Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1. Климат и почвы Республики Татарстан
2. Общая характеристика Trichoderma/Hypocrea
2.1. Положение Trichoderma/Hypocrea в системе Ascomycota
2.2. Морфологическая характеристика Trichoderma/Hypocrea
2.3. Современная система Trichoderma/Hypocrea
2.4. Генетическая вариабельность Trichoderma
2.5. Методы в систематике Trichoderma
2.6. Внутривидовая изменчивость Trichoderma
2.6.1. Гетерогенность Trichoderma
2.6.2. Культурально-морфологические типы
2.6.3. Типы взаимодействия грибных гиф
2.6.4. Исследование популяционной структуры грибов
2.6.5. Вегетативная совместимость
2.7. Литические ферменты Trichoderma
2.7.1. Характеристика целлюлаз Trichoderma
2.7.2. Характеристика ксиланазного комплекса Trichoderma
2.7.3. Характеристика протеаз Trichoderma
3. Экология Trichoderma
3.1. Распространение Trichoderma в природе
3.2. Влияние внешних факторов на Trichoderma
3.2.1. Влияние температуры на Trichoderma
3.2.2. Влияние водного потенциала на Trichoderma
3.2.3. Влияние рН-фактора на Trichoderma
3.2.4. Влияние ионов металлов на Trichoderma
3.2.5. Влияние доступного кислорода на Trichoderma
3.2.6. Влияние субстрата и других необходимых элементов на Trichoderma
3.2.7. Влияние почвы на Trichoderma
3.2.8. Влияние антропогенных факторов на Trichoderma
3.3. Влияние Trichoderma на окружающую среду
3.3.1. Роль Trichoderma в круговороте веществ и преобразовании антропогенных загрязнений окружающей среды
3.3.2. Влияние Trichoderma на почву
3.3.3. Влияние Trichoderma на микробиоценоз
3.3.4. Взаимодействие Trichoderma с растениями
3. 3.4.1. Отрицательные взаимодействия
3.3.4.2. Положительные взаимодействия
3.3.4.3. Индукция резистентности растений к патогенам
4. Применение Trichoderma в сельском хозяйстве
4.1. Производство и применение биофунгицидов на основе Trichoderma
4.2. Применение ферментов Trichoderma
4.3. Применение Trichoderma для производства кормов
4.4. Применение Trichoderma для переработки отходов 4.4.1. Получение биокомпостов с применением Trichoderma
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы
1. Материалы
1.2. Характристика почв агроклиматических зон РТ
1.3. Схема отбора проб для выделения изолятов Trichoderma 3.Методы
3.1. Выделение Trichoderma из почвы
3.2. Получение моноспоровых культур
3.3. Среды для культивирования Trichoderma
3.4. Определение кинетических параметров, размеров объектов
3.5. Определение цвета
3.6. Идентификация
3.7. Вегетативная совместимость
3.8. Культурально-морфологические типы колоний
3.9. Определение физиологических параметров
3.10. Антагонистическая активность
3.11. Ферментативная активность изолятов Trichoderma
3.12. Определение фитотоксичности почвы и культуральной жидкости Trichoderma
3.13. Определение токсичности к микроорганизмам и мутагенного потенциала почвенных вытяжек и культуральной жидкости Trichoderma
3.14. Определение фунгистатического действия почвы
3.15. Молекулярно-генетический анализ Trichoderma
3.16. Наблюдение и учет микроорганизмов почвы
3.17. Определение «потенциальной» активности азотфиксации
3.18. Определение активности почвенного дыхания
3.19. Определение общей микробной биомассы в почве
3.20. Определение ферментативной активности почвы
3.21. Расчет коэффициента микробиологической активности
3.22. Фитоэкспертиза семенного материала
3.23. Получение культуры Trichoderma, устойчивой к антибиотикам и пестицидам
3.24. Получение биопрепарата триходермин (фитотрикс) на основе Trichoderma
3.25. Определение биологической эффективности биопрепаратов
Глава 3. Результаты исследований и обсуждение
1. Распространение Trichoderma на территории Республики Татарстан
2. Морфологические и молекулярно-генетические характеристики изолятов, выделенных на территории РТ
2.1 .Морфологическая характеристика видов Trichoderma, выделенных на территории Республики Татарстан
2.2. Молекулярно - генетическая характеристика аборигенных изолятов Trichoderma
3. Популяционная гетерогенность изолятов Trichoderma, выделенных на территории РТ
4. Гетерогенность природных популяций Trichoderma: вегетативная совместимость клонов в популяциях и культурально-морфологические типы колоний
5. Гетерокариоз изолятов Trichoderma, выделенных из почв РТ
6. Интенсивность спороношения
7. Внутривидовая конкурентоспособность и взаимоотношения с фитопатогенными микроорганизмами в опытах in vitro
8. Стратегии жизни изолятов Trichoderma в экосистемах
9. Ферментативная активность автохтонных изолятов грибов Trichoderma
10. Кинетика изолятов Trichoderma
11. Влияние экологической ниши и вида адсорбента на жизнеспособность T.harzianum
12. Взаимоотношение изолятов Trichoderma с растениями (фитотоксичность)
13.Токсичность, генотоксичность и мутагенный потенциал изолятов Trichoderma
Н.Использование Trichoderma в сельском хозяйстве Рекомендации производству Обсуждение Заключение ВЫВОДЫ Приложение ЛИТЕРАТУРА Иллюстрации Акты испытаний
- Климат и почвы Республики Татарстан
- Внутривидовая изменчивость Trichoderma
- Характристика почв агроклиматических зон РТ
- Распространение Trichoderma на территории Республики Татарстан
Введение к работе
Актуальность работы. В современных условиях ведения земледелия особую актуальность приобретают две проблемы. Это постоянно растущие затраты на производственную продукцию, вызванные применением традиционных многооперационных технологий возделывания сельскохозяйственных культур, постоянным и значительным повышением цен на энергоносители, сельскохозяйственную технику, минеральные удобрения, средства защиты растений и другие виды промышленной продукции. Вторая проблема связана с потерей плодородных почвенных ресурсов, снижением видового разнообразия микроорганизмов и ухудшением экологической и фитосанитарной обстановки окружающей среды. В настоящее время идет быстрое и повсеместное сокращение площадей с естественной растительностью. В то же время известно, что только природные комплексы с условно коренной растительностью способны поддерживать состояние среды на приемлемом для жизни уровне. В связи с этим особый интерес при экологических исследованиях представляют ненарушенные леса, расположенные на территории заповедников, которые могут служить эталоном природных ландшафтов со всем видовым разнообразием, населяющих их организмов, а также почвы, не затронутые деятельностью человека.
