Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I . Рост, развитие и изменчивость грибов 6
ГЛАВА II . Вторичный рост в культурах микроорганизмов 19
ГЛАВА III. Объекты и методы исследований 36
ГЛАВА ІV. Условия формирований вторичного роста у грибов 45
ГЛАВА V. Особенности цикла развйтш и метаболизма культур. из вторичных колоний грибов 68
1. Циклы развития 68
2. Гетерогенность по содержанию ДНК в клетках вторичных колоний 75
3. Ферментативная активность 78
4. Интенсивность дыхания и гликолиза 80
5. Антимикробная активность 86
ГЛАВА VІ. Влияние экзогенных и эндогенных факторов на частоту образование колоний . 89
Заключение 107
Выводы 109
Литература 111
- . Рост, развитие и изменчивость грибов
- . Вторичный рост в культурах микроорганизмов
- Объекты и методы исследований
- Условия формирований вторичного роста у грибов
Введение к работе
В связи с расширением сферы практического использования микроорганизмов всесторонне исследуется их рост и развитие. На основе имеющихся данных сформулированы (Иерусалимский,1959, 1963, 1966, 1969; Работнова, Иванова, 1971; Печуркин, 1978; Бирюков, 1982 и др.) общие закономерности роста микробных культур, дано их математическое описание, созданы основы для управляемого культивирования и биосинтеза практически ценных метаболитов. Из факторов, лимитирующих рост микроорганизмов на плотных и жидких средах, ведущее значение отводится истощению субстрата и накоплению специальных продуктов обмена. Несмотря на их наличие имеются многочисленные указания о вторичном росте в культурах бактерий, актиномицетов, грибов. На плотных средах -это рост вторичных колоний (Lewis , 1934; Райан, 1959; Shan , Iyer , 1961; Фробишер, 1965; Дмитриев и др., 1966; Браун, 1968; Никитина, 1968; Никитина, Калакуцкий, 1971, 1977; Lambert , 1974; Leonard , 1975; Кашкин и др., 1979; Tulemisova et al, , 1980), на жидких - вторичный рост мицелия или отдельных гиф (Дмитриева, Пестерева, 1962; Прокофьева-Бельговская, 1963; Левитов и др., 1969; Макаревич и др., 1976; Максимова и др.,1976; Ландау и др., 1980; Бартошевич, Заславская, 1983). У клеток, образующихся при вторичном росте, может быть нарушена дифференциация, усилена частота деления, резко изменена антибиотическая, ферментативная и патогенная активность. Имеются указания о подобии вторичного роста микробов и новообразований высших организмов,( Thomas et al., 1956; Фробишер, 1965; Никитина, 1975; Leonard , 1975 и др.). Вместе с тем, сведения об условиях формирования вторичного роста часто отсутствуют, либо ограничиваются выявлением значения отдельных факторов.
Изложенное диктует необходимость проведения специальных - 4 -исследований и углубления представлений о закономерностях вторичного роста, в частности у грибов, которые, наряду с синтезом практически ценных метаболитов, все чаще привлекаются для решения общебиологических проблем, таких как дифференциация и деление клеток, закономерности онтогенетической и мутационной изменчивости (Билай, Элланская, 1971; Левитин, Федорова, 1972; Smith, Berry , 1975; Захаров и др., 1980; Мацкевич, 1981).
Целью исследований по теме было изучение условий формирования вторичного роста у мицелиальных грибов, стабильности и мета бо литических особенностей культур, изолированных из вторичных колоний.
Задачи исследования включали: 1« Определение значимости компонентов синтетических сред и условий культивирования (температура, рН, аэрация) для образования вторичных колоний.
Выявление структурных и метаболитических особенностей культур из вторичных колоний грибов.
