Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Роль фекальной бифидофлоры в организме человека (обзор литературы) 10
1.1 - Характеристика представителей рола Bifidobacterium кишечной микрофлоры человека 10
1.2. Взаимодействие бифидобактерий с факторами врождённого иммунитета и их влияние на метаболизм организма человека 19
1.3. Роль бифндофлоры в формировании микробиоценоза кишечника человека 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе... 39
2.2. Определение состояния микробиоценоза кишечника 39
2.3. Методы выделения и идентификации микроорганизмов 42
2.4. Методы изучения биологических свойств бактерий и грибов 44
2.4.1. Изучение антилизоцимтго? активности бифидобактерий 44
2.4.2. Определение антилактоферриновой активности бифидобактерий 46
2.4.3. Исследование анти им му но глобул и новой активности бифидобактерий 48
2.4.4. Изучение способности фекальной микрофлоры формировать биоплёнку 50
2.4.5. Определеїтие антагонистической активности бифидобактерий 51
2.5. Способ получения экзометаболитов микроорганизмов и клеточных экстрактов бактериальных культур 53
2.6. Методы изучения взаимного влияния бифидобактерий и микроорганизмов-симбионтов на их биологические свойства 53
2.7. Методы статистической обработки полученных результатов
ГЛАВА 3. Видовой состав и биологич бские свойства бифидоблктерий в норме и при дисбиозе кишечника человека 58
3.1. Частота встречаемости и видовой состав бифидобактерий гри различных состояниях микробиоценоза кишечника 58
3.2. Характеристика перенстетных свойств бифидофлоры в корме t! при дисбиозе кишечника человека 63
ГЛАВА 4. Антагонистическая активность бифидобактерий и её изменения при воздействии микроорганизмов-симбионтов 79
4.1. Антагонистическая активность Bifidobacterium sp. strain в зависимости от состояния микрофлоры кишечника человека ... 79
4.2. Изменение антагонистической активности бифидобактерий под действием компонентов ассоциативных микроорганизмов;... 86
ГЛАВА 5. Изменение биологических свойств микроорганизмов при взаимодействии бифидофлоры с условно-патогенными бактериями и грибами 94
5.1. Влияние экзомстаболитов бифидобактерий на аитилизо-иимную активность и интенсивность плёнкообразования условно-патогенной микрофлоры кишечника человека 94
5.2. Изменение антилизоцимной активности и интенсивности плёнкообразования бифидобактерий под действием метаболитов условно-патогенных бактерий и грибов 106
Заключение 116
Выводы 128
Список литературы 129
Приложение 149
- Характеристика представителей рола Bifidobacterium кишечной микрофлоры человека
- Определение состояния микробиоценоза кишечника
- Частота встречаемости и видовой состав бифидобактерий гри различных состояниях микробиоценоза кишечника
- Антагонистическая активность Bifidobacterium sp. strain в зависимости от состояния микрофлоры кишечника человека
Введение к работе
Актуальность проблемы
Основу нормальной микрофлсры пищеварительного тракта здорового человека составляют облнгатно-анаэробные микроорганизмы, доминирующими представителями которых являются бифидобактсрии (Гончарова ПК с соавт,, 1987; Hold G.L. el al, 2002; Reyed MR., 2007).