Территория Республики Татарстан в настоящее время имеет около 19% территории, покрытой сильно нарушенными лесными природными системами. Исключение составляют отдельные хорошо сохранившиеся хвойные участки леса Раифского лесничества Волжско-Камского заповедника Национального парка «Нижняя Кама». Лесопитомники, используемые для восстановления лесов, характеризуются резким ухудшением агрохимических характеристик. В результате этого почти пятая часть всходов и сеянцев ежегодно погибает от болезней, а в отдельные годы отмечалась даже стопроцентная гибель сеянцев.
Современные технологии обеспечивают последовательную замену энергоемких минеральных удобрений и пестицидов биопрепаратами нового поколения, разработанными отечественными микробиологами, и препаратами, производимыми отечественными биологическими фабриками. В современных процессах используется микробиологический мониторинг почвенных угодий с целью своевременной оценки ухудшения экологической ситуации, безопасных технологий для сельскохозяйственной промышленности.
Одним из наиболее перспективных видов микроорганизмов для внедрения ресурсосберегающих технологий в сельское хозяйство являются грибы рода Trichoderma, которые представляют собой наиболее изучаемые грибы в настоящее время. Представителей рода Trichoderma можно найти практически во всех почвах. Их считают, по крайней мере, частично ответственными за эффект биологического контроля фитопатогенов в супрессивных почвах, на которых зерновые и деревья не подвергаются действию патогенов и микотоксинов, выделяющихся в окружающую среду.
Возможно, что Trichoderma - это единственный род грибов, для которого каждый вид представлен в GeneBank NCBI, по крайней мере, одним геном, и многие виды представлены последовательностью двух или более генов. В целом в Банке генов хранится информация о 427 видах Нуросгеа (телеоморф) и о ПО видах Trichoderma. Согласно последним данным, более 40% видов, представленных в GeneBank NCBI, (44 названия) являются синонимами или идентифицированы неверно.
Причиной возрастающего интереса к Trichoderma является большая практическая и экологическая значимость рода. Виды Trichoderma являются продуцентами ферментов (целлюлаз, хитиназ, пектиназ, ксиланаз, серинзависимых протеиназ и др.), используемых в целлюлозно-бумажной и пищевой промышленностях, в производстве моющих средств, в получении спирта, преобразовании отходов, содержащих целлюлозу и глюкозу, для получения кормовых добавок и в текстильной промышленности. На основе антибиотиков, токсинов и ферментов грибов этого рода получают препараты для биологического контроля болезней и стимуляции роста растений и получения трансгенных растений. Trichoderma также используется для биологической очистки почвы и для получения биокомпостов.
В рамках данного вопроса исследования биоразнообразия определяются как зондирование перспективности использования определенных природных источников с коммерческой целью. Именно такой подход определил разработку международной «Конвенции по биологическому разнообразию» в качестве законодательства по использованию ценных генетических ресурсов.
В настоящее время перед микологами, изучающими Trichoderma, стоит ряд вопросов: по систематическому положению вида, адекватным методам идентификации, по построению естественного филогенетического древа, географической распространенности, разнообразию и выявлению способности к антагонистической активности к фитопатогенам среди всех видов данного рода, по наличию в природе новых видов, в том числе промышленно значимых.
В связи с вышесказанным представляет большой практический интерес анализ распространенности и сохранения видового разнообразия грибов рода Trichoderma на территории Республики Татарстан и их роли в биогеоценозе и антропогенных ландшафтах, а также возможности использования в сельскохозяйственной промышленности.
Целью настоящего исследования явилась оценка биоразнообразия, динамики численности и характеристик структуры популяций Trichoderma в современных почвенных и антропогенных ландшафтах, в эталонных зонах (погребенных и заповедных) на территории РТ, а также выявление основных закономерностей изменения микробиологической активности агроценозов под влиянием антропогенных факторов и роль в этих процессах интродукции штаммов Trichoderma.
Задачи исследования -
Исследование распространения грибов рода Trichoderma и идентификация аборигенных штаммов Trichoderma, выделенных на территории Республики Татарстан, с использованием морфологических, кинетических и молекулярно-генетических методов.
Исследование стратегии жизни, внутривидовой и популяционной гетерогенности местных штаммов Trichoderma, выделенных из различных почвенно-климатических зон Республики Татарстан.
Исследование биохимических свойств штаммов видов Trichoderma: фитотоксичности культуральных жидкостей и некоторых ферментов гидролазного комплекса.
Оценка степени влияния различных экологических параметров на выживаемость штаммов Trichoderma.
Изучение взаимоотношения штаммов Trichoderma с растениями, фитопатогенными и сапротрофными почвенными микроорганизмами.
Отбор стабильных штаммов - продуцентов биопрепаратов по культурально - морфологическим признакам, антибиотической активности, вегетативной совместимости, устойчивости к фунгицидам, взаимодействию с регуляторами роста и бактериями.
Оценка биологической активности различных почвенно-климатических зон Республики Татарстан по данным микробиологического мониторинга. Изучение влияния антропогенных факторов и биоудобрений с активными штаммами Trichoderma на микробиологическую активность почв Республики Татарстан.
Разработка способов применения местных штаммов Trichoderma в промышленности Республики Татарстан с целью получения кормовых добавок (ксиланазы Trichoderma) для животноводства, переработки растительных, животноводческих, а также городских отходов с целью получения биоудобрений, и для получения биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.
Научная новизна. Впервые определен видовой состав и географическое распространение грибов рода Trichoderma на территории РТ. Выделены типичные и случайные виды Trichoderma в современных, погребенных и затопляемых почвах. По данным молекулярно-генетического анализа выделены новые виды Trichoderma из погребенных почв и могильников на территории РТ. Установлена гетерогенность природных популяций Trichoderma и их структура. В области биотехнологии и защиты растений данное исследование дает исходный материал для инвентаризации ресурсов микромицетного населения по данным одного рода Trichoderma и теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно важных микроорганизмов (например, из погребенных почв выделены виды, перспективные для получения биофунгицидов, биогербицидов и продуцентов ксиланаз). Установлены механизмы регуляции численности интродуцированных изолятов Trichoderma в микрокосмах, защищенных грунтах, в полевых условиях и прикорневой зоне растений.