Исследование возможности восстановления нарушений дифференциации и клеточного деления у грибов под влиянием экзогенных и эндогенных факторов. Для повышения частоты выявления у грибов способности к образованию вторичных колоний в работе впервые экспериментально обоснована необходимость индивидуального подбора питательных сред с учетом значимости :: всех компонентов, рН и того, что условия для роста исходных и вторичных колоний могут не совпадать. Культуры из вторичных колоний впервые сопоставлены с исходными по широкому набору признаков. У них выявлен более простой цикл развития, измененный антимикробный спектр, усиленная ферментативная (пектолитическая и каталазная) активность, более интенсивное усвоение источников углеродного и азотного питания, усилен- ное дыхание и синтез ДОС. Простота выделения культур из вторичных колоний мягкой консистенции и их множественные метаболити-ческие особенности должны учитываться и шире использоваться в селекционных исследованиях.
Научная новизна выполненной работы заключается также в том, что в ней впервые исследовались смешанные популяции, содержащие клетки, у которых нарушения дифференциации сочетаются с метабологическими преимуществами, усиленным автономным делением и тенденцией к многослойному росту. Подобными особенностями обладают клетки новообразований высших организмов.
В работе доказана возможность избирательного воздействия на клетки вторичных колоний грибов факторами экзогенной и эндогенной природы, среди которых 2,4-динитрофенол, антраниловая кислота, гетероауксин, фосфаты Сахаров, ц АМФ, АТФ, рентгеновские лучи, образуемый грибами пигмент и др. Возможность получения однотипного (ингибирующего) эффекта от введения в среды токсических соединениЛбычных клеточных метаболитов, свидетельствует о необходимости испытания новых, метаболитических подходов для ограничения гетерогенности клеточных популяций высших организмов на поздних стадиях онтогенеза.
На защиту выносятся положения: о необходимости индивидуального подбора условий для повышения частоты выявления у грибов способности к образованию вторичных колоний; о метаболитических преимуществах культур из вторичных колоний грибов; о подобии клеток вторичных колоний грибов и клеток новообразований высших организмов; об обратимости нарушений дифференциации и клеточного деления у культур из вторичных колоний^
. Рост, развитие и изменчивость грибов
Сведения о росте и развитии грибов содержатся во многих монографиях (Курсанов, 1933; Райлло, 1950; Фостер, 1950; Лилли, Барнетт, 1953; Вилай, 1955, 1973, 1974, 1977; Иерусалимский, 1963; Литвинов, 1969; Печуркин, 1978; Кашкин и др., 1979; Стей-ниер и др., 1979; Захаров и др., 1980; Рудаков, 1981) и обзорах (Билай, Элланекая, 1972; Smith , Berry , 1975; Bull, Trin-сі, 1977; Дьяков, 1981; Кондратьева, 1981; Феофилова, 1981; Бартошевич, Заславская, 1983 и др.).
Интенсивное исследование грибов объясняется широким использованием их для биосинтеза практически ценных метаболитов (антибиотиков, ферментов, витаминов, органических кислот, полисахаридов, гормонов, алкалоидов и др.), а также той ролью, которую они играют в патологии растений, животных и человека.
На основании разнообразия морфологии и способов размножения грибы, в наиболее распространенной системе, делятся на четыре класса: Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes u Fungi imperfecti. По строению клеток грибы относятся к эукариотам, наряду со многими водорослями, высшими растениями и животными. Для большинства грибов характерно мицелиальное многоклеточное строение. Они могут размножаться вегетативно, бесполым и половым путем. Своеобразную узко специализированную ветвь аскомицетов с особенностями метаболизма представляют одноклеточные грибы - дрожжи.
Грибам свойственна эволюционно закрепленная тенденция к колониальному образу жизни. Колония представляет собой сложную многоклеточную систему, с высоким уровнем специализации клеток, особенно на плотных средах. Субстратный и надсубстршшй мицелии развиваются в условиях ограниченного доступа воздуха, субстратный врастает в питательную среду. По физиологическому значениюон, подобно корневой системе растений, выполняет функцию питания. Воздушный мицелий развивается на поверхности колоний. На нем образуются специальные органы плодоношения, различные типы спор, располагающиеся на мицелии или в особых вместилищах (спорангиях, сумках и др.). В глубинных условиях культивирования клетки могут не образовываться и вся биомасса может быть представлена вегетативным мицелием.