В настоящее время охарактеризованы таксономические, морфологические, физиологические особенности бифидобактсрии (Новик Г.И. с со-авт., 2005; Bezkorovainy A. et al., 1989; Asano Т, et al., 2005; Hadadji M. ct ah, 2005), а также изучены вопросы качественного и количественного со-става бифидобактерий кишечника з зависимости от возраста, характера питания, климатической зоны проживания человека (Шкопоров А,Н. с со-авт., 2006; Амерхановл A.M., 2009; Gavini F. et al., 2001; He F. et al., 2001), Определена роль бифидобактерий в реализации колонизационной резистентности толстого кишечника, описано их участие в различных метаболических процессах в организме человека (обмен витаминов, желчных кислот) (Шеидеров Б.А., 1996; Chei Вместе с тем, отсутствуют работы по комплексной оценке биологических свойств фекальной бифидофлоры в зависимости от вида бифидобактерий при различных состояниях микробиоценоза кишечника человека. Не выявлена роль и участие перси рентного потенциала, антагонистической активности и биопленкообразоішния микросимбиоитов (бифидофлоры и УПМ) в качестве одного из возможных механизмов формирования ассоциативно г х) симбиоза, так как в последнее время инфекция рассматривается в качестве модельной системы этого явления (Бухарин О.В. ссоавт., 2007). го- Указанные моменты и предопределили тематическую направленность наших исследований, которые могли бы способствовать раскрытию патогенетических механизмов межмикробных взаимоотношений нормоф-лоры с условно-патогенными микроорганизмами кишечника и изысканию новых подходов для дальнейшей работы по отбору эффективных пробно* тиков для коррекции дисбиоза кишечника. Цель н задачи исследовании Цель исследования - изучение видового состава и биологических свойств бифидобактсрий и их взаимодействия с микросимбионтами кишечной микрофлоры человека* Для реализации этой цели били поставлены и решены следующие задачи: Определить видовой состав и биологические свойства (ангилизо-цимную, ангилактоферриновую» ангииммуно глобули новую и биопленкообразующую активности) фекальной бифидофлоры в норме и при дисбиозе кишечника человека. Изучить антагонистическую аісгипность бифидобактерий при эу-биозе и дисбиозе кишечника человека и оценить влияние условно-патогенной микрофлоры на антагонизм представителей рода Bifidobacterium. Оценить в условиях in vitro взаимное влияние экзометаболитов бифидобактерий и микроорганизмов-симбионтов на их антилизоцимную активность и способность к образованию биопленок. « * Новизна исследования Выявлены различия в видовом составе бифидофлоры в зависимости состояния микробиоценоза кишечника человека. При эубиозс в 1 группе обследуемых лиц (дети до 1 года) превалировал вид В. bifidum, во Л группе (дети после 1 года и взрослые) - В. bifidum и В. longum. При дисбиозе очника отмечено увеличение видового состава бифидофлоры (6 видов) по сравнению с эубиозом (3-4 вида). В I группе при дисбиозе кишечника не удалось выявить доминирующий вид среди бифидобактернй, во II группе превалировал вид В. adolescentis. ._ Впервые выявлены распространённость и выраженность антдлакто-ферриновой активности и пленкообразующей способности культур Bifidobacterium sp. strain CS* которые, также как антнлизошшная активность, положительно коррелировали с показателем микробной обсеменён* ности бифидобактернй. Изучена пенетрантность и экспрессивность способности бифидобактернй ни активировать секреторный иммуноглобулин А, отрицательно коррелировавший с ПМО бифидобактернй. Определены отличия в распространенности и выраженности персистентных свойств (АЛА, АЛфА, AsIgA) и пленкообразования представителей рода Bifidobacterium в зависимости от вида бифидобактернй и состояния мнкробио-ценсза кишечника человека. При днзбиозе толстого кишечника у штаммов бифидобактернй отмечено снижение антнлизоцимиой, антилактоферриновой, плёнкообразующей активностей и усиление способности ннактивиро-вать секреторный иммуноглобулин А. Пенетрантность и экспрессивность антагонистической