Показана принципиальная возможность управления численностью микробных популяций, моделирования отдельных стадий сукцессии. Полученные при этом результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля применения биофунгицидов и биоудобрений. Впервые изучена эколого-биологическая значимость видов рода Trichoderma в почвенной биоте. Выявлена роль Trichoderma в регуляции супрессивности почв на территории Республики Татарстан. Описана структура популяций Trichoderma при взаимоотношении с растениями. Установлено, что доля фитотоксических видов зависит от типа стадии сукцессии и типа экологической ниши. Описан комплекс видов фитопатогенных микромицетов, вызывающих поражение сеянцев хвойных, овощных и зерновых культур. Впервые выявлены местные изоляты Trichoderma с высокой антагонистической активностью в отношении почво-обитающих патогенных микромицетов и семенных инфекций. Разработаны оптимальные условия культивирования активных штаммов в различных биотехнологических системах, и получен биопрепарат новой формы на основе микромицетно - бактериального сообщества с использованием природных регуляторов и промышленных и сельскохозяйственных отходов. Впервые показана целесообразность использования биопестицида на основе Trichoderma для ограничения численности возбудителей инфекционных заболеваний яровых и озимых зерновых культур, а также сеянцев сосны на территории Республики Татарстан. Впервые с позиций системного подхода исследован широкий спектр разнонаправленных микробиологических и биохимических параметров различных природных - климатических зон на территории Республики Татарстан. Показано, что введение в агроэкосистему определенных видов и различных сочетаний удобрений, известкования и сочетания удобрений с известкованием, а также биоудобрений оказывает положительное фитотерапевтическое действие на растения и влияет на уровень супрессивности и плодородие почв. Установлены закономерности биосинтеза ксиланаз у представителей рода Trichoderma. Впервые проведено исследование влияния рН .и температуры, соответствующих параметрам желудка моногастричных сельскохозяйственных животных, а также воздействия гидротермической обработки на активность ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma. Основные положения, выносимые на защиту:
Запасы жизнеспособных пропагул Trichoderma изменяются в зависимости от расположения в почвенном профиле, от затопляемости почв, антропогенной нагрузки.
Распространение, морфологические, молекулярно-генетические, кинетические характеристики и экологические стратегии штаммов рода Trichoderma зависят от типа экологических ниш и почв.
Смена популяций штаммов Trichoderma с различной стратегией жизни зависит от стадий сукцессии экологической ниши.
Микробиологическая активность, биотический потенциал фитопатогенных грибов в агроценозах изменяются в широком диапазоне в
зависимости от типа почвы, биологической активности, окультуренности, внесения удобрений, мелиорантов и фитосанитарного состояния культур в севообороте.
Минеральные, органические удобрения и известкование почвы оказывают разнонаправленное действие на биологическую активность и супрессивность агроценозов.
Отдельные изоляты рода Trichoderma могут использоваться для восстановления плодородия почв в виде биокомпостов на основе осадков сточных вод крупного промышленного города, отходов пищевых предприятий и сельскохозяйственных производств, а также для получения биопестицидов, биогербицидов для защиты растений от заболеваний, с целью восстановления супрессивности и регуляции биологической активности почв.
Стабильность культурально - морфологических признаков Trichoderma является критерием отбора антагонистов.
Практическая значимость работы. В области биотехнологии и защиты растений данное исследование дает исходный материал для инвентаризации ресурсов микромицетного населения по данным одного рода Trichoderma, теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно важных микроорганизмов. Например, из погребенных почв выделены виды, перспективные для получения биофунгицидов, биогербицидов и продуцентов ксиланаз. Установлены механизмы регуляции численности интродуцированных изолятов Trichoderma в микрокосмах, защищенных грунтах, в полевых условиях и прикорневой зоне растений. Показана принципиальная возможность управления численностью микробных популяций, моделирования отдельных стадий сукцессии. Полученные при этом результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля и применения биофунгицидов и биоудобрений. Предложен комплекс методов для проведения микробиологического мониторинга, адекватно отражающего состояние биоты и позволяющего прогнозировать возможные эпифитотии. Предложены способы получения биокомпостов на основе осадков сточных вод, отходов пищевых и сельскохозяйственных производств, с использованием штаммов Trichoderma с-высокой гидролазной, фунгицидной и гербицидной активностями с целью внедрения препаратов в практику лесного и сельского хозяйств Республики Татарстан для восстановления плодородия и супрессивности почв. Разработана технология получения биопестицида на основе отходов пищевых предприятий, которая была внедрена в практику производства биопрепаратов на базе биозавода на территории совхоза «Казанский тепличный». Показана возможность использования гидролазного комплекса Trichoderma для переработки отходов спиртовой промышленности в РТ. Разработаны методики снижения антипитательного действия пентозанов при помощи ксиланаз Trichoderma, что позволило правильно подбирать дозировки препаратов ксиланаз в зерновые рационы, содержащие пентозаны. Результаты исследований
используются для подготовки лекций на биолого - почвенном факультете КГУ по курсам «Биология почв», «Сельскохозяйственная микробиология», «Экология микроорганизмов», «Микология», «Почвенная микробиология». Монография «Микробная биотехнология» Изд-во Казань УНИПРЕСС 2006г. рекомендована для обучения студентов и аспирантов биолого - почвенного факультета КГУ.
Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались
на Всесоюзн. Конф. «Микроорганизмы стимуляторы и ингибиторы роста
растений и животных». - Ташкент. - 1989, Всесоюзн. Совещ.: Нуклеазы
микроорганизмов и их практическое применение // Рига. - 1989, Всесоюзн.
Конф.: Методы получения, анализа и применения ферментов. - Рига. -1990. -,
5 Междунар. Симп. Молодых Ученых. - Болгария, Варна. - 1990., Научн.