Несмотря на разнообразие жизненных циклов грибов их рост подчиняется общим закономерностям, известным для других микроорганизмов. Рост грибов (Вилай, 1973) начинается с прорастания конидий (спор). Они набухают, увеличиваются в объеме вследствие превращения эндогенных и экзогенных субстратов и начальных процессов метаболизма (синтез нуклеиновых кислот, белков). В зависимости от свойств культуры и условий этот период длится 4 8 часов. Затем образуются ростовые трубки и первичный мицелий. Лаг-фаза - фаза начального замедленного роста мицелия (ветвления), как и у одноклеточных организмов, имеет разную продолжительность. В этот период индуцируются ферменты, комплекс которых зависит от источников питания и энергии. Фаза экспоненциального (неуклонного и равномерного) роста характеризуется наиболее активными метаболитическими процессами, наиболее интенсивным потреблением компонентов питательных сред и нарастанием биомассы. В фазу старения снижается интенсивность метаболитических процессов, связанных с ростом, в клетках и питательной среде накапливаются вторичные метаболиты, что сопровождается спорообразованием, явлениями автолиза мицелия, снижением его веса, морфологической дифференциацией, связанной с образованием клеток хламидоспорового типа и др.
Продолжительность той или иной фазы роста зависит от видовых особенностей гриба, условий культивирования (состава пита - 8 -тельных сред, густоты посева, аэрации температуры и др.). Грибы распространены в природных субстратах повсеместно. Вероятно, поэтому так широки их требования к питательным средам для культивирования. Они должны содержать источники азота, углерода, кислорода, водорода, серы, фосфора, калия, магния, железа, меди, цинка, марганца, молибдена, кальция, галлия, бора, скандия, ванадия (Беккер, 1963), причем, для культур различного систематического положения характерно избирательное отношение к ипточникам названных элементов.
Грибы рода Fusarium (Вилай, 1977) способны усваивать азот из нитратов, аммонийных солей из белков, из аммиака. При использовании триптофана в качестве единственного источника азота отмечен слабый рост фузариев (кроме культур секций Eiegans и Магieila ), спороношение отсутствовало, или образовывались мелкие нетипичные КОНИДИИ. ВИДЫ секций Sporotrichiella u Roseum слабо развиваются на средах с аргинином и ристидином. На средах с хлористым, азотнокислым, фосфорнокислым и сернокислым аммонием развивается пленчатый, не образующий конидий, погруженный в субстрат мицелий, содержащий гигантские и хламидоспорового типа клетки. Fus.oxysporum хорошо усваивает минеральный (аммонийный и нитратный азот), но лучшим источником для этой культуры является пептон (Кирпиченко, 1975). Для видов рода Verticiiiium наиболее благоприятны среды с аспарагином и нитратом натрия, где образуют типичные для рода микросклероции. На средах с глико-колом образуются истонченные гифы, слабоокрашенные, не характерные для рода микросклероции (Дешкова и др., 1977). Видами рода Cladosporium хорошо усваиваются аспарагин, аспарагиновая кислота, аргинин, плохо - аланин и лейцин (Левкина, 1968). Цистеин и аммонийные источники азота ингибируют рост Hirschioporus aMeinus (Fr.) Donk . Лучше всего гриб усваивает пептон, аспа рагин, глютамин и глицин (Негруцкий и др., 1982). Э.ГДорониной и Г.М.Гиндиной (1982) выявлена зависимость накопления биомассы Entomophtora thaxteriana Petch от концентрации ЭМИННОГО азота в среде. Если она составляет 20-40 мг$, то стационарная фаза наступает на 3-5 сутки, при более высоком содержании азота удлиняется экспоненциальная фаза и задерживается спорообразование.
. Вторичный рост в культурах микроорганизмов
Как отмечалось в первой главе обзора литературы (стр.з ), среди факторов, лимитирующих рост микроорганизмов на плотных и жидких средах ведущее значение имеет истощение субстрата и накопление специальных продуктов обмена Несмотря на их наличие, в культурах бактерий, актиномицетов, грибов неоднократно описывался вторичный рост.
Наиболее раннее описание вторичного роста было сделано Массини в 1907 году в опытах с E.coli (цитируется по Райану, 1959), На эозинчметиленовом синем агаре неусваивающие лактозу бактерии росли, образуя белые колонии. Вторичные колонии клеток, способных усваивать лактозу, появлялись на белых колониях в виде пурпурного цвета сосочков.
