семенной кожуры. Так как размер семян не отличался от такового у собранных в сентябре из спелых вскрывающихся коробочек, мы охарактеризовали семена первого сбора как неспелые - по терминологии Р. Е. Левиной, (1981), которой выделена модификационная и генотипи ческая неоднородность семян. Матуральная неоднородность (от лат. maturitas -спелость), т.е. различия, связанные с разной степенью спелости семян к моменту уборки, Розой Ефимовной отнесена к первому типу -модификационной неоднородности. Разная степень спелости семян, как правило, связана с их месторасположением на особи или в соплодии. У видов с многоцветковыми соцветиями и растянутым периодом цветения и плодоношения, разная степень спелости семян наблюдается как в одном, так и в разных плодах, находящихся на одном растении (там же, стр. 65 -66).
Семена лилий секции Martagon имеют глубокий морфофизиологический покой, обусловленный наличием ингибиторов и недостаточной газопроницаемостью тканей, окружающих зародыш (Николаева, 1982). Твердыми могут стать и неспелые семена, очень быстро теряющие влагу (до 3-5%). Такие семена долго не выходят из покоя или вообще теряют жизнеспособность. Семена различной спелости могут оказаться неоднородными по ряду признаков: степени развития зародыша, химическому составу эндосперма, по влажности и, что весьма существенно, по характеру прорастания.
В природных условиях у некоторых растений Lilium pilosiusculum, имеющих от 5 и более плодов, одновременно на одной особи нами могли быть отмечены неспелые семена разных фаз поспевания, спелые набухающие и твердые семена
При разработке оптимальной методики стерилизации семян L. pilosiuscalum были применены такие вещества как этанол и сулема. Двухлористая ртуть (сулема) - является эффективным стерилентом для многих растительных объектов (Калинин и др., 1980), но из-за токсичности данного соединения необходимо очень тщательно подбирать его концентрацию и продолжительность стерилизации для снижения повреждения растительных тканей. После выдерживания в растворах стерилентов и трехкратной промывки в стерильной воде, семена были высажены на безгормональную среду MS. В результате было установлено, что эффективное воздействие ртутьсодержащего препарата сулемы увеличивалось после предварительной стерилизации семян 70 %-м этанолом в течение одной минуты. Отмечено, что всхожесть семян уменьшалась как при увеличении времени их стерилизации, так и при воздействии высоких концентраций сулемы (табл. 3, рис. 5).
Инфицированность (ряд 1) и всхожесть (ряд 2) неспелых семян L. pilosiusculum в зависимости от схемы применения стерилизующих веществ (варианты 1-6: 1- Контроль (посев in vivo; 1 - 0,2 %-я сулема - 10 мин; 3 - 0,5 %-я сулема - 10 мин; 4 -70%-й этанол - 1 мин - 0,2 %-я сулема -7мин; 5 - 70%-й этанол - 1 мин — 0,2 %-я сулема -10 мин; 6 - 70%-й этанол - 1 мин -» 0,2 %-я сулема -17мин. Таким образом, на основании проведенных исследований, для получения стерильной культуры in vitro был предложен следующий способ стерилизации неспелых семян данного вида лилии: предварительная стерилизация коробочек 70 %-м этанолом в течение одной минуты, затем стерилизация 0,2 %-м водным раствором сулемы в течение 7 минут.
Семена, посеянные в октябре и в марте следующего года, были собраны из спелых коробочек с одного и того же растения. В марте семена были посеяны после хранения в течение 6 месяцев при 20 С.
Практическое применение методов культуры in vitro для получения регенерантов сортовых лилий, хост и лилейника
При введении в культуру тканей и органов цветков сортовых лилий, относящихся к различным гибридным группам, а также сортов хост и лилейника, нами применены те же методы стерилизации и дальнейшего культивирования, описанные ранее в главе 2 в разделах, касающихся методов, предложенных для видовых лилий. Задача данного исследования заключалась в сравнении регенерационной способности тех же типов эксплантов, которые были изучены у четырех видов лилий для разработки протокола массового получения идентичных исходному генотипу регенерантов у различных сортов лилий, хосты и лилейника. Для ее решения особенное внимание уделено изучению путей морфогенеза в культуре тканей и органов цветков, т.к. для получения в культуре in vitro растений, идентичных исходным сортам наиболее рационален и применим путь прямого органогенеза, в отличие от образования регенерантов непрямым путем через каллусогенез.
В качестве модельного объекта был взят восточный гибрид «Сибирь», используемый для выгонки в теплицах. В ноябре месяце от тепличных растений отбирались неокрашенные бутоны длиной 30-40 мм. Изолированные экспланты помещались на агаризованную питательную среду N6m, к которой добавлялись сахароза в количестве 40 г/л, агар 7 г/л и регуляторы роста: ауксины (2,4 Д и НУК) и цитокинин БАЛ. Нами была отмечена морфогенетическая способность разных типов эксплантов через 3 месяца культивирования на среде N6 с регуляторами роста (табл. 16).
