Введение к работе
Актуальность проблемы. Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют широкое распространение в биосфере, входят в состав сапротрофов и занимают различные экологические ниши в почвенных и водных экосистемах, однако по своей совокупной биомассе превалируют в почвенном покрове (Vargas-Ayala et al., 2000; McSpadden Gardener, 2004; Мелентьев, 2007; Современная микробиология..., 2009).
Представители рода Bacillus способны заселять ризосферу и ризоплану растений, используя питательные вещества, продуцируемые растениями в виде корневых экзометаболитов. Они могут также синтезировать необходимые для растений биоконтрольные вещества, фитогормоны и витамины (Martin et al., 1987; Foldes et al, 2000; Мелентьев, 2007; Idris et al., 2007; Ortiz-Castro et al., 2008; Ahmed, Hasnain, 2010; Chen et al., 2010). Bee вышеперечисленные свойства позволяют отнести их, наряду с ризобиями, псевдомонадами и микоризными грибами к группе PGPR (Schippers, 1992).
Бациллы участвуют во всех формах взаимоотношений с растениями: могут являться возбудителями заболеваний (Hosford, 1982; Пересыпкин, 1989; George N. Agrios, 2005); способствовать устойчивому росту и развитию растения; защищать растение от фитопатогенов (Nielsen, Sorensen, 1997; Широков и др., 2002; Harsh et al, 2004; Мелентьев, 2007; Чеботарь, 2007; Halalisani Gumede, 2008; Saharan, Nehra, 2011).
На природном явлении антагонизма микроорганизмов по отношению к фитопатогенам основан микробиологический способ защиты растений от болезней, который является одним из самых перспективных в связи с эго эффективностью и экологичностью.
На протяжении последних двадцати лет рядом исследователей (Filippi, 1987; Kim et al, 1997; Кузьмина, 1998; Новикова, 2004; Мелентьев, 2007; Gacitua et al., 2009; Patent US № 8025875, 2009) проводится работа по поиску бациллярных штаммов для создания эффективных биопрепаратов и средств защиты растений. Такие препараты перспективны, так как штаммы, входящие в их состав, продуцируют БАВ, гормоны и витамины, а также обладают пластичным метаболизмом и смешанной жизненной стратегией, сочетающей элементы г-, L- и К- стратегов (Новикова, 2005). Это позволяет им приспосабливаться к различным почвенным условиям, в том числе влажности (Backman et al., 1997; Мелентьев, 2000). Бациллярные биопрепараты совместимы с протравителями семян, гербицидами и инсектицидами (Кузьмина, 1998; Захарова, 2006; Фомина, 2009). У них выше
срок хранения, благодаря наличию эндоспор, позволяющих сохранить культуру в жизнеспособном состоянии длительное время (Алехин, Злотников, 2006; Lolloo et al., 2010), что является важным условием при использовании их в интегрированной защите растений.
Современный ассортимент биопрепаратов позволяет осуществлять защиту сельскохозяйственных культур от наиболее опасных заболеваний. Однако их эффективность зависит от множества факторов, например: конкурентоспособности штаммов, входящих в состав биопрепарата по отношению к аборигенным микроорганизмам и возбудителям заболеваний растений, почвенно-климатических и других региональных условий (Захарова, 2006; Хайруллин и др., 2010). Биопрепаратов и микробиологических средств защиты, максимально адаптированных к условиям аридной зоны России в настоящее время не разработано.
Таким образом, поиск среди представителей рода Bacillus штаммов, выделенных из агроэкосистем аридной зоны, и обладающих биоконтрольными свойствами является весьма актуальным.
Цель исследований. Исследование особенностей взаимодействия Bacillus atrophaeus В - 9918 с растениями и фитопатогенными грибами для использования штамма в агротехнологиях.
Задачи исследований:
Выделить представителей рода Bacillus из агроэкосистемы и изучить их морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства.
Исследовать взаимодействие выделенных штаммов с растениями и фитопатогенными грибами.
3. Идентифицировать штамм с наибольшей фунгицидной и
фитостимулирующей активностью и определить его способность к
колонизации растений.
4. Изучить влияние штамма на рост томатов в вегетационных условиях.
5. Изучить влияние штамма на рост и устойчивость растений к
заболеваниям в полевых опытах на томатах и арбузах.
Научная новизна работы. Из агроэкосистемы аридной зоны выделено 16 бациллярных штаммов и изучено их взаимодействие с микромицетами. Впервые установлено, что штамм Bacillus atrophaeus В - 9918 обладает фунгицидной активностью к широкому спектру фитопатогенов, фитостимулирующей активностью и способностью к эффективной колонизации ризосферы и ризопланы растений (на примере томата).
Показана зависимость фунгицидной и фитостимулирующей активности штамма Bacillus atrophaeus В-9918 от фазы роста культуры.
Впервые показана перспективность применения суспензии штамма Bacillus atrophaeus В-9918 как средства защиты сельскохозяйственных растений на примере томатов и арбузов.