Вторичный рост привлек в дальнейшем внимание многих исследователей (Beijerinck, 1912; Lewis , 1934; Райан, 1959; Shan, Iyer , 1961; Шерстобоев, 1964; Фробишер, 1965; Браун, 1968; Шлегель, 1972; Dulaneu,Ruby , 1977; Захаров, 1978; Стейниер и соавт., 1979 и др.). Кроме упомянутой выше E.coli вторичные колонии (называемые также дочерними колониями, папиллами, сосочками, дочерними узелками) наблюдались у Bacillus subtilis, Вас. cereus, Bac.megaterium, Bac.circulans, Bac.spnericus, Acetobac ter ranees, Salmonella typhimurium и ДР»
Были выявлены некоторые общие закономерности, характерныедля формирования вторичных колоний у бактерий. Они, как правило, появляются только после значительного развития первичных колоний (после 3-6 суток инкубации). Размеры вторичных колоний могут сильно варьировать. Их расположение обычно беспорядочно, но ограничено зоной первичных колоний.
При исследовании Вас.subtilis var.niger (Shan »Iyer , 1961) было показано, что частота образования вторичных колонийзависит от густоты посева. Когда в чашки Петри наливали от 10 до 50 мл агаризованной среды, число вторичных колоний возрос-тало при увеличении толщины агарового слоя. Увеличение содержания глюкозы в среде до Ъ% сопровождалось повышением частоты образования вторичных колоний и увеличением их размеров. Вторичные колонии не образовывались, если из питательной среды исключался мясной экстракт или в среду вводился 1% карбоната кальция. Значение состава питательной среды, в частности углевода, для частоты образования вторичных колоний у Бас. megaterium отмечалось В.Брауном (1968).
Культуры из вторичных колоний бактерий, как правило, резко отличаются по физиологическим и биохимическим свойствам от первичных культур. Они могут быть иначе пигментированы, иметь измененную ферментативную активность, чувствительность к антибиотикам, но не всегда отличаться морфологией клеток»
Наблюдая устойчивость культур из вторичных колоний при пересевах, М.Бейеринк (1912) объяснил их происхождение мутациями. Эта точка зрения была поддержана и развита в последующих работах. По мнению В.Брауна (1968), вторичные колонии у бактерий возникали из клеток с селективными преимуществами. У E.coii - это появление R -галактбшюй активности, возникающей на эо-зин-мегаленовом синем агаре с лактозой (Райан, 1959), У Вас. subtilis niger клетки из вторичных колоний обладают большей декарбоксилаз ной активностью, они быстро переводят рН в щелочную сторону и тем самым противостоят действию кислых продуктов метаболизма, накапливаемых в среде клетками первичных колоний.
На способность к вторичному росту испытано около полутора тысяч актиномицетных культур, среди которых представители родов Streptomyces, Actinomadura, Nocardia, Nocardiopsis.
Более &% стрептомицетов (45 из 693 испытанных) образовыва - 21 ли колонии вторичного-роста на синтетической среде Придхэма-Готтлиба с фруктозой (Никитина и соавт., I97Ij Nikitina , Ка-lakoutskii, 1971; Никитина, 1975, 1979). При замене фруктозы другими гексозами (глюкозой, галактозой) вторичный рост не был выявлен.
В ходе дальнейшей работы у некоторых видов (str.fradiae АТСС 10745, Str.griseoruber штамм ИМВ 1618 и др.), растущих без особенностей на средах с фруктозой, вторичные колонии были выявлены на средах с пентозами (ксилозой, арабинозой). Имеются виды (str.roseoflavus штамм IPV I344,str.lateritius штамм ИНА и др.), у которых образование вторичных колоний можно наблюдать как в присутствии фруктозы, так и ксилозы.
Захарова О.Д. и соавт. (1980) изучили частоту образования вторичных колоний у актиномицетов на средах, более часто, чем среда Придхэма-Готтлиба употребляемых в лабораторной практике (Гаузе I, Гаузе П, Чапека, Треснера, Линденбайна, глюкозно-ас-парагиновая, овсяная). На этих средах вторичный рост выявлен у 2,7% испытанных культур (у 19 из 700 испытанных).