активности бифидобактернй варьировала у различных видов, и была выше у штаммов, изолированных при эубиозе, чем у ігультур, выделенных при дисбиозе кишечника человека. Способность бифидобактернй ингибировать рост УПМ снижалась в ряду В* longum > В, adoiescentis > В. bifidum. Установлено» что клеточные экстракты и экзометаболиты микроорганизмов-симбионтов изменяли антагонистическую активность представителей Bifidobacterium sp, strain CS. Влияние компонентов условно-патогенных микроорганизмов на антагонистическую активность бифидобактернй было различным: усиление антагонизма наблюдалось под действием экзометаболитов и клеточных экстрактов S, aureus, KL pneumoniae и , albicans; снижение антагонистической активности - при влиянии экзо* метаболитов Е< faecium и R coli. > Бифидобакгерии и условно-патогенные микроорганизмы изменяли антализоцимную активность и плёнкообразующую способность ао:оциан-тов лреимушесгвепно в двух направлениях. Синсргидиый тнп межмикробных взаимоотношений был характерен для ассоциации бифидобакгерии с инднгенными представителями микрофлоры толстого кишечника (Е. fae-cium и Е. colt 1ас+), где в 60-75 % случаев отмечена стимуляция как АЛА, так и ллёнкообразования у обоих ассоциантов. Антагонистический тип взаимоотношений нормофлоры (бифидобакгерии) имел место с траизитор-ными представителями УПМ (Е. coli lac-, Kl. pneumoniae, S. aureus, С albicans), у которых в 67 - 89 % отмечено взаимное снижение антилизоцимной активности и плёнкообразования микросимбионтов. ая значим Практическая значимость Полученные в работе данные расширяют теоретические представления о роли видового состава и биологических свойств бифидобакгерии в формировании ассоциативного симбиоза в условиях микробиоценоза кишечника человека» ... ;нно Выявленные особенности реіулирующего воздействия анаэробных микроорганизмов (бифидобакгерии) на факторы персистенции условно-патогенной микрофлоры могут быть использованы в качестве дополнительных критериев отбора эффективных пробиотиков с целью коррекции дисбиоза кишечника. Способность клеточных экстрактов и экзометаболи- гов условно-патогенной флоры стимулировать антагонистическую активность бифидобактерий открывает перспективу для создания синбиотиков. Предложенные методические подходы по изучению межмикробных имодействий могут быть рекомендованы для работ микроэкологнческо-профиля, а также для использования в учебно-педагогическом процессе «Роль фекальной бифидофлоры в организме человека»). Положення, выносимые на защиту: Бифидобактерии, изолированные из кишечной микробиоты, имеют различия в видовом составе и экспрессивности факторов персистенции, антагонистической активности и биоплёнкообразования, зависящие от состояния микробноценоза кишечника обследуемых лиц. Метаболиты и клеточные экстракты микроорганизмов-симбионтов изменяют их биологические свойства, определяя межмикробные взаимоотношения бифидофлоры и УПМ в условиях ассоциативного симбиоза кишечника человека. Апробации работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на: -1 Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009); - V, VI Всероссийских конференциях «Персистснция микроорганизмов)* (Оренбург, 2006,2009). Публикации По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 3 статьи п журналах, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертационной работы Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 100 отечественных и 120 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 9 таблицами и 33 рисунками. Тема диссертации включена в план НИР Оренбургской государственной медицинской академии (№ гос, регистрации 196-00)* ^ [О У детей, получающих с первых дней жизни естественное вскармливание, в бифндофлоре кишечника преобладают виды В. bifidum и Б. infanis, характеризующиеся узким спехтром ферментативной активности, а именно преимущественным расщеплением лактозы, что соответствует составу постоянно поступающего в пищеварительный тракт субстрата в виде грудного молока. У детей старше 3 лет и взрослых людей доминирующими видами бифидобактерий являются В, longum и В, adolescentis, которые обнаруживаются с частотой 75 % и 56.2 % соответственно, выделение вида В, bifidum снижается до 18,7 %. У здоровых доношенных детей при искусственном вскармливании с наибольшей частотой выделяются бифидобактерий вида В- adolescentis (47,8 %), которым уступают виды В. longum (34,8 %) и В. bifidum (30,4 %) (Гончарова Г.