Конфер. // Днепропетровск. - 1991. , Всесоюз. Симпозиуме: Микробиология
охраны биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия. - Оренбург. - 1991,
Всесоюзной Конфер. «Экологические проблемы фармакологии и
токсикологии». - Москва. - 1991, Раб. Совещ.: Регуляторы роста и развития
растений. - Москва. - 1991,.5-ой Всероссийск. Конфер.: Новые направления в
биотехнологии. - Пущино. - 1990, Всесоюз. Конфер.: Ферменты
микроорганизмов. - Казань. - 1991, Всесоюзн. Конфер.: Микроорганизмы в
сельском хозяйстве. - Пущино. - 1992., Научн. Конфер.: Эволюция почв и
почвенного покрова в связи с изменением природной среды // Пущино. -
1992, 6-ой Всероссийской Конфер.: Новые направления биотехнологии. -
Пущино. - 1994, Конф.: Физиология и биохимия мицелиальных грибов в
связи с проблемами биотехнологии. - М. - 1994., Конфер.: Генетика -
народному хозяйству. - Москва. - 1994, Всесоюзная конфер.: Интродукция
микроорганизмов в окружающую среду. - М. - 1994, Forum for applied
biotechnology. - Brugge. - 1995, Advanced Biotechnologies and Agriculture. -
Ferrary-Itali. - 1995, 7th international symposium. - Santos-Brazil. - 1995, III
Международн. Конфер.: Регуляторы роста и развития растений. - М. - 1995,
Intern. Co-Conf. On ICEP95-ICONE95. - St.Peterburg, Russia. - 1995,
Материалы 3-й международной конференции по химии нефти. - Томск. -
1997, 3-й Республ. Научн. Конфер.: Актуальные экологические проблемы
районов Татарстана. - Казань. - 1997, 3-й Научно-практич. Конфер.:
Достижения и перспективы развития селекции семеноводства
сельскохозяйственных культур. - Пенза. - 1999, Всероссийской Научной Конфер.: Экологические проблемы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья. - Саранск. -1999, 9-th International Congress of Mycology. - Sydney. - 1999, Yl-th International Simposium: In suti and onside bioremedition. - San-Diego, California. - 1999, Междунар. Научн. Конфер. Изучение и охрана биологического разнообразия ландшафтов русской равнины: - Пенза. - 1999, X-th International Soil Conservation Organisation Conferens. - 1999, Научной конфер.: - Новочеркасск. - 2000, Всероссийской научно-практич. Конфер.: Актуальные вопросы мониторинга экосистем антропогенно-нарушенных территорий. - Ульяновск. - 2000, Всероссийской конференции «сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках» 14-19 июня 2001 г, 1-
ом Съезде микологов России «Современная микология в России» М., 2002, Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. 7-ая международная конференция Санкт- Петербург 15-18 сент 2003, «8-ой, 9-ой Пущинской школах-конференциях молодых ученых. Биология - наука XXI века. 17-21 мая 2004, 2005,2006». - Пушино, 7-ой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана»,Санкт-Петербург - Репино, 15-18 сентября 2003г.,Научно-практическая конференции' «Биотехнологии - на поля Татарстана». ОАО "Казанская ярмарка", Казань-2004, Международной научной конференции авг. 25 - сент. 5, 2003, 13-ая международная конференция «Ферменты микроорганизмов: структура, функция, применение». - Казань: КГУ, 2005, Международной научно- практической конференции «Перспективы и проблемы развития битехнологии в рамках единого экологического пространства стран содружества» 25-28мая, 2005, Минск-Нарочь, Республика Белорусь, Научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», Казань, 17-18 июня 2004, Втором съезде Общества биотехнологов: Москва, 13-15 октября 2004, Межд. научно-практ. конф. по развитию сотрудничества между Республикой Татарстан и Германией в рамках Президентской программы "Дни Германии в Татарстане и перспективы развития экологического сельского хозяйства и природопользования в Республике Татарстан", 5-6 ноября 2004, Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» 28 - 29 ноября, 2005, XX Congreso National Microbiologia Caceres, Espana. 19-22 septiembre 2005 Ponencias у Comunicaciones "Universidad de Extremadura" Sociedad Espanola de Microbiologia, Symposium of Biology Students in Europe" Finland 2005 University of Helsinki Department of Biology July 29th to August 7th 2005, Межд. Конф «Грибы и водоросли в биогеоценозах- Москва МГУ., Зіянв. - 3 февраля 2006, 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium. Vienna, Austria, 5-8 April 2006.
Личный вклад автора. Основная работа по получению экспериментального материала, обобщению результатов и формулированию выводов выполнена лично автором. В выделении отдельных изолятов из тепличного грунта совхоза «Майский», фитоэкспертизе семян зерновых, испытаниях в тепличных грунтах принимали участие доцент кафедры микробиологии Захарова Н.Г. и старший инженер кафедры микробиологии Мочалова Н.К. В организации полевых исследований на базе ТатНИИСХ и ГУ «Татарский НИИ агрохимии и почвоведения РАСХН», принимали участие д.с.х. наук Шакиров Р.С., д.с.х.н. Яппаров А.Х. , зав. лаб. к.с.х.н. Ломако Е.И. Молекулярно-генетические исследования проводились при активной помощи доц. кафедры биохимии Аскаровой А.Н. и сотрудника Института химической инженерии в Вене д.б.н. Дружининой И.А., хроматографические исследования по азотфиксации и респираторной активности почв проводилось с помощью вед.н.с Гарусова А.В.,
консультации по методам анализа видов Trichoderma и гетерогенности популяций получены на кафедре микологии и альгологии МГУ у зав.каф. д.б.н. Дьякова Ю.Т., д.б.н. Лихачева А.В., к.б.н. Александровой А.В., микрофотосъемки конидий были сделаны с помощью д.б.н. Камзолкиной О.В., консультации по методам микологического анализа антропогенных ландшафтов были получены у д.б.н. проф. Марфениной О.Е., участие микроорганизмов в силосовании кормов исследовалось при участии к.б.н. Вершининой В.И., полевые испытания биоудобрений на основе компостов на основе отходов очистных сооружений г. Казани и Trichoderma для применения под сеянцы сосны проводили на базе лесопитомника Матюшинский при участии д.с.х..н. проф. Ведерникова Н.М., д.б.н. проф. Селивановской С.Ю., пробы из зон контакта площадей питания Pinus sylvectris L. Раифского заповедника получены от нач. отдела Росприроднадзора России к.б.н. Морозкина А.И., к.б.н. Каримуллиной СМ., почвенные образцы из древних поселений получены с помощью доц. каф. почвоведения и агрохимии КГУ Мельникова Л.В., образцы черепов из древних захоронений и описания к ним получены с помощью сотрудников ин-та истории им. Марджани АНРТ Газимзянова И.Р., Чижевского А.А., к.б.н., конструирование праймеров и программные модели для морфологической и молекулярно - генетической идентификации Trichoderma сделаны при участии с.н.с. каф. биохимии к.б.н. Акберовой Н.И. и аспиранта каф. генетики Тарасова Д.С.
Публикации. По теме диссертации в отечественной и зарубежной печати опубликовано 90 научных работ, в том числе 1 коллективная и 2 авторские монографии, 68 научных статей, 15 учебных пособий и методических руководств. Получено 4 патента.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на _436_ стр. компьютерного текста, состоит из введения, 3 глав, включающих _8_разделов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающей 159 наименований (из них 112 на иностранных языках), и приложения.
Климат и почвы Республики Татарстан
Республика Татарстан располагается в пределах Восточно-Европейской (Русской) равнины. Крупнейшая река Европы Волга, дренирующая эту равнину и изменяющая направление течения с субширотного на меридиональное, делит территорию республики на две неравновеликие части. Меньшая правобережная, именуемая Предволжьем, является северовосточным окончанием Предволжской возвышенности. Большая правобережная часть расчленяется долиной крупнейшего левобережного притока реки Волги рекой Камой - на Предкамье и Закамье, которые в свою очередь разделяются соответственно на Западную (Вятские Увалы и северную часть Низкого Заволжья) и Восточную части.
Общим очертанием территория Татарстана напоминает прямоугольник, длинная сторона которого вытянута с запада на восток на расстояние 450 км, а короткая - с севера на юг на расстояние около 285 км. Она ограничивается географическими координатами 5640,5 и 5358 с.ш. и 4716 и 5417 в.д. Общая площадь территории составляет около 67,6 тыс. км2.