Частота образования вторичных колоний при моноспоровых посевах может сильно различаться у разных видов актиномицетов. Так у Str.roseoflavus var.roseofungini подавляющее большинство (до 79,3%) первичных колоний формируют вторичные колонии (Никитина, 1975), у Str.fradiae - ТОЛЬКО 5% (Deschampseta!., 1974). Частоту их образования у str.fradiae авторы повысили до 70%, применив облучение ультрафиолетом и использовав для посева облученных культур среды, содержащие коровье молоко.
Возможное значение мутагенных факторов (УФ-лучи, этилен-имин, нитрозоэтилмочевина) для индукции вторичного роста у str. coelicolor и его мутантов показано В.Д.Сиверцевой (1980, 1982). Однако вторичные колонии у 93% исследованных культур об - 22 -разовывались только при выращивании на средах с определенными углеводами (ксилозой, мальтозой, фруктозой, арабинозой). 7 7% культур образование колоний вторичного роста на наблюдалось.
Общим для колоний вторичного роста актиномицетов является формирование после 5-7 суток выращивания. Число их нарастает в последующий период наблюдений, В отличие от исходных культур, вторичные колонии часто имеют более высокий профиль, складчатую поверхность, мягкую мажущую консистенцию, измененную пигментацию. Размеры вторичных колоний чаще всего варьируют от 0,5 до 5 мм, отдельные колонии могут достигать в диаметре 10 и более мм. Названные признаки делают вторичные колонии легко различимыми на фоне первичного роста, легко поддающимися количественному учету и изоляции.
Объекты и методы исследований
Культуры грибов из разных типов вторичных колоний сравнивали с исходными по многим признакам. Для выявления особенностей жизненного цикла клеток, слагающих вторичные колонии, использовали метод агаровых мазков, предложенный С.В.Дмитриевой и Т.Ю.Петрухиной (1973). На стерильные обезжиренные стекла наносили по капле расплавленной агаризованной среды Ридер (оптимизированной). Край другого стерильного предметного стекла быстро прикладывали к жидкой капле и делали очень тонкий мазок агаризованной среды (по типу мазка крови для анализа). На агаровые мазки наносили взвесь клеток из вторичных колоний I типа (Никитина, Калакуцкий, 1977) и для сравнения взвесь конидий исходной культуры. После этого стекла помещали в стерильные чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне. Микроскопическое исследование выросших культур проводили прижизненно на микроскопе МБЙ-6 через 3,6,9,12,24,48,72 и 96 часов роста культур. Сведения, приведенные в работе о более поздних сроках выращивания, получены при микроскопическом исследовании агаровых культур в чашках Петри.
При количественной оценке содержания ДДК в клетках культур из вторичных колоний Fus.bulbigenum var.blasticola и ИСХОДНОЙ культуры суспензии клеток, выращенных на среде Ридер с фруктозой, наносили на обезжиренные предметные стекла, фиксировали в жидкости Карнуа. Для количественного определения ДДК в клетках проводили реакцию Фельгена. Гидролиз вели він неї при 60С в течение 6-8 минут (время подбирали эмпирически). Препараты окрашивали в реактиве Шиффа в течение I часа при комнатной температуре. Количественный цитохимический анализ - определение концентрации и общего содержания ДДК в клетках осуществляли зондо-вым цитофотометром конструкции М.П.Ефимова и др.(1964) при длине волны света 560 щк. В каждом препарате фотометрирЩ „Ш0-250
- 42 -клеток. Измерения диаметров ядер проводили окуляр-микрометром с последующим вычислением площади по уравнению круга или эллипса. Содержание ДОС выражали в относительных единицах "плойдности". Ферментативную активность исследовали в водных вытяжках из пятисуточных культур. Биомассу Fus."burbigenum var.blasticola и Ep.rubrum растирали с кварцевым песком, добавляли воду, центрифугировали и получали вытяжку ферментов, которую использовали в работе. О пектолитической активности судили по снижению вязкости 1% раствора пектина (вискозиметрическим методом), о каталаз-ной - по разложению пероксида водорода, об амилолитической - по расщеплению крахмала до эритродекстрина (Филиппович и соавт., 1975). Для определения протеолитической активности использовали метод Ансона в модификации Петровой И.О. и Винцюнайте М.М.(1968). Чтобы выявить целлюлолитическута активность, грибы высевали на полоски фильтровальной бумаги.