И, 1970, 1982, 1987). Исследования, проведённые в последнее десятилетие, благодаря открытию высокочувствительных молекулярно-биологических методов (ПЦР с видоспецифичными праймерами, амплифииирующие области генов 16S рибосомальной РНК, генотипированис на основе двухлокусного секвенирования) существенно расширили знания в области видового разнообразия бифидобактерий (Бондаренко В.М., 2006; Субботина М.Е., 2006; Шкопоров А,Н, с соавт., 2006)- Анализ содержания бифидобактерий кишечной микрофлоры у лиц трёх возрастных групп (3-15, 30-46, 69-89) показал, что бактерии видов В. adolescentis и В. dentium наиболее часто изолировали из фекалий пожилых людей, а В- pseudocatenulatum - из кишеч-никадетей (Gavini F. et al., 2001). В работах Rcuter G- отмечено, что доминирующими видами бифидобактерий кишечной микробиоты у детей были В. bifidum, В. infantis, В. breve, В. parvulorum, у взрослых - В- bifidum, В. longum и В. adolescentis (Reu;er G., 2001). При сравнении фекальной бифидофлоры, выделенной у оровых взрослых (30-40 лет) и пожилых (70 лет и старше) людей, было становлено, что у взрослых лип выделяются представители видов В. adolesccntis, B. breve, B. infanlis и В. longum, а у пожилых лиц - В. adolescentis и В. longum (Не F. et aL, 2001). Ученые из Финляндии при анализе видово-го состава бифидобактерий кишечной микрофлоры старых людей (84±8 лет) установили, что чаще регистрировались виды: В, animalis (67,8 %), В. breve (44 %), В. bifidum (42,4 %) и В. adolescenlis (33,9 %) (Lahtinen SJ. аЦ 2009)- М ± Результаты же, полученные японскими исследователями, показали, что у взрослых в пробах наиболее часто регистрировались В. catcnulatum (92 %) затем В, longum и В. adolescentis, в то время как у грудных младенцев В. breve, В. infanlis и В. longum (Matsuki Т. et al,, 1999; Ventura M. el al., 2008), Однако, в более ранних работах японских учёных, отмечалось, что у детей до 1 года в микробиоценозе кишечника доминировали виды -В. breve, В, adolescentis и В, longum, а у детей старшего возраста и взрослых - В. longum и В. adolescentis (Benno Y., 1995), По мнению Постниковой Е.А. с соавторами, превалирующим: видами бифидобактерий кишечной микробиотм у клинически здоровых детей первого года жизни являются В- longum, В, adolescentis и В. infantis (2004). Выявлено доминирование вида В. ruminantium в составе фекальной бифидофлоры детей, принимающих синбиотнки. Ранее этот вид свяшвали только с пищеварительным трактом животных (Субботина М.Е,, 2009). При исследовании бифидофлоры детей грудного возраста в развитых странах мира не было зафиксировано выделения вида В. infantis- В го время как у детей республики Гана данный вид присутствовал у обследованных младенцев в 72 % случаев (Young SX. et al., 2004). __ В работах Collado М.С. с соапт. (2008) было отмечено, что состав фекальной бифидофлоры у детей в норме и при патологических процессах в стензее кишечника (целнакии) имеет отличия. У детей при целиакии наблюдалось снижение общего количества бифидобактерий и видовал перестройка в составе бифидофлоры кишечника человека при различных форрегистрмах заболевания. Виды В. longum, В. breve и В. bifidum в микробиоценозе кишечника у таких больных встречались реже» однако чаще регистрировались виды В. adolcscentis и В. catenu.atum. Морфологические особенности бифидобактернГі Бнфидобактерии - грамположительные полиморфные палочки» 0,5 -1,3 1,5-8 мкм, обычно несколько изогнутые, булавовидные и часто разветвлённые. На искусственных питательных средах популяции бифидо-бактзрий демонстрируют высокоорганизованное, мнцелеоподобное развитие (Новик Г.