Практическая значимость. Штамм Bacillus atrophaeus B-9918 предложен в качестве средства для стимуляции роста сельскохозяйственных растений и защиты их от болезней. Полученная лабораторная партия средства апробирована в вегетационных и полевых опытах. Разработана технология применения средства, включающая бактеризацию семян, инокуляцию под корень и опрыскивание.
Штамм В. atrophaeus помещен в ВКПМ под номером В-9918. Подана заявка на изобретение «Штамм Bacillus atrophaeus В-9918 в качестве средства для стимуляции роста и защиты растений от грибных болезней» (заявка № 2010111829 (заявл. 26.03.2010)).
Результаты исследований являлись частью научной работы по госконтракту: «Разработка микробного препарата для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных культур Астраханской области» в 2010 -2011 гг. Материалы диссертации использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами специальности «Микробиология», бакалаврами направления «Биология» и магистрами магистерской программы «Микробиология и вирусология» института рыбного хозяйства, биологии и природопользования АГТУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
Из агроэкосистемы выделен и идентифицирован штамм Bacillus atrophaeus, обладающий фунгицидными, фитостимулирующими свойствами и способностью к колонизации растений.
Штамм Bacillus atrophaeus В-9918 подавляет рост F. culmorum, F. graminearum, F. poae, F. sporotrichoides, Aspergillus niger, Alternaria tenuissima, Cladosporium sp., Mycelia sterilia, Phytium ultium, и вызывает аутолиз мицелия у Alternaria sp.
Фитостимулирующие свойства и способность к колонизации растений подтверждены в лабораторных экспериментах, вегетационных и полевых опытах активизацией ростовых процессов растений.
Показана, что фунгицидная и фитостимулирующая активность штамма Bacillus atrophaeus В-9918 зависит от фазы роста культуры. Максимум антифунгальной и стимулирующей рост и развитие растений активности приходится на экспоненциальную фазу роста.
Выявлена оптимальная концентрация клеток В. atrophaeus В-9918 в суспензии (10 КОЕ/мл), при обработке которой наблюдается наибольший
эффект стимуляции роста и развития арбузов в полевых и томатов в полевых и вегетационных опытах, а также снижение развития фузариоза и альтернариоза.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы и результаты исследований докладывались на: научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения К.В. Горбунова «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем» (Астрахань, 2008); 13-й, 14-й Пущинских международных школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2009, 2010); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); Первых Международных Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010); Международной научной конференции: «Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности «АСТИНТЕХ - 2010» (Астрахань, 2010); Международной отраслевой научной конференции профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященной 80-летию основания АГТУ (Астрахань, 2010); Международной конференции молодых ученых: «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, Украина, 2010), на Международной конференции с элементами научной школы для молодежи: «Экокультура и фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Каспии» (Астрахань, 2010).
Работа выполнена в лаборатории микробиологического мониторинга Астраханского государственного технического университета в соответствии с плановой темой НИР: «Скрининг микроорганизмов с полезными свойствами для использования в экологической и сельскохозяйственной биотехнологии» (№ гос. регистрации 01201051559, научный руководитель зав. лаб., д.б.н., проф. Дзержинская И.С.). Работа поддержана госконтрактом с министерством сельского хозяйства Астраханской области на выполнение научно-исследовательских и фундаментально-прикладных работ в 2010 -2011 гг.: «Разработка микробного препарата для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных культур Астраханской области» (№ гос. регистрации
01.2.009.00158, научный руководитель зав. лаб., д.б.н., проф. Дзержинская И.С.).
Личный вклад соискателя. Представленные экспериментальные результаты получены лично автором. Определение концентрации цитокининов и ауксинов в культуральной жидкости определялось в Институте биологии Уфимского научного центра РАН совместно с к.б.н. Веселовым Д.С, нитрогеназную активность штамма В. atrophaeus В-9918 исследовали совместно с сотрудниками ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке всех задач исследования, подготовке и проведении экспериментов, вегетационных опытов и полевых исследований, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах ВАК. Подана заявка № 2010111829 (заявл. 26.03.2010) на выдачу патента РФ «Штамм Bacillus atrophaeus В-9918 в качестве средства для стимуляции роста и защиты растений от грибных болезней» / Дзержинская И.С, Коряжкина М.Ф.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, иллюстрированы 27 таблицами и 29 рисунками.
Работа выполнялась под руководством д.б.н., проф. И.С. Дзержинской которой автор выражает особую признательность и благодарность. Автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Т.С. Фоминых за методическую помощь в постановке полевых экспериментов и ценные советы; к.б.н. В.К. Чеботарю за ценные советы и помощь в работе; д.с.-х. н. Ш.Б. Байрамбекову и к. с.-х. н. Е.В. Поляковой за методическую помощь в постановке полевых экспериментов; всему коллективу кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ за помощь и поддержку в процессе работы.