Для определения дыхания суспензию клеток (10 мг/мл) исходных и вторичных колоний трижды промывали водопроводной водой, в стандартных условиях насыщали воздухом и помещали в замкнутую полярографическую ячейку объемом 2 мл, снабженную платиновым электродом. В качестве вспомогательного использовали хлорсереб-ряный электрод. Электролиз осуществляли при постоянном потенциале рабочего электрода - 0,602 в и температуре 28 С (ультратермостати- 10). Регистрацию дыхания проводили с помощью полярографа LP-7 и самописца EZ -7. В качестве экзогенного субстрата использовали 1% раствор глюкозы. Кинетическую константу дыхания определяли, как скорость падения pOg на прямрлинейном участке в полулогарифметических координатах In pOg n и численно выражали через тангенс угла наклона:
Гликолиз определяли по содержанию молочной кислоты в куль-туральной жидкости по общепринятой методике с параоксидифенилом. В качестве контроля брали стандартный раствор молочной кислоты. Оптическую плотность замеряли на ФЭК. Всего исследована 341 проба. После 7 суток культивирования в средах определяли также остаточное количество сахара по Бертрану, аммонийного азота - отгонкой в кислоту, фосфора - по Кутнеру,
Антимикробные свойства изучали методом блоков, которые делали из семисуточных культур грибов Fus.bulbigenum var.blasti-coia, -Ер.rubrum и культур из вторичных колоний этих грибов. Для выращивания бактериальных тест-культур (staphylococcus aureus, Bac.anthracoides,Sarcina lutea, Corynebacterium, Mycobacterium rubrum, Bacillus subtilis, Mycobacterium citreum u Bacterium caraovorum использовали среду с переваром Хоттингера, для дрожжепо-ДОбных грибов (Candida albicans,Cand.quilliermondii ) - среду Сабуро. Инокулят вносили в среды из расчета I мл одномиллиардной взвеси на 100 мл среды. Мицелиальные грибы (Fus.oxysporum var. solani,Trichoderma album и Aspergillus niger ) засевали в среду Чапека специально подобранными суспензиями кондий. ., обеспечивающими получение равномерного газона. Взаимоотношение исходных культур и культур из вторичных колоний определяли, высевая их взаимно перпендикулярными полосками.
Условия формирований вторичного роста у грибов
При исследовании 78 культур грибов (представители родов Аи-reobasidium,Schi2ophyllum,Collybia, Fusarium,Epidermophyton, Aspergillus, Peniciliium ) способность к образованию вторичных колоний выявлена у 7,6%. С наибольшей частотой на среде Ридер они формируются, начиная с 5-7 суток роста, у Fus.buibigenum var.biasticoia и Ep.rubrum. У этих грибов наблюдалось наибольшее разнообразие типов вторичных колоний.