И. с соавт,, 1995). Для бнфидобактерии характерно вегетативное размножение, при котором наблюдается последовательная транс-формация «транзиторных» - палочковидных и кокковидных форм в дихо-томшески ветвящиеся мультисептированные филаменты, которые при определенных условиях подвержены фрагментации с образованием дифференцированных репродуктивных ферм (Новик ПИ.» 1998). Морфологическая дифференциация клеток бифидэбактерий в цикле развития популяций коррелирует с изменениями ультраструктуры клеток. Также для бнфидобактерии характерно наличие морфологически разнообразных межклеточных контактов, которые образуется за счет слияния клеточных стенок, капсул, гликокаликса, экстрацеллюлярных и тяжистых и глобулярных структур. Наличие межклеточных контактов (когезии) обеспечивает в условиях адаптации к факторам внешней среды стабильность микробных консорциумов Установлено, что бактсриоцииы бифидобактерий способны ровагь рост широкого спектра бактерий: энтеропатогенных Е. colit S. thy-phimurium» С. pcrfringens, V. cholerac, L, monocytogenes, В, fragilis» представителей рода Enterococcus, Lactobacillus» Campilobacter, Sh. llexneri, B. cereus, Kb pneumoniae, S. aureus (Gibson G.R. et al., 1994; Lievin V. et al.8 2000)- У представителей рода Bifidobacterium описаны бактериоцші подобные вещества, обладающие нигибирующей активностью в отношении широкого спектра і рам положительных и грамотрицательных бактерий (Cheikhyoussef A. et al., 2009)- Кроме того, бактериоцин подобные вещества бифидобактерий способны сдерживать рост Н. pylori (Collado М.С. et al., 2005; Shah HP., 2007), бактериальное звено язвенных процессов в желудочно-кишечном тракте. У предстазителей нормофлоры рода Bifidobacterium описано суперсемейство ЛСМ - лектины симбиотических микроорганизмов. В его состав включены непилиновые легко десорбирусмые асси-метричные белки клеточной поверхности с молекулярной массой 50-80 кДа. В этих белках обнаруживаются ионы металлов (Са, Mg и др.), глико-заминогликаны, другие составляющие. Эти лектины обладают антигенной специфичностью к гликомерам и слабой геммаглютинируюшей активностью, им присущь селективный антагонизм против бактерий и грибов (Лахгин И.М с соавт., 2009). Кроме того, прямой антагонизм бифидобактерий реализуется за счет выработки биологически активного фермента лизоцима, который в экологических условиях кишечника принимает участие в защите слизистых оболочек от условно-патогенных микроорганизмов (Онищенко Г.Г. с со-., 2002). Лизоцим играет важную роль в механизме антимикробного действия молочнокислых микроорганизмов (Ленцнер А.А. с соавт,, 1975)-В опытах in vitro продемонстрировано, что супернатанты бифидобактерий ладают энзимагической активностью и оказывают ингибируюшее дей-ствиг на KJ. pneumoniae, S. aureus» Е- coll, S. ihyphimurium, L. monocyte genes, Sh. flexncn, B. ccreus (Servm A.L., 2004), Независимыми от кислотности факторами антимикробной защиты могу быть перекись водорода, продуцируемые представителями нормоф-лоры. Доказано, что пероксндазной активностью обладают не только лак-тобациллы, но и бифидобактерий. Способность бифидобактерий к редукции НАД-оксидазы сочетается с продукцией перекиси водорода и корре-лир ет с аэротолерантностью (Shimamura S., 1992). К опосредованным механизмам антагонистической активности мож но отнести способность бифидобактерий к стимуляции факторов естест венной резистентности - фагоцитоза, секреторного IgA и интерлейкинов (ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-6, TNF-a), описанных в предыдущем разделе. В настоя щее время отмечают связь антагонистической активности бифидобактерий к широкому спектру условно-патогенным микроорганизмам с выраженной индукцией интерлейкинов (ИЛ 10, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-a) (Timmerman КМ. etaU2007). _ Представители рода Bifidobacterium способны снижать адгезию Е, faecium, KI. pneumoniae и S. aureus к поверхности энтероцитов, что мо жег ВЛИЯТЬ на колонизацию УПМ толстого кишечника (Коршунов В.