В пределах Татарстана располагаются таежная, подтаежная и лесостепная зоны. Типичные таежные леса обнаруживаются только в пределах северной части Закамья и Восточного Предкамья. Южнее произрастают лиственные леса, которые постепенно переходят в лесостепь, занимающую Южное Предволжье и большую часть Закамья.
Республика Татарстан отличается неоднородностью климата, что объясняется тем, что она располагается в глубине европейского континента, где сталкиваются различные направления атмосферно-циркуляционных процессов. Изменчивость этих направлений обусловливает разнообразное сочетание погодных условий по годам, сезонам и отдельным зонам.
По величине среднесуточных температур воздуха на территории республики выделены четыре агроклиматических района: - прохладный - охватывает Предкамскую часть республики, где сумма температур составляет 2070 - 2130С; - умеренно-прохладный - занимает восточную возвышенную часть республики с суммой температур 2150 - 2200С; - умеренно-теплый - к этому району относится юго-западная часть республики с суммой активных температур 2200 - 2250С; - теплый - занимает территорию Западного Закамья; сумма активных температур несколько выше 2250С.
Территория Республики Татарстан занимает 6784,7 тыс. гектаров, из них за сельскохозяйственными предприятиями закреплено 4435,4 тыс. гектаров, в том числе сельскохозяйственные угодья занимают 4064,6, а пашня - 3605,7 тыс. гектаров.
Облесенность всей территории составляет 16,4%, а пашни всего лишь 2%. В общей площади сельскохозяйственных угодий на долю черноземов приходится 39,3%, серых лесных почв - 38,4%, дерново-подзолистых - 6,2%, аллювиальных (пойменных) - 4%. Преобладающее большинство почв (95,21%) характеризуется тяжелым механическим составом (Люлин и др., 1992).
По последним данным агрохимслужбы в республике имеется 1671 тыс. гектаров кислых почв. Средневзвешенное содержание гумуса составляет 5,9%, подвижного фосфора и обменного калия соответственно 136,5 и 138,2 мг/кг почвы.
Таким образом, в почвенном покрове республики преобладают плодородные черноземы и серые лесные почвы. Черноземы обыкновенные и выщелоченные залегают на юге Предволжья, а также в северных районах Закамья; карбонатные черноземы - на юго-востоке; серые лесные почвы - в Предволжких районах Казанской пригородной зоны и в Предкамье; аллювиальные - по долинам больших и малых рек. Дерново-подзолистые почвы сосредоточены, главным образом, в северо-западной части Предкамья.
На территории Республики Татарстан располагаются различные археологические памятники. При их исследовании можно получить доступ к палеопочвам - погребенным слоям почвы.
Палеопочвы имеют большое значение для реконструкции палеоклиматических особенностей геологического прошлого. Нередки случаи, когда в континентальных отложениях, бедных органическими остатками, палеопочвы служат едва ли не единственным источником информации о климате, ландшафтах и растительности эпохи, в которой данные почвы формировались.
В последние десятилетия был опубликован целый ряд работ, посвященных ископаемым почвам (палеопочвам) пермского и триасового периодов, описанным для разных регионов Земного шара, прежде всего, для Западной и Центральной Европы (Германия, Англия: Steel, 1974; Watts, 1976; 1978; Martens, Schneider, Walter, 1981; Schneider, Gebhardt, 1993; Schneider, Rossler, 1996, 1997), Северной Америки (США: Dunham, 1969; Estaban, Pray, 1977, 1983; Retallack, 1981), Африки (Марокко, ЮАР: Freytet, Aassoumi, Broutin et al., 1992, Plumstead, 1957; Falcon, 1986; Smith, 1990), Австралии (Retallack, 1980), и России (Чалышев, 1968; Игнатьев, 1963; Твердохлебов, 1996; Перельман, Борисенко, 1999; Якименко и др., 2000; Иноземцев, 2001; Иноземцев, Таргульян, 2002; Наугольных, 2001; Наугольных и др., 2002).
Палеопочвы, обнаруженные в верхнепермских и нижнетриасовых отложениях России, можно распределить по нескольким основным типам: (1) палеотакыры, (2) элювиально-иллювиальные глейсоли и вертисоли, (3) кальциевые литосоли, (4) красные слитые глейсоли (Наугольных и др., 2002). Наиболее представительные профили пермских палеопочв этих типов в пределах Русской платформы и Приуралья располагаются в разрезах Гребени (правый берег р. Волги в 40 км к юго-востоку от г. Казань; палеотакыры); Монастырский Овраг (правый берег р. Волги в 10 км выше г. Тетюши; правый берег р. Вятки на протяжении 30 км от г. Котельнич до с. Вишкиль; кальциевые литосоли; в этих же разрезах присутствуют элювиально-иллювиальные глейсоли); система обнажений в бассейне рек Сухона и Малая Северная Двина (разрезы Саларево, Климово, Устье Стрельны и др.; элювиально-иллювиальные глейсоли и кальциевые литосоли; последние развиты в этом регионе в меньшей степени). Нижнетриасовые палеопочвы обнаружены в бассейне р. Ветлуги (разрез Анисимово; красные слитые глейсоли), по правому берегу р. Волги ниже г. Плес; прослои педоседимента и признаки субаэральной экспозиции наблюдаются в разрезах Паршино, Черемуха и Коровка (Ярославское Поволжье, г. Рыбинск).
Почвы, наиболее напоминающие верхнепермские палеопочвы Русской платформы и Приуралья, характерны для современных областей с семиаридным или средиземноморским климатом. Это позволяет сделать предположение о том, что и в позднепермскую эпоху во время формирования описанных выше палеопочвенных профилей в пределах Русской платформы и Приуралья существовал семиаридный климат с отчетливой сезонностью, жарким и сухим летом, прохладной и влажной зимой, среднегодовой температурой около +10С - +15С; в течение года выпадало приблизительно 400 мм осадков.
Внутривидовая изменчивость Trichoderma
Присутствие видов секции Hypocreanum как субсекции в секции "Pachybasium В" требует некоторых комментариев. Самюэльс выдвинул гипотезу о том, что анаморфные виды Hypocrea с неплотной стромой, имеющие бесцветные конидии на нерегулярных мутовчатых конидиеносцах, и которые Биссет (Bissett, 1991а) поместил в секции Trichoderma Hypocreanum, могут быть синанаморфами или половыми стадиями, и поэтому их нельзя помещать в секцию Trichoderma. Так как анаморфы не были обнаружены в природе, Гаме и Биссетт (Gams, Bissett, 1998) исключили секцию Hypocreanum из, ими же определенного отдела Trichoderma. Однако филогенетические данные совершенно убедили в том, что соответствующие таксоны являются членами этого рода. Кюллинг и Градингер с соавторами (Kullnig-Gradinger, 2002) доказывали, что способность образовывать Trichoderma-подобные анаморфы могла быть утеряна в процессе эволюции этих видов. Филогения, основанная на анализе сиквенсов 28S-rDNA показала, что роды, имеющие Verticillium - подобные анаморфы (Aphysiostroma, Podocrea, Arachnocrea), наблюдаются всегда в базальной позиции (основании филогенетического древа) рода Trichoderma. Это свидетельствует о том, что от них произошел род Trichoderma. Способность формировать анаморфы с морфологией Trichoderma - подобной рассматривается как адаптивный признак в процессе перехода от обитания на грибах к сапротрофному существованию в почве и на гниющих остатках древесной формации. Эта способность была впоследствии потеряна в некоторых эволюционных линиях.