Основываясь на результатах исследования вторичных колонии у актиномицетов (Никитина, 1975), мы предположили, что у грибов образование их является процессон, ход которого зависит от многих факторов (компоненты среды , рН, температура, аэрация и др.). Успехи, достигнутые в последние годы при изучении и оптимизации процессов, зависимых от большого числа факторов, стали возможными благодаря широкому внедрению математических методов планирования (Бирюков, 1968, 1971, 1982; Максимов, Федоров, 1969 и др.). Исследование значимости компонентов среды Ридер методом ортогональных латинских прямоугольников (Бирюков, 1968) для индукции и последующего роста вторичных колоний показало, что у Fus. buibigenum var.biasticoia вторичные колонии образовывались на семи из 32 испытанных сред (табл.5). В зависимости от концентрации компонентов в использованных средах варьировала частота образования вторичных колоний (от 0 до 99 на чашку Петри), их размеры (от ОД до 1,7 см в поперечнике), консистенция (от кожистой до мажущей). Наряду с ранее выявленными пятью типами вторичных колоний (Никитина и Калакуцкий, 1977) выявлен шестой тип, имеющий оранжевую пигментацию, но его встречаемость не была регулярной. Вторичные колонии I, Ш, ІУ и УІ типов состояли из Образование вторичных колоний у Ер.гиЪгшп наблюдалось только на одной из 32 сред (табл.5), частота их колебалась от 0 до 78 на чашку Петри. Изменений в размерах, консистенции и появления новых типов вторичных колоний не отмечено. Микроскопическое строение вторичных КОЛОНИЙ Ep.rubrum И Fus.bulbigenum var.blasicoia было подобным и соответствовало их описанию, сделанному ранее Е.Т.НЕКИТИНОЙ И Л.В.Калакуцким (1977). Как и у ранее исследованных актиномицетов, при моноспоровых посевах наблюдались значительные колебания в частоте образования вторичных КОЛОНИЙ на одной первичной (рис.2), состав использованных сред также оказывал влияние на этот показатель. В результате расчета эффектов ДЛЯ Fus bulbigenum var.blasticola установлено, что в среде Ридер нет компонентов, не имеющих значения для индукции вторичных колоний (табл.6). В результате проведенных расчетов ДЛЯ Fus.burbigenum var. "biasticoia составлена оптимальная среда, на которой вторичные колонии образуются в два раза чаще (128-144 на чашку Петри), чем на исходной среде Ридер (54-68). Сопоставляя состав исходной среды Ридер и оптимизированной (табл.7) можно объяснить отмеченный эффект как результат снижения в исходной среде концентрации
Как отмечено выше, все компоненты среды имеют значение в индукции вторичного роста. В среде № 3 и 25, хотя наиболее значимый компонент фруктоза находится на оптимальном уровне (1%), вторичные колонии не образуются (табл.5), так как содержание MgSO T O выше оптимального уровня. Концентрация NaCl в среде № 3 ниже, в среде № 25 выше оптимального уровня. Наибольшее количество вторичных колоний из 32 сред образовалось на среде 28 (табл.5) - 99 на чашку Петри, где концентрация компонентов близка к оптимизированной (табл.7). Уровень компонентов ,J Компоненты іРидер (Исходная! іОпти- {мизиро-j ваннаяf !Оптимизированная !с уменьшением ! cog. t/ среда 28 среда J I _ 1- 2 ! 3 4 5 Эффект пониженной концентрации Mg,вероятно, связан со снижением стабилизирующего влияния этого элемента на рибосомы (Величина и др., 1975). Значение повышенной концентрации Naci можно связать с ролью ионного гомеостаза клетки (Кафиани, Маленков, 1976). Следует отметить, что эффект пониженной концентрации MgSO . THgO и повышенной концентрации Naci проявляется только на фоне оптимальных концентраций наиболее значимых компонентов - фруктозы и СаСОд. Ингибирование вторичного роста в средах с СаСОд, видимо, связано с ролью кальция в репарационных системах клетки, а также его значением для проявления активности цАМФ (Васильев и др., 1975). На среде 28 эффект влияния фруктозы,MgS04 ТН О и NaCl снижается введением 0,05$ СаСОд. В этом случае, несмотря на увеличение на 0,1% источника азота, вторичных колоний образуется меньше, чем на оптимизированной среде, и сдерживается их последующий рост. В результате небольшого снижения в среде 10 по сравнению с оптимизированной концентрации фруктозы до 0,75% и до 0,3% уменьшилось количество вторичных колоний до самого низкого уровня (21 на чашку Петри). При уменьшении в оптимизированной среде (KH JgSC до 0,2% отмечено уменьшение количества (25-32 на чашку Петри) и увеличение радиального роста вторичных колоний (от 0,1 до 1,7 см в поперечнике) по сравнению с исходной средой. Оптимальная среда составлена и для Ep.rubrum, что позволило повысить частоту образования вторичных колоний (от 67 до 78 на чашку Петри) по сравнению с исходной средой Ридер (51-63 на чашку Петри). Этот эффект достигнут в результате увеличения концентрации NaCl до 0,45% и уменьшения (NH gSO до 0,25% по сравнению с исходной средой Ридер (табл.8).