М- с соавг., 1999; Пикипа АЛХ с соавт., 1999; Постникова Е.А. с соавт., 2004; Nardi R.D. et ah, 1999; Reyed M.R, 2007; Timmerman ELM. et alt 2007; Cheiihyousscfa A. et ah, 2009). В ряде работ также отмечалась влияние бифидобактерий на адгезию к клеткам кишечника и рост С. difficile L. lactis и S ihermophilus за счет действия сидерофоров. Представители бифидоф-лоры способны коагрегировать патогенны такие, как S. aureus, P. vulgatus, С. histolylicum, мешая их адгезии и проникновению в энтероциты макроорганизма (Collado М.С. et aU 2007). Бифидобактерий могут конкурировать с УПМ и патогенами за нут-риенты (наличие лактоферринсвязывающих рецепторов на поверхности клеток, сидерофоры) и за сайты адгезии (способность формировать биоплёнки на поверхности энтероцитов) (Cheikhyoussefa A. et al, 2008), Установлено, что представители бифидофлоры кишечника снижают персистентиые свойства патогенов и условно-патогенных микроорганизмов. Экзометаболиты бифидобактерий снижали антилизоцимную и анти-комплементарную активности дрожжевых фибов (Перунова Н.Б., 2003) и АЛА энтеропатоЕ енных Е. coli и Kl. pneumoniae (Елагина Н.Н,. 2001). Данные механизмы взаимодействия бифидобактерий и условно-патогенных микроорганизмов (патогенов) можно рассматривать как опосредованный антагонизм, позволяющий регулировать состояние микробного биоценоза при ассоциативном симбиозе. Представляют интерес данные о стимулирующем влиянии бифидобактерий на ассоциативную симбиотическую микрофлору. Известно, что молочная кислота, образуемая бифидобактериями, используется пропио-нибактериями с образованием пропионовой и уксусной кислот, обладающих высокой антимикробной активностью (Kancko I. et al., 1994). Вейло-нелк, утилизируя молочную кислоту и регулируя ее пул в кишечнике, продуцируют метаболиты, необходимые для жизнедеятельности других анаэробов иидигенной микрофлоры кишечника, а также аэробов и факультативных анаэробов. В тоже время установлено, что метаболиты бифидобактерий увеличивают антилизоцимную активность лактозопозитивных Е. coli (Елагина Н.Н., 2001). Установлено» что ВИДОВОЙ состав бифидофлоры человека неодинаков и претерпевает изменения. Данное явление связывают с таким процессом, как аутогенная сукцессия — закономерная смена биоценозов в определённой экологической нише (Рыбальчинко О.В., 2008; Ventura М,, 2008). Что касается микроэкологии организма человека» данная закономерпоегь прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза» совпадающего критическими периодами развития в различном возрасте: становление иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, смена пищевого рациона, географические и экологические факторы (Ефимов Б.А., 1996; Коршунов В.М., 2001; Крамарь Л.В.. 2001). Важно отметить при этом, что вмешательство неблагоприятных внешних факторов, таких как эндогенные инфекции, неблагоприятная экология и другае, может нарушить естественный ход развития микробиоценоза (Воронина O.JU 2008; Амерханова А.М., 2009; Young Sl.f 2004). По данным литературы видовой состав бифидофлоры кишечника варьирует в зависимости от возраста, характера питания и ряда экологических и географических факторов, В настоящее время в отношении состава фекгльной бифидофлоры нет единого мнения относительно доминирования определённых видов, определяющих стабильность микробиоценоза кишечника- Учитывая это, нам представилось целесообразным изучить видовой состав бифидобактериЙ людей различного возраста при эубиозе и исбиозе кишечника. Деление обследуемых лиц на возрастные группы для оценки состояния микрофлоры пооводили в соответствии с приказом Минздрава РФ № 231 "Об утверждении отраслевого стандарта "Протокол ведения больных, Дисбаїстериоз кишечника". Согласно приказа все обследуемые лица были разделены на 2 основные группы: I группа — дети до 1 года, II группа - дети от I года и взрослые. При бактериологическом обследовании на дисбиоз кишечника было выделено 97 штаммов из фекалий 120 