Другие виды Hypocrea с УегіїсіШит-тюдобнои морфологией как, например, у Я tawa или Я hunua произошли из других таксонов (Kullnig-Gradinger, 2002). Это указывает на то, что потеря генов или их экспрессия потребовались для того, чтобы образовались Trichoderma-подобные анаморфы в эволюции этого рода.
По результатам филогенетического анализа три других вида (Я. lutea/H. melanomagna/T. brevicompactum) также образуют единый кластер, но их связь с большой областью пока не ясна и зависит от используемых для анализа генов и видов.
Кроме этого, существует большое число видов, для которых не известны ближайшие соседи и их филогенетическая позиция в пределах Pachybasium "В". Пока еще не определена позиция Я. psychrophila/H. megacitrina. Неизвестно положение видов в областях секции Нуросгеапит; Т. spirale, которая филогенетически близка к Т. virens и Т. harzianum; Т. helicum и имеет слабую связь с Т. spirale; и Я. gelatinosa, Я chromosperma, Я. sulawensis, Я. nigrovirens и Я phyllostachidis, образующих одиночные изолированные линии вне секции Pachybasium В.
2.4. Генетическая вариабельность Trichoderma
Таким образом, уже к концу XX века генетическое разнообразие рода Trichoderma было исследовано с помощью ДНК анализа для большинства видов. Новый методологический подход подтвердил наличие агрегатов внутри отдельных видов Trichoderma.
Мультигенный филогенетический анализ обнаружил тот факт, что образование комплексов видов в пределах рода Trichoderma является общим правилом. Кроме того, группы Я. lixii/T. harzianum, Я rufa/T viride и Я. koningii/T. koningii можно считать репрезентативными видами видовых комплексов. Самюэльс (Samuels et al. 2004) пытался выделить множественные виды комплексов не только среди Я rufa/T. viride и Я. koningii/T. Koningii, но и определить морфологические вариации видов и изолятов Hypocrea cf. Chlorospora В. & М.А. Curtis. Любек с соавторами (Lubeck et al., 2004) изучала комплексы внутри видов Trichoderma/viride, atroviride/koningii методом UP-PCR и кросс-блот гибридизацией.
Использование различных молекулярно-генетических методов позволило идентифицировать виды, объединенные в конгломерат T.harzianum Rifai, и установить филогенетические связи внутри этой группы. Известно, что большинство микопаразитических видов, антагонистов фитопатогенных грибов, представляющих большую экономическую ценность, были классифицированы как T.harzianum Rifai. Все микопаразитические виды . T.harzianum характеризуются значительной физиологической пластичностью, и поэтому их трудно идентифицировать. Большинство штаммов Trichoderma не имеют половой стадии и продуцируют только бесполые споры. Как правило, антагонистические биоконтрольные виды не имеют половой стадии. Некоторые виды адаптировались к существованию без половой стадии. В отсутствие мейоза пластичность хромосом становится нормой, поэтому различные виды Trichoderma содержат различное количество хромосом разных форм. Клетки грибов обычно многоядерные, некоторые содержат вегетативные ядра. Общее количество ядер в клетке может достигать 100. Некоторые неполовые процессы, такие как парасексуальная рекомбинация и мутации, приводят к различиям между ядром и таллусом.
В результате таких особенностей грибы обладают высокой степенью адаптации и быстрой регенерации. Среди диких штаммов наблюдается значительное морфологическое и генетическое разнообразие. В отличие от диких гетерокариотических штаммов (содержащих различные генотипы в пределах одного организма) биоконтрольные промышленные штаммы должны быть гомокариотическими. Данное обстоятельство предотвращает вариабельность коммерческих штаммов (Наппап 2003).
Т. harzianum - это наиболее часто описываемый вид Trichoderma, благодаря широкому географическому распространению и использованию для биологической защиты растений от фитопатогенов. Значительная фенотипическая и генетическая вариабельность была обнаружена у Я. lixii/T. harzianum при изучении морфологических, физиологических и молекулярно-генетических параметров (Chaverri et al., 2003; Grondona et al., 1997; Hermosa et al., 2000; Samuels et al., 2002). Вид является комплексом монофилетических видов, а сами виды представляют собой фенотипически неотличимые эволюционные линии. При исследовании гетерогенности вида Я. lixii/T. harzianum сначала 24 исследуемых изолятов Т. harzianum разместили в 5 групп, относимых к 2 кластерам по признакам: прорастание спор, интенсивность спорообразования, а по изоэнзимному спектру было выделено уже 4 кластера (Grondona et al., 1997).
Характристика почв агроклиматических зон РТ
Совокупность физико-химических факторов окружающей среды и явления анемохории определяют географическое распространение Trichoderma в биосфере.
Грибы рода Trichoderma являются сапротрофами, способными усваивать большой спектр органических веществ, и обладающими способностью активно подавлять конкурентов, поэтому они широко встречаются на самых различных субстратах практически во всех географических зонах мира. Но чаще всего они встречаются в подстилке и почве (Samuels, 1996).
Первое сообщение о наличии видов Trichoderma в почве сделали Ойдеманс и Конинг в 1902 (цит. по Rifai, 1969). В дальнейшем было установлено, что виды Trichoderma являются одним из важных компонентов почвенной микобиоты (Сизова, 1977; Салина, 1988; Smith, 1995; Samuels, 1996). Но и теперь многие вопросы экологии и распространения грибов рода Trichoderma в природе остаются мало изученными. Имеются лишь разрозненные данные о встречаемости их в почвах тех или иных сообществ и регионов (Danielson, Daney, 1973; Салина, 1988; Великанов, 1999, Александрова, 2000, 2004; Bissett et al., 2003) или по экологии отдельных видов.
Показано, что эти грибы связаны в основном с нижним горизонтом подстилки, в почве их меньше (Danielson, Davey 1973 а; Великанов и др., 1999). Например, Т. harzianum доминировала на лесной подстилке в Малазии. А исследование, проведенное в южной Индии, продемонстрировало, что Trichoderma viride является членом последнего звена сукцессии на подстилке в тропических травяных угодьях, и играет роль климаксного вида.