Из представленных в таблице данных следует, что единственным типом эксплантов, у которого отсутствовал каллусогенез при формировании луковички, были тычиночные нити с пыльником и фрагментом цветоложа. У остальных типов эксплантов, взятых из цветков лилии сорта «Сибирь» в стадии бутонизации, адвентивные почки закладывались в каллусной ткани.
Примечание: ГР- гемморизогенез; К- каллусогенез; Р- ризогенез; — прочерк означает отсутствие морфогенетической реакции у данного вида эксплантов на вариантах среды N6m
В том случае, если содержание ауксина 2,4 Д в среде N6m составляло 2 мг/л, у трех типов эксплантов образовывался как каллус, так и корни. Из 4 изученных типов эксплантов у данного сорта лилии был выстроен следующий ряд в порядке убывания регенерационной способности: 1) тычиночные нити с пыльником и небольшим фрагментом цветоложа; 2) фрагменты цветоложа; 3) поперечный срез оси соцветия; 4) тычиночные нити с пыльником. Коэффициент размножения лилии сорта «Сибирь» в культуре in vitro (количество регенерантов на эксплант) через 6 месяцев культивирования составлял в ряду вышеперечисленных эксплантов: А-0,76А-0,38А-0,14А (где А=14, 83 - максимальное число регенерантов, полученных из цветоложа, находящегося в основании тычиночных нитей).
При введении в культуру тканей и органов цветка, полученных от сортов лилий, относящихся к различным гибридным группам, генотипический фактор не был сильно выражен: микролуковички были получены на среде N6m с добавлением тех же регуляторов роста (см. табл. 16) от всех введенных в данный эксперимент сортов лилий (всего их насчитывалось 50). Различия между генотипами выражались только в интенсивности и продолжительности процесса образования микролуковичек.
При продолжительном культивировании на среде Уг MSM или ХА N6M, не содержащих регуляторы роста, у всех микролуковичек из разных гибридных групп лилий происходил процесс образования новых точек роста в течение 2-3 лет (рис. 25). Использование эксплантов тканей и органов цветков позволило получить через год от одного бутона сорта «Сибирь», в среднем, до 60 регенерантов, диаметр луковичек которых превышал 8 мм.
Нами одновременно был проведен эксперимент как по введению эксплантов цветков сорта «Сибирь» в стерильную культуру, так и чешуевание луковиц данного сорта по стандартной методике (Баранова, 1990) в условиях in vivo.
Надо отметить, что морфообразовательный процесс у этого сорта лилии проходил только в культуре in vitro, тогда как чешуйки, отделенные от луковицы, некротизировались или загнивали, что могло быть результатом проявления высокой инфицированности тканей луковичных чешуи.
У большинства сортов лилий, коэффициент размножения эксплантов цветков в стерильной культуре был более высокий, чем при традиционном способе размножения — чешуйкованием, при котором количество полученных луковичек от одной луковичной чешуи in vivo не превышало 4-5 (Баранова, 1990).
Введение в стерильную культуру сорта «Sabin Bayer» p. Hemerocallis, используя экспланты тканей и органов цветка
Гибридные сорта рода Hemerocallis -высокодекоративные, устойчивые к заболеваниям растения, как нельзя лучше приспособленные к условиям умеренного резко континентального климата Западной Сибири. При использовании традиционных методов размножения сортов лилейника сложился дефицит новых высоко декоративных сортов. Биология вида такова, что рост побегов из пазушных почек ювенильных растений происходит с низкой скоростью, вследствие чего коэффициент размножения у сортов лилиеников обычно невелик и деление куста возможно только спустя 2-3 года, в течение которых у материнского растения образуется от 1 до 3 дочерних побега. Таким образом, существует необходимость разработки методики размножения ценных генотипов рода Hemerocallis в культуре in vitro. Работы исследователей по введению лилейников в стерильную культуру, часто не содержат подробных методик и схем взятия эксплантов (Heuser, Apps, 1976; Чурикова, 2000).
Мы применили методику введения в стерильную культуру тканей и органов цветка, разработанную нами на различных представителях p. Lilium, для размножения новых декоративных сортов лилейников в культуре in vitro. В результате сравнения способности к морфогенезу у одних и тех же эксплантов, выделенных из бутонов разных возрастов, как и у разных типов эксплантов, были сделаны следующие выводы: а) у лилейников в культуре in vitro наиболее активно закладываются адвентивные почки в основании цветоложа, а также на поперечных срезах осей соцветий; б) наибольшая способность к побегообразованию у данного вида экс плантов была отмечена у неокрашенных бутонов, высота которых не пре вышала 20 мм. в) необходимым фактором органогенеза являлось включение в состав инициирующей среды как ауксина 2,4-Д (0,5-0,6 мг/л), так и цитокинина БАП (0,4-1 мг/л).