людей, из них 47 штаммов были выделены в первой возрастной группе (до 1 года), 50 штаммов - во второй возрастной группе (1-60 лет). При эубиозс толстого кишечника показатель микробной обсеменён-ности (ПМО) бифидобактерий у дегей первого года жизни в среднем составлял !0,6±0,1 Ig КОЕ/г, в то время как у детей после 1 года и взрослых значения данного показателя соответствовали 9+0,05 ig КОЕ/г. В I возрастной группе IIMO у различных видов бифидобактерий был равен И±0,03 !g КОЕ/г у В. infantis, 10 0,26 Ig КОЕ/г у В. bifidum и 10,6±0,1 Ig КОЕ/г у В. breve. Во II возрастной группе показатель микробной обсеме-нёниости у изолированных видов бифидобактерий не различался и составлял у В. longum 9±0,14 Ig КОЕ/г, у В. bifidum 9±0,14 Ig КОЕ/г, у В. ado Icsccntis 9±0,05 Ig КОЕ/г и у В. breve 9,5±0,2 lg КОЕ/г. При дисбиозе кишечника ПМЭ у детей до 1 года в среднем был равен 8,05±0,1 Ig КОЕ/г, в то время как у детей после 1 года и взрослых значения данного показателя составляли до 7,4±0,05 lg КОЕ/г. В I группе ПМО составлял в среднем у В. breve 8,6±0,4 lg КОЕ/г, у В. infantis - 8,410,3 lg КОЕ/г, у В. animalis - 8,3±0,4 \g КОЕ/г, у В. adolescentis - 8 0,36 lg KOfc/г, у В. longum и В. bifidum - 7,5±0,4 Ig КОЕ/г. Численность бифидо бактерий в кишечной микробиогс во П возрастной группе была у В. longum 7,6±0,24 lg КОЕ/г, у В, bifidum - 7,25±0,1б Ig КОЕ/г, у В- adolescentis - 7,17±0,24 lg КОЕ/г и у В, animalis - 7,3±0,21 lg КОЕ/г, у В. dentium -8±0,05 lg КОЕ/г и у В. pseudolongum - 7±0,05 lg КОЕ/г. При анализе видового состава бифидофлоры (рис. !) при эубиозе кишечника оказалось, что у детей первого года жизни штаммы принадлежали к трем видам: 6. bifidum, В. infantis и В. breve, в то время как бифи-дофлора у обследуеї сьїх лиц в возрасте от 1 года до 60 лет характеризовалась присутствием четырёх видов: 3, longum, В. bifidum, В. adolescentis и В. breve. Наиболее часто при эубиозе кишечника п I группе встречались бифидобактерии, относящиеся к вицам В. bifidum (в 50 % случаев) и, почти в 2 раза реже, В. breve (29 %) и В infantis (21 %). Во II группе среди видов бифидобактерии доминировали штаммы В. longum (в 41 % случаев) и В, bifidum (в 32 % случаев), а В. adolescentis (в 18 % случаев) и В, breve (в 9 случаев) встречались реже. При дисбиозс кишечника (рис.2) видовой состав представителей рода Bifidobacterium был более разнообразен, чем при эубиозе, У детей до 1 года видовой состав бифидофлоры был представлен видами: В. adolescentis, В. animalis, В. longum, В- bifidum, В. infantis и В. breve, а у лиц от 1 года до 60 лет - В adolescentis, В. longum, В. bifidum, В. animalis, В, dentium и В pseudolongum. Все изолированные виды бифидобактерий у обследуемых лиц і группы встречались примерно с одинаковой частотой На долю В. bifidum приходилось 21% штаммов, на долю В. adolescentis и В. breve - по 18 % культур» на долю изоля ов В. infantis и В. longum - по 15 % штаммов, В- animalis регистрировался в 13 % случаев. Среди бифидобактерий выделенных у лиц II группы наблюдалось доминирование вида В. adolescentis, который был выявлен в 44 % случаев. Другие виды бифидофлоры, как В. longum и В. bifidum регистрировались в 15 % случаев, В. animalis и В. dentium - в 11 % случаев и В. pscudolongum - в 4 % случаев. Бнфидобактериям принадлежит значительная роль в формировании ассоциативного симбиоза и регуляции межмикробных взаимоотношений. Защитные функции бифидофлора выполняет за счет прямого и опосредованного антагонизма в отношении условно-патогенных бактерий, предотвращая колонизацию патогенами кишечного биотопа и препятствуя их проникновенно во внутреннюю среду организма (Makras L. et al., 2006; Cheikhyous-ref A. et al., 2008), В литературе имеются данные по антагонистической активности бифидобактерий в зависимости от их видовой принадлежности (Gibson G.R. et al., 1994; Lievin V, el al., 2000), но от микроэкологического состояния биотопа, из которого культуры были изолированы, отсутствуют. В связи с этим, мы изучили антагонистическую