Многочисленные работы по изучению почвенной микофлоры показывают, что грибы рода Trichoderma широко распространены и способны существовать в самых разнообразных почвах (Сизова, 1977) Однако отмечаются некоторые закономерности в распространении отдельных видов по географическим зонам (Мишустин, Пушкинская, 1960; Мирчинк и др., 1981). По данным Л.И Курсанова и Т.Н. Шкляр (1938), в северных почвах этих грибов больше, чем в южных.
По данным Е.Н.Мишустина, О.И. Пушкинской (1960), грибы рода Trichoderma обильнее размножаются в почвах, богатых органическими остатками. Наибольшее количество их сосредоточено, главным образом, в слое, богатом органическими веществами, т.к. количество углерода и азота и соотношение этих элементов в значительной степени влияют на развитие Trichoderma. При изучении подзолистых и дерново-подзолистых почв Е.М. Мишустин, Мирзуева (1966) второе место по обилию грибов в этих почвах принадлежало представителям рода Trichoderma.
Г.Ш. Сейкетов (1982) считает, что во влажных северных почвах, как правило, обитают представители видов Т. lignorum, Т. koningii, Т. viride, но совершенно отсутствуют Т. album, Т. glaucum. К сожалению, автор не придерживался общепринятой системы рода и его данные трудно интерпретировать.
При изучении видового разнообразия Trichoderma на территории Звенигородской биостанции биологического факультета МГУ было выявлено, что чаще всего встречались Т. harzianum Rifai, Т. koningii Oudem. и Т. viride Pers.: Fr., составляющие 70,42% от всех изолятов этого рода: 33.77%, 21.73% и 14.94%, соответственно (Великанов и др., 1999). Аналогичные данные получены для почв Литвы (Салина, 1988). Отмечена высокая встречаемость грибов рода Trichoderma практически во всех исследованных почвах горных тундр и каменистых высокогорных пустошей Хибин, причем Т. viride является обычным видом.
Показано, что в городских почвах (г. Москва) Т. harzianum является редким видом. В фоновых и окультуренных дерново-подзолистых почвах (Московская обл.) доминантными являются: Т. harzianum, T.hamatum и Т. viride (Марфенина, 2005).
Даниельсон и Деви (Danielson, Davey, 1973 а) изучали распространение грибов рода Trichoderma в лесных почвах различных климатических зон США и обнаружили, что грибов рода Trichoderma всегда больше в подстилке и самом верхнем горизонте почвы. Особенно их много во влажных почвах холодных западных районов штата Вашингтон (70% от общего количества), а в умеренно засушливых районах Северной Каролины их численность значительно ниже (18,8 %). Виды Т. viride и Т. polysporum ограничены районами с холодной температурой, в то время как Т. harzianum характерна для теплого климата. Т. koningii и Т. hamatum - наиболее широко распространенные виды, обнаружены во всех исследованных климатических районах США. Показано, что виды рода Trichoderma, типичные для холодных географических районов, имеют более низкий температурный оптимум и максимум для роста, чем виды теплых климатических районов. Авторы пришли к выводу о значительной роли влажности субстрата в распространении грибов Trichoderma в различных почвах (Danielson, Davey, 1973).
Было проведено тщательное исследование географического распределения видов секции Longibrachiatum. Результаты морфологического, культурального и макромолекулярного анализа показали, что Т. longibrachiatum распространена очень широко, но ее африканские изоляты сильно отличались от остальных. 7! citrinoviride (телеоморфа Я. schweinitzif) встречается в умеренной зоне Европы и Северной Америки. T.pseudokoningii встречается в основном в Австралии, Океании и Новой Зеландии. T.reesei (телеоморфа Я jecorind) относится к тропическим областям и Американскому континенту, а также выявлена обособленная группа изолятов Я. schweinitzii из Китая (Samuels, et al., 1994).
Исследования показали, что виды Trichoderma являются обычными представителями микобиоты почв лесных экосистем. Уайдден (Widden, 1979) показал, что Т. viride и Т. polysporum типичны для хвойного леса в южном Квебеке. Викамп и Гаме (Veerkamp, Gams, 1983) обнаружили Т. inhamatum
(=T.harzianum) в лесной почве Колумбии (Южная Америка), которая встречается в почве и на растительных остатках в мангровых лесах. В почве и подстилке в Малазийском дождевом лесу Т. harzianum в нескольких местах доминировала. Т. koningii входит в комплекс типичных видов грибов в верхних горизонтах почвы ольховников в верховьях Колымы (Гришкан, 1995).
Изучалось влияние факторов окружающей среды на виды этого рода. Исследование сезонной динамики видов Trichoderma в еловом лесу показало, что при низких температурах преобладают 71 polysporum (зимой) и Т. viride (весной). А Т. koningii преобладала в летние месяцы (Widden, Abitbol, 1980). Анализировалась микобиота ольхового леса разного возраста в Италии. Показано, что распределение видов роды Trichoderma было более тесно связано с общими абиотическими условиями, чем с возрастом леса. Интересно, что в данной работе отмечена Т. pilluliferum, которая очень редко встречается.
Однако известны многочисленные находки и в других типах местообитаний, в том числе и в агроэкосистемах (Салина, 1988). Например, изучались естественные популяции Trichoderma в почвах яблоневых садов в Висконсине, всего обнаружено пять видов. Т. hamatum, Т. harzianum, и Т. koningii встречались чаще, чем Т. virens (= Gliocladium virens) и Т. viride. Каждый вид выделялся из всех географических областей, кроме Т. virens, которая была обнаружена в почве только в южном Висконсине.
Изучается влияние агротехнических мероприятий на виды рода Trichoderma, например, при изучении состава микромицетов почв в Юго-Восточной Австралии, подвергнутых известкованию выяснилось, что в них возросло содержание T.polysporum, по сравнению с необработанными почвами. Однако отмечено, что в агроценозе частота встречаемости видов этого рода и их обилие сокращается по сравнению с ненарушенным местообитанием (Курини, 1991)!
Виды Trichoderma встречаются и на других субстратах. При изучении численности и видового состава этого рода в Узбекистане, выяснилось, что представители грибов этого рода встречаются в большом количестве как в почве, так и в образцах растительного материала. Среди видов доминирует Т. lignorum. Исследование рода Trichoderma в Венгрии выявило 15 видов, встреченных на склероциях грибов, плодовых телах, ризоморфах, древесине, в ризосфере растений и почве. Впервые в Венгрии отмечены: Т. atroviride, Т. fasciculatum, Т. longipilis, T.minutisporum, Т. spirale, Т. strictipilis. Данные виды встречаются на плодовых телах различных грибов, чаше на трутовых (Курини, 1991). Причем 40% йзолятов, поражавших шампиньоны в Англии и Ирландии, относилось к Т. harzianum (Castle, et al., 1998). Виды рода Trichoderma отмечены как кератинофильные грибы в почвах Франции (Agut et al., 1995).