активность бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе кишечника человека. Антагонистическая активность (АА) микрофлоры кишечника оценивали с использованием коэффициента подавления (КП), представляющий собой отношение диаметра зоны задержки роста индикаторной культуры к диаметру колонии штамма антагониста (БД). В работе использованы 74 штамма бифидобактерий и 48 штаммов условно-патогенных микроорганизмов и дрожжевых грибов (Е. coli 1ас+, Е. coli lac -, К1. pneumoniae, М. morganii, Е. cloacae, S. aureus, Е. faccium и С- albicans), выделенных из фекалий пациентов с дисбиозом кишечника I - III степени (46 человек) и условно здоровых лиц (28 человек). У доминирующих видов бифидобактерий (В. bifidum - 26 штаммов, В, lorigum - 27 культур, В, adolescer.tis - 21 изолят) в исследуемых группах была определена способность ингибировать рост ассоциативной кишечной микрофлоры человека. Оказалось» что большинство исследуемых штаммов бифндобактерий {33-93 %) обладали антагонистической активно-стыс (ЛА) по отношению к представителям условно-патогенной микрофлоры (УПМ) кишечника, за исключением дрожжевых грибов. Отсутствие бифидобакгерий к микромицетам возможно объясняется наличием другах механизмов межмикробных взаимоотношений, к примеру, сниже нием персистентных свойств грибов под действием бифидофлоры (Перу нова Н.Б.» 2003). Как видно из таблицы 8, распространённость и выраженность антагонистической активности бифидобактсриЙ, наряду с факторами перси-стенции, варьировала в зависимости от микроэкологического состояния биотопа толстого кишечника, У культур бифидобакгерий, выделенных при эубиозе кишечника, способность ингибировать УПМ регистрировалась в 74,5=2 % случаев, при I степени дисбиоза - в 67,2±2,4 % случаев, при II- III степени дисбиоза - 57±2 2 % случаев (р 0,05). Антагонистическая активность исследуемых культур различалась в зависимости от их вида и снижалась в ряду В. longum В. bifidutr. В. adolescentis. Представители В. bifidum и В. longum при эубиозе чаще ингибиро-валирост грам негативной микрофлоры (в 80,б±4,4 % и в 82±1,9 % случаев соответственно), чем грампозитивной кокковой флоре (в 68±4,9 % и в 68,3=6,1 % случаев соответственно) Штаммы В adolescentis былиодина-активиы и в отношении энтеробактерий (66,7±0,01 %), и в отноше нии грамположитепьной кокковой микрофлоры (63,7±0,01 %). При дисбиозс бифидобакгерий были одинаково активны как в отношении грам положительных кокксв, так и в отношении энтеробасгерий. При дисбиозе I степени антагонистическая активность встречалась у В. bifidum в 68,3±6,1 % случаев, у B.longum в 68,1 3 % случаев, у В, adolescents в 65,3 4 % случаев, а при II - III степени дисбиоза - в 53,6+3 % случаев, 59,4±2,9 % случаев и 57,8±3 % случаев соответственно. Выраженность антагонистической активности бифидофлоры в отношении УПМ фекальной микрофлоры также различалась в зависимости от микроэкологического состояния кишечника человека. Среднее значение коэффициента подавления условно-патогенных микроорганизмов для штаммов бифидобактерий, выделенных при эубиозе, составляло 5 8±0,5 ед., при дисбиозе кишечника 1 степени 6,4±0,5 ед. У культур би-фидобактерий, изолированных при глубоких нарушениях в кишечном биотопе (дисбиоз 11 111 степени) значения АА имели более низкие значения (КП 3,9±0,3 ед,, р 0,05), чем у штаммов, выделенных при эубиозе и дисбиозе I степени. флоры (КП 7,6 0,9 ед и 3,7±0,5 ед, соответственно), чем в отношении грампозитипных кокков (КП 4,8±0Л ед. и 2,5±0,05 сд. соответственно).Характеристика представителей рола Bifidobacterium кишечной микрофлоры человека
Определение состояния микробиоценоза кишечника
Частота встречаемости и видовой состав бифидобактерий гри различных состояниях микробиоценоза кишечника
Антагонистическая активность Bifidobacterium sp. strain в зависимости от состояния микрофлоры кишечника человека
Похожие диссертации на Биологические особенности бифидобактерий и их взаимодействие с микросимбионтами кишечной микрофлоры человека