Распространение Trichoderma на территории Республики Татарстан
1) Выделение ДНК Trichoderma
А) Экстрагирование ДНК проводили фенол/хлороформным методом, включающим лизис клеток, с высвобождением ядерной ДНК и очистку ДНК от белков, нуклеаз с использованием органических растворителей.
Для работы брали кусочек мицелия (1 г) и растирали в ступке. Гомогенат вносили в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и приливали 300 мкл ГЦ - лизирующего буфера. Пробирки помещали в водяную баню при 70С на один час. После этого водную фазу отбирали и добавляли к ней равный объем фенола и хлороформа (одна пятая часть от объема фенола). Все тщательно перемешивали и помещали в холодильник на 10 - 15 минут. Затем центрифугировали смесь в течение 2-4 минут при 6 тыс. об./мин. Верхняя фаза отбиралась и к ней добавляли равный объем хлороформа. Снова центрифугировали в течение 2-4 минут при 6 тыс. об./мин. Затем вновь отбирали верхнюю фазу и добавляли 40 мкл ацетата натрия и 400-500 мкл изопропанола. Все это помещалось в холодильник при -20С на ночь.
Визуально наблюдали выпадение осадка белого цвета. Осадок собирали центрифугированием при 12 тыс. об./мин в течение 5 минут.
К осадку добавляли 70% этанол и снова центрифугировали в течение 5 минут при 12 тыс. об./мин. Осадок высушивали при 60С в течение 30 минут и растворяли в 100 мкл дистиллированной воды.
При другом способе выделения ДНК из мицелия для лизиса клеточной стенки использовали жидкий азот (Druzhinina, 2005).
Б) Полимеразная цепная реакция
Для идентификации до вида использовали праймеры к участкам ядерной рДНК, содержащий нетранскрибируемые последовательности гена ITS І.и 2 и ген 5,8S рРНК SR6R (5 -AAG TAG A AG TCG ТАА САА GG-3 ) и LR1 (5 -GGT TGG ТТТ СТТ ТТС СТ-3 ), Для сравнительного анализа популяций изолятов Trichoderma использовали комбинации праймеров: Ф4 (5 -ТСТ GAG ССТ ТСТ CGG CGC СТ-3 ) и А5 (5 -GCG CAG GAA AGG CTG CGG CG-3 ), участок, содержащий ген эндоглюканазы, - с праймерами Ф2 (5 -GGC AAG АСА TGA САА GT-3 ) и A3 (5 -АСА TTG GAG AGT GCG AAGC-3 ).
Для проведения НП ПЦР были использованы следующие праймеры: Пр1 - 5 -GAGGTGGNGGNTCT-3 - неспецифический праймер, консенсусная последовательность белка III фага М13 (по Arizan-Atac, 1995); ПР-2 - 5 -GTT ТТС CCA GTC ACG АС- 3 -стандартный прямой праймер фага X М13; Пр2 - 5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3 - стандартный прямой праймер фага М13 ПрЗ - 5-GGCAAGACATGACAAGT-3 - неспецифическая последовательность. Режимы GWH f) денатурация ДНК - 95 С; 1 мин; б) отжиг праймеров - 54С; 1,5 мин; в) элонгация - 72С; 1 мин.
Анализировали продукты электрофорезом в 5,5% ПААГ или 1% агарозе в трис-боратном буфере. Агарозный гель окрашивали этидиумбромидом и визуализировали в ультрахемископе, ПААГ-нитратом серебра с последующей сушкой в целлофане
Наблюдение и учет микроорганизмов почвы
А) Люминесцентная микроскопия) Метод основан на подсчете клеток препарата, окрашенного флюорохромом, в ультрафиолетовом свете.
Диспергированную почвенную суспензию, разведенную в 10 раз, переносят в мерный цилиндр на 100 мл (Звягинцев, 1991). После двухминутного отстаивания пипеткой отбирают 2 мл суспензии из средней фракции и переносят в колбу с 18 мл воды. Колбу энергично встряхивают и наносят микропипеткой 0,01 мл на обезжиренное предметное стекло, распределяя равномерно на площади 4 см2 (2x2 см). Удобно для распределения мазков подкладывать под стеклышко трафарет, начерченный на бумаге. Препараты подсушивают и
138
фиксируют над пламени горелки, а затем окрашивают 2-4 минуты водным раствором акридинового оранжевого (разведение 1:10000). Для микроскопирования на препарат наносят каплю воды и покрывают обезжиренным покровным стеклом. Лишнюю воду удаляют фильтровальной бумагой. Препараты просматривают на люминесцентном микроскопе МЛ-2 или МЛ-4 (фильтры ФС-1-2, ЖЗС-19, ЖС-18, объектив х90, окуляры х4 или х5). Микробные клетки имеют ярко-зеленое свечение, почвенные частицы - красное.
Число микробных клеток в 1 г почвы вычисляют по формуле: N=4xaxn/Pxl010, где а - среднее число клеток в поле зрения; Р - площадь поля зрения, мкм2; п - показатель разведения (в данном случае п=100). Желательно подобрать разведение таким образом, чтобы среднее число клеток в поле зрения Составляло 5-10. Количественный учет грибов проводился методом Хансена в модификации Мирчинк (1988).
При определении биомассы микроорганизмов исходили из следующих предпосылок: средний размер почвенных бактерий равен 0,1 мкм3, средний диаметр гиф актиномицетов 0,5 мкм, грибов-5 мкм.
Биомасса сухого вещества одной бактериальной клетки объемом 0,1 мкм3 составляет 2 х 10"14 г, 1 м грибного мицелия диаметром 0,5 мкм - 3,9 х 10"6 г и одной грибной споры - 1 х 10"11 г.
Удельный вес всех микроорганизмов 1,1 г/см3 . Вес сухой биомассы равен 1/5 от веса живой биомассы.
Удельная масса (плотность) микроорганизмов равна 1 г/см3 , а содержание воды в клетках - 80%. Показатели сухой биомассы 1 А составляют для одной бактериальной клетки объемом 0,1 мкм - 2 10 , для определения одного грибного мицелия диаметром 5 мкм - 1 10 "г.
Б) Количественный учет микроорганизмов на селективных средах
Навеску почвы вносят в колбу с 45 мл стерильной водопроводной воды. Содержимое колбы энергично встряхивают в течение 3-5 мин до получения равномерной взвеси. После 1-2 мин отстаивания из приготовленной взвеси (1:10) стельной пипеткой берут 1 мл суспензии и вносят в пробирку с 9 мл стерильной воды. Получают разведение 1:100. После хорошего перемешивания в течение 1 мин и отстаивания в течение 30 сек из пробирки берут 1 мл взвеси пипеткой и переносят во вторую пробирку с 9 мл стерильной воды. Получают разведение 1:1 000. Аналогичным образом готовят разведения до 1:1 000000.
